СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ ИЗ ПОБОЧНЫХ ПРОДУКТОВ ПРОИЗВОДСТВА КРАХМАЛА ПРИ ПЕРЕРАБОТКЕ ЗЕРНА ПШЕНИЦЫ Российский патент 2024 года по МПК C12P7/56 

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности.

Все известные способы получения молочной кислоты можно разделить на химические и микробиологические. При производстве молочной кислоты путем микробиологического синтеза наиболее перспективно использовать недорогой источник углеводов, например, возобновляемое растительное сырье. К таким источникам углеводов относятся очищенный свекловичный сахар, тростниковый сахар, различные виды крахмалов и их производные, такие как рафинированные сиропы глюкозы. Они могут быть неочищенными растительными экстрактами или побочными продуктами сельскохозяйственной промышленности, такими как крахмальный сироп, патока, сыворотка и др.).

Известен способ получения молочной кислоты с чистотой 90-92%, где для процесса ферментации в качестве основных источников углерода и азота используют глюкозу (18-20%), полученную из крахмала сладкого картофеля, гидролизат белка, и микробный консорциум кислотоустойчивых культур Lactobacillus plantarum и Lactobacillus delbrueckii (патент № EP3918084). Недостатком данного способа является низкая чистота конечного продукта, где помимо молочной кислоты образуются доли пропионовой и уксусной кислоты.

Известен способ получения молочной кислоты на основе микробиологического синтеза (патент РФ № 2306340), предусматривающий сбраживание сахарсодержащей питательной среды молочнокислыми бактериями Lactobacillus delbrueckii ВКПМ В-8744 в возрасте 48-72 ч в присутствии солодовых ростков в количестве 12-15 г/л, обработанных водой, подкисленной молочной кислотой до рН 4,0-5,0 и ферментным препаратом ксилоглюканофоетидином в количестве, соответствующем 200-600 ед./л ксиланазной активности. Среда содержит мел в количестве 60% от общего количества, рассчитанного для нейтрализации молочной кислоты, дрожжевой экстракт и питательные соли. В качестве питательных солей используют сульфаты магния, марганца и железа, цитрат аммония, одно- и двухзамещенные фосфаты калия. Нейтрализацию образующейся молочной кислоты проводят через 24 часа от начала процесса брожения введением 40% оставшегося мела. Продуктивность процесса составляет 2,96 г/(л*ч) лактата кальция. Выход молочной кислоты на стадии брожения от исходного сахара составляет 94,6%. Недостатком данного способа является относительно невысокий выход молочной кислоты и использование дорогостоящих компонентов питательной среды, а также необходимость утилизации твердого отхода – мела, которая не описывается.

Другой биотехнологический способ получения молочной кислоты предусматривает культивирование в ферментерах культуры лактобактерий Lactococcus lactis ВКПМ В-1700, и/или Lactococcus lactis ВКПМВ-2017, и/или Lactococcus lactis ВКПМ В- 2018 в нестерильных условиях на питательной среде с последующей нейтрализацией молочной кислоты 5%-м раствором гидроокиси натрия. После достижения концентрации лактата натрия по меньшей мере 3% через по меньшей мере 6 часов ферментационную среду частично выводят из ферментера с доливом питательной среды в том же объеме. Осуществляют ступенчатое центрифугирование. Освобожденную от лактобактерий культуральную жидкость подают в блок биполярных диэлектрических мембран в непрерывном режиме. Молочную кислоту из сборной камеры электродиализного блока подают на дополнительную очистку. Затем молочную кислоту упаривают на вакуумных установках до концентрации 40 или 80% и фасуют (патент РФ № 2661792). Недостатками данного способа является использование в качестве компонента среды культуральной жидкости гриба Fusarium sambucinum с низкой питательной ценностью, что требует внесения дополнительных добавок – чистой глюкозы и дрожжевого экстракта, использование которых повышает стоимость производства.

