СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ОСНОВЫ ДЛЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 1994 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к общей и медицинской микробиологии, а именно получению питательной среды для выращивания микроорганизмов. Оно может быть использовано в научно-исследовательской и практической работе как для выделения и культивирования микроорганизмов, так и для накопления их биомассы в крупнотоннажных промышленных масштабах.

Выделение микроорганизмов из объектов среды, получение их биомассы осуществляют на питательных средах. В зависимости от происхождения среды подразделяют на сложные непостоянного состава - мясопептонный бульон (МПБ), картофельная среда и др. и синтетические среды постоянного состава, питательные компоненты которых вводятся в определенную среду строго по прописи (Дж. Мейнел, Э.Мейнел, 1967).

Сложные среды непостоянного состава более полно по сравнению с искусственными удовлетворяют трофическим потребностям растущих микроорганизмов, т. к. они содержат практически все необходимые для клеток вещества (белки, аминокислоты, нуклеиновые кислоты, минеральные компоненты и т.п.), находящиеся в легкодоступной форме. Именно на таких средах растут условно-патогенные и патогенные микроорганизмы, обусловливающие инфекционно-воспалительные процессы различной локализации у человека и животных. К таким средам прежде всего относится мясопептонный бульон, который готовится прибавлением к мясной воде 1% пептона и 0,5% хлористого натрия с последующим кипячением 20 мин при помешивании. рН среды устанавливают добавлением щелочи (10% -ный раствор едкого натра) до 7,6-7,8. Для стабилизации рН рекомендуют добавлять к бульону фосфатные буферные смеси с последующим кипячением среды 35-45 мин до выделения осадка. Затем среду фильтруют, доливают водой до первоначального объема и стерилизуют в автоклаве при 120^оС (1 атм) в течение 15-20 мин. На основе МПБ готовится ряд сред специального назначения. Мясная вода готовится из дорогостоящего дефицитного пищевого сырья - обезжиренной высокосортной телятины или говядины. (Пяткин К.Д. и соавт. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии. М.; Медицина, 1969, с. 62)
В силу этого среды, приготовленные на основе МПБ как правило дефицитны даже для лабораторных исследований. Практически нереально применять эти среды для получения микробной биомассы в крупнотоннажном процессе. Помимо МБП в медицинской микробиологии используют питательные среды, основой которых является триптический перевар или настой бычьих сердец (Скрипаль И.Г., Малиновская Л. П. , 1984). Обогащенные добавками (лошадиной сывороткой и дрожжевым экстратом) эти среды используют для выделения микоплазм, уреаплазм Л-форм бактерий - микроорганизмов, вызывающих заболевания человека и животных и не растущих на каких-либо других питательных средах.

Описаны способы приготовления питательной среды из свежей плаценты (Отраслевое рационализаторское предложение N 423 от 11 мая 1986 г. "Питательная среда для выделения и культивирования урогенитальных уреаплазм"). Несмотря на высокую чувствительность питательной среды, вряд ли она может найти широкое внедрение, т.к. плацента - ценное сырье для косметической промышленности.

Известны способы получения питательных сред, близких по качеству к МПБ, но получаемых из дешевых субстратов. Так, для производства биомассы сапрофитного микроорганизма Вас. subticis получают питательную среду на основе сусла, а также среду, содержащую минеральную основу и органические источники питания, из гидролизата вермикулитовой подстилки, применяемой на птицефабриках (авт.св. 1124029). Однако в настоящее время птицефабрики отказались от применения вермикулитовых подстилок, применяя более прогрессивный способ содержания птиц в клетках, исключающий использование каких-либо подстилок, а среда на основе сусла бедна на питательные элементы для многих групп микроорганизмов.

Наиболее близкой к изобретению по технической сущности является питательная среда на основе помета птиц, которая подвергается анаэробной бактериальной ферментации с доведением количества аммиака в ней как источника азота до 0,4-2,2%. Приготовленная таким образом питательная среда использовалась для культивирования дрожжей. (Дик Питер Хенри, Патент Австралии N 75824 СО 767/00 А 23,1/18, А 23 К 1/00, 1976). В известном решении среда избрана в качестве прототипа как наиболее близкая по сущности к заявляемому объекту.

