Способ получения противоракового препарата Советский патент 1993 года по МПК A61K35/74 C12P1/04 

СП

с

Использование: микробиология. Сущность изобретения: включает культивирование штамма Bacillus thuringlensls. подготовку культуры и разложение молекул дельта-эндотоксина до полипептидов. Молекулы дельта-эндотоксина до полипептидов разлагают растворением в щелочи, причем растворение осуществляют непосредственное споро-дельта73ндотоксиновой смеси с последующим осаждением полипептидов титрованием концентрированной уксусной кислотой, в качестве растворителя используют едкий натр или едкое кали при соотношении объемов спо- ро-дельта-эндотоксиновой смеси и растворителя соответственно 1:10-1:15, концентрированную уксусную кислоту для осаждения добавляют до достижения рН 4. 2 з.п.ф-лы.

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способу получения препарата на основе штамма Bacillus thuringlensls, обладающего противораковой активностью.

Известен способ получения препарата на основе штамма Bacillus thuringlensls.

Известный способ включает культивирование штамма, подготовку культуры и разложение молекул дельта-эндотоксина до . полипептидов.

Недостатком способа является его сложность и трудоемкость, т.к. разложение молекул дельта-эндотоксина осуществляют после удаления спор из споро-дельта-эндо- токсиновой смеси.

Разложение молекул дельта-эндотоксина до полипептидов осуществляют с помощью щелочи, а осаждение - целлюлозно колоночной хроматографией, Это очень сложный и дорогостоящий процесс.

Известен также способ получения препарата на основе штамма Bacillus thurlngiensb, обладающего противоопухолевой активностью, наиболее близкий по технической сущности и достигаемому эффекту.

Известный способ включает культивирование штамма Bacillus thuringlensls, подготовку культуры и разложение молекул дельта-эндотоксина до полипептидов.

Недостатком известного способа является его сложность и длительность, т.к. разложение молекул дельта-эндотоксина осуществляют после удаления спор из спо- ро-дельта-эндотоксиновой смеси.

Удаление спор осуществляют флотацией. Однако при этом удаляется около 80% спор, а остальные 20% удаляют путем фазового разделения в двухфазной системе четы реххлористы и углеродсернокислый натрий, что требует дополнительных заVIчэ о

4

СО

трат и также усложняет способ, увеличивает его длительность.

Кроме того, разрушение кристаллической структуры дельта-эндотоксина, при котором происходит разложение молекул до полипептидов, что необходимо для использования препарата, осуществляют облучая дельта-эндотоксин ультрафиолетовыми лучами, что требует специального оборудования и удорожает и усложняет способ.

Цель изобретения -упрощение способа и повышение его экономичности.

Указанная цель достигается тем, что в известном способе получения препарата на основе штамма Bacillus thurlenglensls, обладающего противоопухолевой активностью, включающем культивирование штамма, подготовку культуры и разложение молекул дельта-эндотоксина до полипептидов, согласно изобретению, культивируют штамм Bacillus thuringiensls var. gallerle, молекулы дельта-эндотоксина до полипептидов разлагают растворением о щелочи, причем это растворение осуществляют непосредственно в споро-дельта-эндотокси- нов ой смеси, с последующим осаждением полипептидов титрованием концентрированной уксусной кислотой.

Целесообразно в качестве растворителя использовать едкий натр или едкое кали при соотношении объемов споро-дельта-эн- дотоксиновой смеси и растворителя соответственно 1:10 - 1:15.

... Уксусную кислоту для титрования добавляют до достижения рН 4.

Предлагаемый способ отличается от прототипа тем, что культивируют штамм .Bacillus thuringlensis Var. gallerie, молекулы дельта-эндотоксина до полипептидов раз- лагают растворением в щелочи, причем рас- творение осуществляют непосредственно в споро-дельта-эндотоксиновой смеси с последующим осаждением полипептидов тит- ;рованием концентрированной уксусной кислотой. Способ отличается также тем, что R качестве растворителя используют едкий натр или едкое кали при соотношении обь- емов споро-дельта-эндотоксиновой смеси и растворителя соответственно 1:10 - 1:15, а концентрированную уксусную кислоту для осаждения титрованием добавляют до достижения рН 4.

Сущность предлагаемого способа наиболее полно раскрыта в примерах его конкретного осуществления.

П р и м е р 1. Культивирование Bacillus thuringiensls Var. gallerie осуществляли на твердой питательной среде в термостате при 28-30°С в течение 10 дней. После чего культуру промыли дистиллированной во0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

дои, затем физиологическим раствором и снова дистиллированной водой. При этом споро-дельта-эндотоксиновая смесь освобождается от растворимых токсинов. В смеси остаются в основном споры и кристаллы дельта-эндотоксина, вегетативные клетки.

Для разложения молекул, образующих кристаллы дельта-эндотоксина, до полипептидов, являющихся по сути действующим началом препарата, непосредственно в спо- ро-дельта-эндотоксиновую смесь добавили растворитель - едкий натр, в соотношении объемов 1:10, т.е. на 1 г споро-дельта-эндотоксиновой смеси - 10 мл едкого натра, и выдержали до растворения кристаллов дельта-эндотоксина, постоянно перемешивая. При этом частично растворяется и белок спор. Причем он разлагается также до полипептидов, сходных с полипептидами, на которые разлагаются молекулы дельта- эндотоксина.

Осадок, включающий остатки спор и вегетативных клэток, удалили центрифугированием в течение 20 мин, при скорости вращения ротора 5000 об/мин. Возможно удаление осадка и любым другим способом, например фильтрацией. Для повышения чистоты действующего начала (полипептидов) их осадили титрованием концентрированной уксусной кислотой до рН А.