Известен способ получения молочной кислоты путем выращивания продуцента – кокковых форм термофильных или термотолерантных молочнокислых бактерий, таких как Streptococcus faecium, Streptococcus thermophillus, Lactobacillus acidophilus var. coccoideus с последующим выделением целевого продукта из ферментационной среды. В качестве источника углерода предлагается использование, например, лактозы, глюкозы, сахарозы, а в качестве источника азота – автолизатов дрожжей (БВК, пивных, пекарских). Среда может быть также дополнена стимулирующими рост бактерий и биосинтез молочной кислоты добавками, такими как кукурузный экстракт, солодовые ростки. Молочную кислоту из культуральной жидкости выделяют, добавляя в нее серную кислоту, в результате чего лактат кальция переходит в молочную кислоту, гипс выпадает в осадок, после чего смесь фильтруют (патент РФ № 2175014). Недостатком метода является использование на стадии культивирования автолизата пекарских/кормовых дрожжей, которые сами по себе являются ценным продуктом.

Известен способ получения молочной кислоты, где в качестве субстрата для ферментации используется концентрированный сырой свекольный сок. После разбавления до желаемой начальной концентрации сахара и добавления питательных веществ сок ферментируется до молочной кислоты и / или лактата с помощью молочнокислых микроорганизмов (патент № US8211675). Недостатком данного способа является неполное потребление сахаров микроорганизмами, а также образование трудноудаляемых примесей в ходе ферментации.

Известен способ получения молочной кислоты с использованием городских твердых отходов (патент РФ № 2177036), предусматривающий ферментацию молочнокислых бактерий. На первом этапе из городских твердых отходов удаляют крупные части черных и цветных металлов, пластмассы и стекла и получают целлюлозный компонент, который затем измельчают и обрабатывают его разбавленной серной кислотой при 40-100°С, растворяя оставшиеся тяжелые металлы и получая растворимый и нерастворимый компоненты. После этого отделяют растворимый компонент от нерастворимого компонента, затем высушивают полученный нерастворимый компонент, обрабатывают его при массовом соотношении «концентрированная серная кислота: нерастворимый компонент» - 1:1 и получают частично гидролизованную смесь. Далее разбавляют полученную частично гидролизованную смесь водой при 80-100°С, перемешивают полученную разбавленную смесь при 100°С и получают разложившийся материал. Затем удаляют твердые вещества из полученного разложившегося материала и получают фильтрат, разделяют фильтрат на раствор, содержащий кислоту, и раствор, содержащий сахар, потом концентрируют раствор, содержащий сахар, до 1-20% концентрации сахара, доводят рН полученного концентрированного раствора, содержащего сахар, до 4,5-7,5, после чего ферментируют полученный раствор молочнокислыми бактериями и получают раствор, содержащий молочную кислоту. Недостатком данного способа является необходимость сложной многостадийной предобработки сырья с осуществлением жесткого микробиологического контроля от посторонней микрофлоры для получения достаточного выхода молочной кислоты, что приводит к заметному усложнению и удорожанию технологического процесса.

Известен способ получения молочной кислоты (заявка № US2010/0112652) путем ферментации экстракта сахарного тростника с помощью микроорганизмов, принадлежащих к роду Bacillus или Sporolactobacillus, при этом в питательную среду нет необходимости добавлять другие органические и неорганические вещества. Во время ферментации добавляют гидроксид кальция для поддержания pH ферментационной среды. Выход молочной кислоты составляет 20-30%. Недостатком данного метода является относительно невысокий выход молочной кислоты.

Известен способ (патент № EP4107215) получения L-лактатной соли из комбинированной рециркуляции полимолочной кислоты (PLA) и увеличения выхода L-молочной кислоты с помощью ферментации органических отходов. Общий выход продукции может достигать до 100%. Недостатком данного способа является использование в качестве субстрата для ферментации смешанных пищевых отходов, состав которых может изменяться от партии к партии, что в свою очередь может приводить к низкому выходу молочной кислоты. Также необходимо осуществление жесткого микробиологического контроля от посторонней микрофлоры используемого субстрата.

Известен способ (патент № EP1753869B1) получения полимолочной кислоты с использованием возобновляемого растительного сырья, такого как тростниковая патока или тростниковый жом. Ферментацию молочнокислых бактерий проводят в анаэробных/микроаэрофильных условиях с использованием штаммов р. Lactobacillus (предпочтительно L. delbrueckii), в периодическом режиме в течение 24-48 часов. Выход очищенного лактида составляет 50-60%. Недостатком данного метода является относительно невысокий выход молочной кислоты.

