СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНДОТОКСИНСОДЕРЖАЩИХ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 1995 года по МПК A01N63/00 

Изобретение относится к производству энтомопатогенных микробных препаратов и может быть использовано для борьбы с насекомыми-вредителями сельскохозяйственных культур и леса.

Известен способ получения бактериальных препаратов, включающий глубинное культивирование биомассы, выделение из биомассы активной фракции, смешивание ее с наполнителем и прилипателем и высушивание. В качестве наполнителя используется каолин, а в качестве прилипателя - карбоксиметилцеллюлоза [1].

Однако в известном способе в качестве наполнителя используют каолин, что снижает активность получаемого препарата и значительно ухудшает его физическое свойства.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту к предлагаемому является способ получения бактериальных энтомопатогенных препаратов, включающий получение биомассы глубинным культивированием Bacillus thuringiensis, выделение из биомассы активной фракции, смешивание ее с наполнителем и высушивание [2].

В получаемом известным способом препарате в выделенной активной фракции кроме действующего начала, а именно: дельта-эндотоксина, присутствуют компоненты культуральной среды, вегетативные клетки и т.п., что снижает инсектицидную активность целевого продукта. Наличие нерастворенных кристаллов дельта-эндотоксина также снижает активность препарата, ограничивает круг насекомых - объектов борьбы, затрудняет его точное дозирование, вызывает повышенный расход препарата.

Цель изобретения - повышение инсектицидной активности целевого продукта.

Для этого в известном способе, включающем получение биомассы глубинным культивированием Bacillus thuringiensis, выделение из биомассы активной фракции, содержащей споры и кристаллы дельта-эндотоксина, смешивание ее с наполнителем и высушивание, согласно изобретению в активную фракцию до ее высушивания вносят гидроксид натрия или калия, смесь выдерживают при перемешивании до растворения кристаллов дельта-эндотоксина, образующийся при этом осадок удаляют, а высушиванию подвергают раствор дельта-эндотоксина.

Целесообразно перед высушиванием добавлять в целевой продукт прилипатель.

Желательно в качестве прилипателя использовать казеиновой клей в количестве 2-5% или карбоксиметилцеллюлозу в количестве 1-3%, или сульфанол в количестве 0,05-0,10%.

В предлагаемом способе получения эндотоксинсодержащих энтомопатогенных препаратов в активную фракцию до ее высушивания добавляют растворитель, выдерживают, перемешивая, до растворения действующего начала, а именно: дельта-эндотоксина, и удаляют осадок, причем в качестве растворителя используют гидрооксид калия или натрия в соотношении объемов к активной фракции 1:4-1: 5.

Добавление гидрооксида в активную фракцию биомассы перед высушиванием позволяет растворить действующее начало целевого продукта, а именно: кристаллы дельта-эндотоксина. Отделение осадка, полученного после растворения дельта-эндотоксина, и представляющего собой элементы культуральной среды, вегетативные клетки, споры, продукты метаболизма бактерий, позволяет получить практически чистый раствор действующего начала, т.е. дельта-эндотоксина, что повышает активность целевого продукта, облегчает его дозирование и, как следствие, снижает расход препарата при его применении.

П р и м е р 1. Готовят 1000 л стандартной питательной среды, содержащей 1,5% кукурузной муки, 3% сухих дрожжей, 1,8% соевой муки, остальное (до 100% ) вода. Глубинное культивирование микроорганизма-продуцента Bacillus thuringiensis subsp. Kurstaki штамм Z-52 осуществляют в стандартном ферментере объемом 1000 л при 28-30^оС и непрерывном перемешивании в течение 60 ч. Затем культуральную жидкость отделяют от активной фракции сепарацией.

Культуральная жидкость, содержащая растворимые компоненты питательной среды и растворимые продукты жизнедеятельности бактерии, и в том числе растворенный β-экзотоксин, идет в отход. Полученная после сепарации пастообразная активная фракция содержит нерастворимые компоненты питательный среды, бактериальные клетки, споры, кристаллы дельта-эндотоксина, являющегося действующим началом препарата, и другие продукты метаболизма. В указанную активную фракцию добавляют 0,16%-ный раствор гидрооксида натрия до соотношения объемов активной фракции и гидрооксида натрия соответственно 1:4 (рН 13,5), выдерживают, перемешивая, до растворения кристаллов дельта-эндотоксина. После чего отделяют ненужный осадок сепарацией (можно отделить и фильтрованием или центрифугированием). Осадок идет в отход, Оставшееся незначительное количество экзотоксина при воздействии гидроксида натрия практического значения не имеет.