Недостатком этой питательной среды является то, что в среде на основе помета птиц в достаточном количестве присутствуют только жирные кислоты (уксусная, пропионовая, масляная, валериановая) и в недостаточном количестве для выделения и культивирования многих групп микроорганизмов присутствуют белки, аминокислоты, витамины. Это существенно снижает возможности использования данной среды для выделения и культивирования разных групп микроорганизмов.

Цель изобретения - повышение эффективности питательной среды путем повышения ее чувствительности, позволяющей выделять и выращивать на ней микроорганизмы различного таксономического положения, которая стимулирует рост и повышает их жизнеспособность, а также получать в промышленных масштабах биомассу микробных культур при значительном снижении ее себестоимости.

Цель достигается тем, что в качестве исходного питательного сырья используют помет домашней птицы после следующей обработки: помет соединяют с водой при содержании 50-100 г его в 1 л воды. Полученную смесь подвергают аэробному брожению при 28-40^оС в течение 48 ч, а затем подвергают анаэробному сбраживанию при 60^оС в метантенке. Время анаэробного сбраживания 3-5 сут. Твердую часть среды отделяют центрифугированием, жидкую фракцию разливали в стеклянную посуду и стерилизуют 30 мин при 0,5 атм. Разлитая и простерилизованная жидкая фракция являлась питательной средой для выделения и культивирования микроорганизмов различных таксономических групп, в том числе микоплазм, уреплазм, Л-форм бактерий. С целью получения твердой питательной среды к жидкой фракции добавляют агар, причем концентрации этого желирующего реагента могут быть ниже применяемых для изготовления МПА. Например, если для создания твердой среды на основе МПБ необходимо добавить 2 г/л агар-агара, то аналогичное по плотности желирование на основе предлагаемой питательной основы осуществляется при добавлении на 1 л 1,3-1,5 г/л агара. Химический состав предложенной универсальной питательной среды приведен в табл. 1. Для сравнения приведен состав компонентов среды на основе среды, полученной при анаэробном сбраживании помета (среда по прототипу), и предлагаемой универсальной питательной среды.

Анализ данных табл.1 свидетельствует о том, что разработанная универсальная питательная среда является обогащенной, ценными питательными элементами (витаминами, аминокислотами и другими) для микроорганизмов.

П р и м е р 1. Для получения среды с концентрацией компонентов, лимитирующих рост микробных культур, в колбу с 1 л водопроводной воды вносили 50 г исходного помета с влажностью 70%. Содержимое колбы тщательно перемешивали и подвергали анаэробному сбраживанию при 30^оС в течение 48 ч на качалках (160 об/мин). Затем содержимое колбы продували 5 мин инертным газом (аргоном) и в колбу вносили термофильную анаэробную метаногенную ассоциацию (100 мл инокумма на 1 л среды), после чего проводили анаэробное сбраживание помета при 60^оС в термостате. Время анаэробного сбраживания составляло 30 сут. Затем твердую часть отделяли центрифугированием, жидкую фракцию разливали в посуду и стерилизовали 30 мин при 0,5 атм. На полученной таким образом питательной среде культивировали различные виды микроорганизмов. Накопление их биомассы на этой среде представлено в табл.2.

П р и м е р 2. Для получения среды с концентрацией компонентов среды, обеспечивающих оптимальный рост микробных культур, в колбу с 1 л водопроводной воды вносили 75 г исходного помета с влажностью 70%. Последующие операции по получению питательной среды проводили аналогично примеру 1. Накопление биомассы различных микробных культур на приготовленной среде представлено в табл.2.