Известен способ (патент РФ № 2700503) получения молочной кислоты, предполагающий внесение бактерий рода Lactobacillus в питательную среду, содержащую рассиропную, отстерилизованную свекловичную мелассу, сточные воды, предварительно очищенные с помощью биомассы Chlorella vulgaris при заданных соотношениях компонентов, и культивирование молочнокислых бактерий в течение 24-35 часов, при температуре 37-50°С, начальном уровне рН 6,5-7,5, при перемешивании 50-80 об/мин, аэрации суспензии на стадии накопительного культивирования газовоздушной смесью 60-80 л/ч с последующим обеспечением анаэробных условий в течение 24-35 ч. Недостатком данного метода является наличие технологического этапа культивирования микроводорослей вида Chlorella vulgaris, который предполагает интенсивную аэрацию суспензии микроводорослей на стадии накопительного культивирования газовоздушной смесью 60-80 л/ч, что приводит к удорожанию процесса производства молочной кислоты.

Известен другой способ (патент РФ № 2195495) получения L(+) – молочной кислоты путем прямой ферментации крахмалсодержащего сырья (пшеничная мука или помол зерен сорго) микроорганизмом, вызывающим молочнокислое брожение – Streptococcus bovis. Концентрация молочной кислоты на выходе – 72-90 г/л. Недостатком данного метода является использование серной кислоты для предварительной обработки пшеничной муки и мела для ее последующей нейтрализации, в результате чего образуется сульфат кальция, который будет смешиваться с непрогидролизованным остатком муки и являться дополнительным отходом производства.

Известен способ (заявка № WO2021156472) получения молочной кислоты из сырой биомассы, предварительно обработанной щелочью, путем одновременного проведения гидролиза и анаэробной ферментации со смешанной культурой микроорганизмов. Сырая биомасса может представлять собой агропромышленные или животноводческие стоки агропромышленные или животноводческие, биоотходы, лигноцеллюлозную биомассу и др. Способ позволяет получить 70-100% выход молочной кислоты. Недостатком упомянутых способов является необходимость реализации стадии предварительной обработки биомассы щелочью.

Известен способ получения молочной кислоты путем ферментации инулинсодержащего сырья микроорганизмом, вызывающим молочнокислое брожение (патент РФ № 2195494). Недостатком способа можно считать относительно малотоннажное сырье для производства молочной кислоты.

Известен способ получения молочной кислоты из сельскохозяйственных отходов с использованием смешанных бактериальных культур (заявка № WO2013185344). Недостатком данного способа является необходимость реализации стадии предварительного гидролиза растительного сырья.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является патент РФ № 2612152 (прототип), в котором для молочнокислого брожения в качестве углеводов используется ферментолизат крахмалосодержащего сырья, полученный из зернового сырья или отрубей влажным дроблением гидро-механо-акустическим способом с выделением фракционированием крахмала А и В, с их ферментативным гидролизом до глюкозы и добавлением в питательную среду солевых компонентов, дрожжевого экстракта и белковой составляющей. Способ предусматривает стадию накопительной ферментации в течение 12-24 ч. Накопленную биомассу отделяют в центробежном поле, ресуспендируют в ферментационной доливной среде, переносят в основной ферментер и культивируют 2-3 часа с одновременной подачей дополнительной среды с титрующими агентами для поддержания pH аммиачной водой в случае получения лактата аммония или раствора гидроксида натрия в случае получения натрия лактата. Затем полностью сливают все содержимое ферментера и отделяют биомассу продуцента от культуральной жидкости в центробежном поле. Биомассу продуцента ресуспендируют со следующей порцией ферментационной доливной среды и культивируют в очередном цикле. Количество циклов в основной ферментации составляет 10-20 циклов, фугат после отделения биомассы продуцента используют для дальнейшей переработки в молочную кислоту или соли молочной кислоты. Концентрация молочной кислоты в культуральной жидкости составляет не менее 120 г/л, а средняя скорость синтеза молочной кислоты – не менее 5 г/л⋅ч. Основным недостатком данного способа является использование цельнозернового крахмалосодержащего сырья, которое может быть применено для комплексной переработки с выделением целого ряда ценных продуктов, образование большого количества отходов, которые необходимо дополнительно утилизировать, а также использование в составе питательной среды дорогостоящего дрожжевого экстракта, что существенно повышает себестоимость процесса.