Полученный после сепарации щелочной раствор содержит в качестве основного компонента дельта-эндотоксин (действующее начало препарата).

Раствор сушат, применив распылительную сушку. Можно сушить и другим способом, не требующим длительного нагревания, например, использовать сублимационную сушку.

Выход высушенного продукта составляет 20 г из 1 кг сырой биомассы.

Высушенный продукт, представляющий собой порошок, смешивают с наполнителем в соотношении: сухой дельта-эндотоксин 10%, гидрооксид натрия 3%, наполнитель остальное. В качестве наполнителя используют биологически инертное растворимое вещество, а именно: хлорид натрия. Выход препарата составил 200 г из 1 кг сырой биомассы.

Инсектицидная активность препарата составила 10000 ЕА/мг.

П р и м е р 2. Технология аналогична примеру 1, но в качестве растворителя используют гидроксид калия в соотношении объемов 1:4.

П р и м е р 3. Технология аналогична примеру 1, но в качестве растворителя используют гидрооксид калия (натрия) в соотношении объемов 1:5.

П р и м е р 4. Технология аналогична примеру 1, но в качестве наполнителя используют гидрокарбонат натрия, а в качестве растворителя - гидрооксид калия в соотношении объемов 1:5.

Дальнейшее увеличение объема растворителя (более 5 ч.) нецелесообразно, т.к. увеличивается объем раствора и затрудняется сушка.

Уменьшение объема растворителя (менее 1:4) приводит к неполному растворению действующего начала.

П р и м е р 5. Технология аналогична примеру 1, но добавляют 0,4%-ный раствор гидрооксида натрия до соотношения объемов 1:4.

Инсектицидная активность препарата составляет 10000 ЕА/мг.

Выход препарата 250 г на 1 кг сырой биомассы, продукта - 25 г на 1 кг.

П р и м е р 6. Технология аналогична примеру 1, но с наполнителем дельта-эндотоксин смешивают так, чтобы содержание дельта-эндотоксина составило 20%, гидроксид натрия 8%, наполнитель остальное.

Выход препарата 140 г на 1 кг сырой биомассы.

Инсектицидная активность 21000 ЕА/мг.

П р и м е р 7. Технология аналогична примеру 1, но культивируют микроорганизмы - продуценты Bacillus thuringiensis subsp. dendrotumus штамм 49/7.

Биологическая активность полученного препарата 13000 ЕА/мг, выход высушенного продукта составил 28 г на 1 кг сырой биомассы, препарата - 280 г на 1 кг.

Следует отметить, что все подвиды Bacillus thuringiensis (даже subsp. israelensis), включающие каждый десятки штаммов, продуцируют дельта-эндотоксин. Исследованиями установлено, что нет принципиальных различий в эндотоксинах, продуцируемых различными штаммами.

Поэтому бактериальный эндотоксинсодержащий энтомопатогенный препарат может быть получен из любого штамма любого подвида Bacillus thuringiensis. Способ получения эндотоксиновых препаратов на основе любого штамма один и тот же. Определенная вариабельность эндотоксинов, продуцируемых различными штаммами данного вида микроорганизмов, обуславливает только некоторые различия в спектре их действия, т.е. в круге восприимчивых к ним насекомых - вредителей.

П р и м е р 8. Технология аналогична примеру 1, но перед высушиванием в целевой продукт добавляют прилипатель, а именно: казеиновый клей, в количестве 4%.

В качестве прилипателя можно использовать также карбоксилметилцеллюлозу в количестве 1-3% или сульфанол в количестве 0,05-0,10%.

Полученный продукт представляет собой:
порошок, содержащий 10% дельта-эндотоксина, 3-4% едкого натра, 2-5% прилипателя, остальное наполнитель;
порошок, содержащий 20% дельта-эндотоксина, 6-8% гидрооксид натрия или гидроксид калия, 2-5% прилипателя, остальное наполнитель.

Биологическая активность 12000 ЕА/мг в готовом продукте.

В лабораторных условиях сравнивали физические свойства известного и предлагаемого энтомопатогенных препаратов. Опыты повторяли пять раз. Сравнивали смачиваемость и стабильность рабочей суспензии предлагаемого бактериального препарата, препарата, полученного известным способом (прототип - лепидоцид, стабилизированный порошок) и препарата, выпускаемого в настоящее время на Бердском химическом заводе (лепидоцид, сухой концентрат) (см. табл.1).