П р и м е р 3. Для получения среды с максимально допустимой концентрацией компонентов среды в колбу с 1 л водопроводной воды вносили 100 г исходного помета с влажностью 70%. Последующие операции по получению питательной среды проводили аналогично примеру 1. Накопление биомассы различных микробных культур на приготовленной среде представлено в табл.2.

П р и м е р 4. Для получения среды с ингибирующими концентрациями компонентов среды в колбу с 1 л водопроводной воды вносили 100 г исходного помета с влажностью 70% . Последующие операции по получению питательной среды проводили аналогично примеру 1. Накопление биомассы различных микробных культур на приготовленной среде представлено в табл.2.

Следовательно, как видно из табл.2, можно заключить, что минимально допустимая концентрация помета для приготовления среды 50 г/л воды. Значения менее 50 г/л воды будут лимитирующими. Оптимальная концентрация помета для приготовления питательной среды 75 г/л воды. Максимально допустимая 100 г/л воды.

Как ранее было показано, разработанная основа питательной среды является обогащенной ценными питательными элементами для микроорганизмов (табл. 1).

В подтверждение вышесказанного приводятся данные по накоплению биомассы различных микроорганизмов на основе из помета по прототипу и заявляемой питательной среде (табл.3, 4).

Практически все изученные культуры в течение 48 ч роста накапливали до 1 г и более клеточной биомассы. Наращивание биомассы проводили в 0,5 литровых колбах на качалках (160 об/мин) при температуре 28-30^оС, а также в условиях непрерывного культивирования в ферментерах типа АНКУМ-2 и АК-10. Как видно из данных, представленных в табл.2 и 3, на разработанной питательной среде отмечен наиболее активный рост как условно-патогенных микроорганизмов, так и сапрофитных, получаемых в промышленном масштабе. Достигнутый эффект объясняется наличием в предлагаемой питательной среде значительного количества витаминов, микроэлеметов, аминокислот и других ростовых факторов. Все выросшие на предлагаемой среде культуры микроорганизмов были морфологически идентичны исходным культурам и не имели каких-либо различий при идентификации по биохимическим свойствам.

На полученной среде можно выделять также микроорганизмы, не имеющие стабильной клеточной стенки микоплазмы, уреаплазмы, что позволяет применять ее для диагностики воспалительных заболеваний, микробного происхождения, человека и животных. При выделении микоплазм для подавления сопутствующей микрофлоры использовали ацетат калия, пенициллин, а в качестве индикатора фенолрот.

Таким образом, получена из отходов птицефабрик (помет домашней птицы) жидкая фракция, которую после комбинированной обработки путем аэробного и анаэробного сбраживания, можно использовать как органоминеральную питательную среду для выращивания микроорганизмов различных таксономических групп.

Использование этого сырья для получения питательной среды с целью организации крупнотоннажного наращивания практически ценных микробных культур позволяет организовать безотходное производство птиц и животных, значительно улучшить экологическую обстановку на животноводческих комплексах и осуществить экономию ценного и дорогостоящего пищевого сырья - мяса крупного рогатого скота.

Использование: общая и медицинская микробиология. Сущность изобретения: в основе питательной среды использована жидкая фракция птичьего помета, предварительно и последовательно подвергнутого аэробной обработке. Полученная питательная основа имеет строго определенные соотношения углерода, азота, белка, углеводов, витаминов, аминокислот. Первоначально помет и вода использованы в соотношении 50 - 100 г на 1 л воды, pH 6,9 - 7,1. Среда позволяет выделять и выращивать на ней различные микроорганизмы. 4 табл.

СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ОСНОВЫ ДЛЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ, включающий анаэробную ферментацию куриного помета, разбавленного водой, отличающийся тем, что используют куриный помет, разбавленный водой в соотношении 50 - 100 г на 1 л воды, перед анаэробной ферментацией осуществляют аэробную ферментацию при 28 - 40^oС в течение 48 ч, а анаэробную ферментацию осуществляют при 60^oС в течение 3 - 5 сут с последующим центрифугированием, отделением надосадочной фракции и ее стерилизацией.