Технической задачей предлагаемого изобретения является разработка способа биоконверсии побочных продуктов производства пшеничного крахмала в молочную кислоту. Эффективность предлагаемого способа достигается использованием в качестве единственного источника ростовых факторов пентозансодержащей фракции и стоков, содержащих фракцию B-крахмала, а также достижением максимального потребления углеводов и выхода молочной кислоты не менее 85% от потребленных углеводов и повышением продуктивности за счет применения отъемно-доливного культивирования.

Поставленная задача решается путем разработки способа биоконверсии побочных продуктов производства пшеничного крахмала в молочную кислоту, заключающегося в наращивании биомассы молочнокислых бактерий до численности не менее 9,2 log (КОЕ/мл) в питательной среде, состоящей из смеси пентозансодержащей фракции и стоков, содержащих фракцию крахмала B, в условиях глубинной гетерофазной ферментации, при поддержании рН 5,7-5,9, последующего внесения комплексного амилолитического ферментного препарата в количестве от 0,5 до 10 % от содержания сухого вещества в смеси побочных продуктов, и биосинтеза молочной кислоты до достижения максимального потребления углеводов и выхода молочной кислоты. Для повышения продуктивности процесса после окончания первого цикла биосинтеза из ферментера отбирают 90 % об. культуральной жидкости, добавляют равную отобранному количеству смесь побочных продуктов и комплексный амилолитический ферментный препарат, и проводят до пяти повторяющихся циклов биосинтеза.

Техническим результатом настоящего изобретения является биоконверсия побочного продукта производства пшеничного крахмала – смеси пентазансодержащей фракции и стоков, содержащих фракцию крахмала B, в молочную кислоту с выходом последней не менее 85% от потребленных углеводов и без добавления дополнительных факторов роста, а также в повышении продуктивности за счет применения отъемно-доливного культивирования. Высокая степень биоконверсии подтверждается снижением концентрации углеводов со 121 до 3,5 г/л. Применение пентозансодержащей фракции и стоков, содержащих фракцию крахмала B, смешанных в соотношении, соответствующем количествам, образующимся при глубокой переработке зерна пшеницы в крахмал, позволяет максимально эффективно утилизировать данные побочные продукты.

Достижение технического результата подтверждается примерами.

Пример 1. Для наращивания биомассы молочнокислых бактерий используют пентозансодержащую фракцию и стоки, содержащие фракцию крахмала B, смешанные в соотношении, соответствующем количеству данных побочных продуктов, образующемуся при глубокой переработке зерна пшеницы по одной из типовых технологий. Основными продуктами данного производства являются пшеничные крахмал и глютен.

В ферментер объемом 5 л загружают 3,4 л смеси побочных продуктов, стерилизуют при 112°С в течение 30 минут, охлаждают до температуры культивирования 37°C и инокулируют 5% об. ночной культуры молочнокислых бактерий Lactobacillus paracasei. Поддерживают pH культивирования на значении 5,8±0,1 добавлением в культуральную жидкость концентрированного раствора аммиака. Дополнительно ростовых факторов не вносят. Глубинную гетерофазную ферментацию продолжают в течение 10 часов до достижения численности жизнеспособных молочнокислых бактерий в культуральной жидкости не менее 9,2 log (КОЕ/мл).

Пример 2. Для активации биосинтеза молочной кислоты в ферментационную среду, полученную по примеру 1, добавляют комплексный амилолитический ферментный препарат (глюкоамиллазная активность 9000 ед. ГлС/см³ и альфа-амилазная активность 500 ед. АС/см³) в количестве от 0,5 до 10% от содержания сухих веществ в питательной среде (смеси побочных продуктов). Процесс одновременного осахаривания углеводов и биосинтеза молочной кислоты проводят при поддержании рН добавлением в культуральную жидкость концентрированного раствора аммиака до достижения максимального потребления редуцирующих веществ, в течение от 30 до 32 часов. Продукт накапливается в виде лактата аммония. Степень потребления редуцирующих веществ составляет в среднем 98,3%, выход молочной кислоты – 89% от потребленных углеводов, конечная концентрация молочной кислоты – 109,4 г/л. Численность жизнеспособных молочнокислых бактерий в культуральной жидкости практически не снижается. Продуктивность процесса по молочной кислоте с учетом стадии наращивания биомассы составляет 2,7 г с 1 л культуральной жидкости в час. Варьирование концентрации ферментного препарата в указанном диапазоне не влияет на показатели процесса.