Оценку смачиваемости и стабильности препарата определяли по известной методике. Достоверность полученных результатов оценивали методом дисперсионного анализа.

Приведенные в табл.1 данные показывают, что смачиваемость препарата и стабильность рабочей суспензии бактериального энтомопатогенного препарата, полученного предлагаемым способом, выше, чем у препарата, полученного известным способом, и значительно выше, чем у препарата, выпускаемого в настоящее время на Бердском химическом заводе. Обусловлено это тем, что применен хорошо растворимый наполнитель (в сравнении с выпускаемым в промышленности препаратом). По сравнению с прототипом более высокие физические свойства обусловлены тем, что полученный целевой продукт более чистый, а следовательно, мелкодисперсный.

В лабораторных условиях определяли инсектицидную активность бактериального энтомопатогенного препарата, полученного предлагаемым способом, на гусеницах капустной белянки. Опыты проводили в пяти повторностях. Гусениц заражали перорально и высаживали в садки на корм по 15 особей в каждый. Достоверность полученных результатов оценивали методом дисперсионного анализа. Результаты представлены в табл.2.

Таким образом, препарат, полученный предлагаемым способом, обладает значительно большей инсектицидной активностью, чем препарат, полученный известным способом, в 10 раз меньшие его концентрации в рабочей суспензии позволяют обеспечить 100% -ную гибель гусениц, следовательно, уменьшены и нормы его расхода.

Анализ данных табл.2 показывает также, что в препарат нецелесообразно вводить больше 20% действующего начала, т.к. 100% гибель гусениц достигается и при этой концентрации. Увеличение концентрации приведет и к удорожанию препарата.

При процентном содержании действующего начала в препарате менее 10% резко снижается его эффективность.

Инсектицидную активность препарата, полученного предлагаемым способом, сравнивали с инсектицидной активностью препарата, полученного известным способом, определяли концентрацию, вызывающую на 3-и сутки гибель 50% насекомых, гусениц капустной белянки IV-возраста, участвующих в опыте (ЛК₅₀ % ). Результаты представлены в табл.3.

Приведенные в табл.3 данные показывают, что препарат, полученный предлагаемым способом, более эффективен. При значительно меньших количествах, т. е. при значительно меньших значениях ЛК₅₀, он обеспечивает гибель 50% насекомых, следовательно, можно снизить нормы расхода препарата, достигая той же инсектицидной активности.

Содержание дельта-эндотоксина в препарате меньше 10% ведет к резкому снижению инсектицидной активности препарата (см. табл.2 и 3, пример с 5% содержанием дельта-эндотоксина) и, следовательно, к увеличению нормы расхода.

Таким образом, предлагаемый способ получения эндотоксинсодержащих энтомопатогенных препаратов позволяет обеспечить значительную инсектицидную активность целевого продукта вследствие растворения и выделения из состава активной фракции ее действующего начала, а именно: дельта-эндотоксина, и добавления прилипателя, препятствующего быстрому смыванию препарата с обрабатываемых растений, и таким образом повышающего его эффективность.

Изобретение относится к производству энтомопатогенных микробных препаратов и может быть использовано для борьбы с насекомыми - вредителями сельскохозяйственных культур и леса. Цель изобретения - повышение инсектицидной активности целевого продукта. Способ получения эндотоксинсодержащих энтомопатогенных препаратов включает получение биомассы глубинным культивированием Bacillus thuringiensis, выделение из биомассы активной фракции, высушивание и смешивание с наполнителем и прилипателем. Новым в способе является то, что в активную фракцию до ее высушивания вносят растворитель, выдерживают до растворения действующего начала, образующийся при этом осадок удаляют, причем в качестве растворителя используют щелочи, например гидрооксиды натрия или калия, при соотношении объемов (1 : 4) - (1 :5). Перед высушиванием в раствор вводят прилипатель, например казеиновый клей, в количестве 2-5%. 1 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНДОТОКСИНСОДЕРЖАЩИХ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ путем культивирования бактерий Bacillus thuringiensis с последующим отделением биомассы, содержащей опоры и кристаллы дельта эндотоксина, от культуральной жидкости и высушиванием, отличающийся тем, что в биомассу вносят гидроксид натрия или калия, смесь выдерживают при перемешивании до растворения кристаллов эндотоксина, образующийся при этом осадок удаляют, а высушиванию подвергают раствор эндотоксина. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что перед высушиванием в раствор вводят прилипатель, в качестве которого используют казеиновый клей в количестве 2-5%.