Таким образом препарат, обладающий противоопухолевой активностью, на основе штамма Bacillus thurlenglensls Var, gallerle получен без применения специального оборудования, простым переосаждением дельта-эндотоксина, растворенного щелочью непосредственно в споро-дельта-эндоток- синовой смеем, что значительно ускоряет процесс, делает его более простым м экономичным.

П р и м е р 2, Технология аналогична примеру 1, но в качестве растворителя использовали едкое кали при соотношении объемов 1:10 (т.е. на 1 г споро-дельта-эндо- токсинной смеси - 10 мл едкого кали).

П р и м е р 3. Технология аналогична примеру 1, но в качестве растворителя брали едкий натр при соотношении объемов 1:15.

П р и м е р 4. Технология аналогична примеру 1, но в качестве растворителя использовали едкое кали в количестве 1:15.

Противоопухолевую активность препарата на основе штамма Bacillus thuringiensls. Var. gallerie, полученного предлагаемым способом проверяли на культурах раковых клеток HeLa и НеР. Все операции способа для испытания именно на клетках проводили в стерильных условиях,

используя стерильные растворы и вещества,

Перед использованием, чтобы нейтрализовать возможное цитотоксическре влия- ние щелочи на клетки, титровали одномолярным раствором соляной кислоты до рН 8. Далее раствор препарата разбавили стерильным буфером следующего состава: 0,8% NaCI + 0.02% KCi + 0.115% Na2HPCM + 0,02% КН2РСМ + Н20 - остальное, имеющим рН 7,5 до необходимой концентрации (0,025-0,075 мг/мл). В опыте разбавили до концентрации 0,05 мг/мл, В этом же буфере дважды промыли раковые клетки HeLa и НеР, Затем указанные раковые клетки инкубировали при 28°С с приготовленным белково-дельта-эндотоксиновым раствором. Через 1, 5, 10, 15 и 30 мин, а затем через 1, 2, 3, 6, 9, 12, 24 и 48 часов раковые клетки осторожно промывали и тотчас фиксировали. Обработанные клетки исследовали методами световой, электронной сканирующей и просвечивающей микроскопии.

Для световой микроскопии обработанные препаратом раковые клетки промывали 4-6 раз фосфатным буфером рН 7,4, фиксировали в фиксаторе Карнуа и окрашивали кристаллическим фиолетовым. Просматривали под световым микроскопом марки Эр- гавал (ГДР). Хорошо просматривалось изменение клеток во времени под действием препарата вплоть до их разрушения,

При помощи сканирующего микроскопа при увеличении в 5000 раз получены фотографии, показывающие изменение раковых клеток HeLa во времени под действием препарата, полученного предлагаемым способомнепосредственно из споро-дел ьта-эндотоксиновой смеси.

Ясно видна противораковая активность препарата на основе Bacillus thurlnglensls Var. gallerle, полученного более простым способом непосредственно из споро-дель- та-эндотоксиновой смеси.

Формула изобретения 1. Способ получения противоракового препарата, включающий культивирование штамма Bacillus thurlnglensfs с последующим разложением дельта-эндотоксина до полипептидов, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и поБелок спор, при добавлении щелочи частично разлагается на полипептиды, сходные с полипептидами молекул дельта-эндотоксина и не снижает противораковой активности 5 препарата, что установлено экспериментально.

Для контроля раковые клетки культур HeLa и НеР обрабатывали по указанной выше технологии, но раствор препарата заме- 0 пили раствором щелочи равного объема и концентрации. Изменений в раковых клетках в указанные выше периоды времени не наблюдалось.

При осуществлении способа получения 5 препарата использовать едкий натр или едкое кали нецелесообразно в соотношении меньшем чем 1:10, т.к. в этом случае получится перенасыщенный раствор, в котором не все молекулы дельта-эндотоксина могут 0 разложиться до полипептидов.

Соотношение споро-дельта-эндотоксиновой смеси и едкого кали или едкого натра большее чем 1:15 нецелесообразно, т.к. приведет к непроизводительному расходу 5 щелочи, концентрированной уксусной кислоты для титрования.

Предлагаемый способ позволяет получить препарат на основе штамма Bacillus thuringiensls Var. galierie, обладающий про- 0 тивоопухолевой активностью, обычным растворением до полипептидов молекул дельта-эндотоксина, составляющих его кристаллы, и простым переосаждением действующего начала, т.е. полипептидоо 5 титрованием концентрированной уксусной кислотой, что значительно удешевляет и упрощает способ (за счет сокращения числа операций, по сравнению с прототипом, уменьшения их сложности и трудоемкости, 0 отсутствия специального оборудования).

Белок спор, при добавлении щелочи частично разлагается на полипептиды, сходные с полипептидами молекул дельта-эидотоксмна и не снижает противо- 5 раковой активности препарата, что установлено экспериментально.

вышения его экономичности, из штаммов используют штамм Bacillus thuringiensls Var. galierie, разложение дельта-эндотоксина осуществляют щелочью в споро-дельта- эндотокси новой смеси, после чего полипептиды осаждают концентрированной уксусной кислотой.

71790410 8

2. Способ по п.1.отличающийсяЗ.Споообпопп,1и2,отличающийсятем,что тем, что из щелочи используют едкий натр указанную кислоту добавляют до достиже- или едкое кали при их соотношении к спо- ния рН 4. ро-дельта-эндотоксиновой смеси 10-15:1.