Пример 3. Для повышения продуктивности процесса биоконверсии из ферментера отбирают 90% об. культуральной жидкости, полученной по примеру 2, которую направляли на дальнейшую переработку с целью выделения лактата аммония, после чего вносят равное отобранному количество смеси побочных продуктов и комплексный амилолитический ферментный препарат. Продолжают биосинтез до максимальной степени потребления редуцирующих веществ. Параметры биосинтеза значимо не изменяются после пяти циклов отъема-долива, что позволяет добиться суммарной продуктивности 3,1 г молочной кислоты с 1 л культуральной жидкости в час.

Пример 4. Для оценки возможности применения стоков, содержащих фракцию крахмала B, отдельно от пентозановой фракции для биосинтеза молочной кислоты из ферментера отбирают 90% об. культуральной жидкости, полученной по примеру 2, после чего вносят равное отобранному количество стоков и комплексный амилолитический ферментный препарат. Процесс одновременного осахаривания крахмала В и биосинтеза молочной кислоты проводят при поддержании рН с добавлением в культуральную жидкость концентрированного раствора аммиака до достижения максимального потребления редуцирующих веществ (углеводов), т.е. в течение 238,5 часов. При этом численность жизнеспособных молочнокислых бактерий в культуральной жидкости снижается до 7,7 log (КОЕ/мл). Степень потребления редуцирующих веществ составляет 95,8%, выход молочной кислоты – 59% от потребленных углеводов, конечная концентрация молочной кислоты – 88,1 г/л. Продуктивность процесса по молочной кислоте с учетом стадии наращивания биомассы составляет 0,4 г с 1 л культуральной жидкости в час. Таким образом, при использовании стоков, содержащих фракцию крахмала B, отдельно от пентозансодержащей фракции заявляемый технический результат не достигается.

Результаты получены с использованием оборудования Центра коллективного пользования РХТУ им. Д.И. Менделеева.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности. Способ получения молочной кислоты из побочных продуктов производства крахмала при переработке зерна пшеницы предусматривает наращивание в ферментере биомассы молочнокислых бактерий до численности не менее 9,2 log КОЕ/мл в питательной среде в условиях глубинной гетерофазной ферментации, при поддержании рН 5,7-5,9. Указанная питательная среда состоит из побочных продуктов производства крахмала при переработке зерна пшеницы, представляющих собой смесь пентозансодержащей фракции и содержащих фракцию крахмала B стоков. После чего в ферментер вносят комплексный амилолитический ферментный препарат в количестве от 0,5 до 10 % от содержания сухого вещества в смеси побочных продуктов производства крахмала при переработке зерна пшеницы. Далее проводят биосинтез молочной кислоты до снижения концентрации углеводов с 121 г/л до 3,5 г/л. Причем после окончания первого цикла биосинтеза молочной кислоты из ферментера отбирают 90 об.% культуральной жидкости, добавляют равную отобранному количеству смесь побочных продуктов производства крахмала при переработке зерна пшеницы и комплексный амилолитический ферментный препарат и проводят до пяти повторяющихся циклов биосинтеза молочной кислоты. Изобретение позволяет получить молочную кислоту с выходом не менее 85% от потребленных углеводов и без добавления дополнительных факторов роста, а также повысить продуктивность за счет применения отъемно-доливного культивирования. 4 пр.

Способ получения молочной кислоты из побочных продуктов производства крахмала при переработке зерна пшеницы, предусматривающий наращивание в ферментере биомассы молочнокислых бактерий до численности не менее 9,2 log КОЕ/мл в питательной среде, состоящей из побочных продуктов производства крахмала при переработке зерна пшеницы, представляющих собой смесь пентозансодержащей фракции и содержащих фракцию крахмала B стоков, в условиях глубинной гетерофазной ферментации, при поддержании рН 5,7-5,9, после чего в ферментер вносят комплексный амилолитический ферментный препарат в количестве от 0,5 до 10% от содержания сухого вещества в смеси побочных продуктов производства крахмала при переработке зерна пшеницы и проводят биосинтез молочной кислоты до снижения концентрации углеводов с 121 г/л до 3,5 г/л, причем после окончания первого цикла биосинтеза молочной кислоты из ферментера отбирают 90 об.% культуральной жидкости, добавляют равную отобранному количеству смесь побочных продуктов производства крахмала при переработке зерна пшеницы и комплексный амилолитический ферментный препарат и проводят до пяти повторяющихся циклов биосинтеза молочной кислоты.