СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСЕКТИЦИДНОГО ПРЕПАРАТА И ПРЕПАРАТ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ BACILLUS THURINGIENSIS Российский патент 2005 года по МПК A01N63/00 C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, к производству средств защиты растений от вредных насекомых.

Многие пестицидные препараты на основе бактерий рода Bacillus в качестве действующего начала содержат споры и бактерии, наличие которых при обработке против вредителей обеспечивает длительное действие и защиту (SU 1713145, SU 1792281, RU 2128915). Однако экологическая безопасность и целесообразность применения инсектицидов, содержащих бактерии и споры микроорганизмов, вызывает сомнение. Согласно современным экологическим представлениям излишнее обсеменение спорами бактерий окружающей среды является нежелательным, поскольку может нарушить естественный баланс почвенной, наземной и водной флоры и фауны. В случае Bacillus thuringiensis установлено и общепринято, что споры практически не вносят вклада в возникновение патологии у насекомых. В связи с этим наличие спор в препаратах можно считать не только излишним, но и нежелательным (Квятковская И.Я., Слинько В.Н., Калинина Л.Н., Деп. ВИНИТИ, М., 1989, 15 с.).

Известны способы получения энтомопатогенных препаратов, содержащих в качестве действующего начала токсин в чистом виде, то есть без бактерий и спор (SU 204831, SU 1792613). Однако данные способы не позволяют полностью выделить целевой продукт из биомассы с получением препарата достаточной активности по отношению к вредителям. В авторском свидетельстве SU 204831 выделяют весь спектр токсинов без выделения необходимой фракции, то есть полученный препарат не обладает необходимой избирательностью. В SU 1792613 получают препарат, очищенный от сопутствующих высокомолекулярных веществ на основе небелкового β-экзотоксина. Однако известны многочисленные литературные данные о его токсичности не только для насекомых, но и для позвоночных животных, в том числе для человека. Он не только проявляет прямую токсичность, но и может вызывать тератогенные, мутагенные, возможно, канцерогенные эффекты.

Предлагаемый способ предусматривает удаление β-экзотоксина и других растворимых токсинов, обеспечивая тем самым высокую экологическую чистоту препарата и его безопасность для позвоночных животных. Способ позволяет выделить из биомассы бактерий Bacillus высокоспецифический и безопасный для позвоночных животных и полезных насекомых δ-эндотоксин (дельта-эндотоксин) белковой природы. В результате достигается высокая экологическая безопасность при очень высокой биологической эффективности (препарат в 10-30 раз более эффективен по сравнению со споросодержащими).

Наиболее близким к предлагаемому способу и препарату является способ получения инсектицидного (энтомопатогенного) препарата и препарат, описанный в патенте RU 2062577. Способ предусматривает культивирование бактерий Bacillus thuringiensis, выделение из биомассы дельта-эндотоксина, растворение кристаллов в щелочи, удаление осадка и смешивание с наполнителем. Способ позволяет путем добавления в активную фракцию биомассы щелочи растворить действующее начало целевого продукта, а именно кристаллы дельта-эндотоксина. Отделение осадка позволяет получить практически чистый раствор дельта-эндотоксина, что повышает активность целевого продукта и, как следствие, снижает его расход. Использование в качестве прилипателя спиртовой барды, являющейся биологически и химически инертным веществом одновременно в качестве наполнителя и прилипателя, упрощает технологию приготовления и повышает экономичность производства инсектицидного препарата.

Однако данный способ не позволяет растворить дельта-эндотоксин, являющийся только протоксином, полностью. Наличие частично растворенного в результате щелочного гидролиза кристаллического белка снижает активность препарата, увеличивает время его действия и ограничивает круг насекомых - объектов борьбы.

Предлагаемый усовершенствованный способ включает культивирование бактерий Bacillus thuringiensis, выделение из биомассы дельта-эндотоксина путем введения растворителя, удаление осадка и смешивание раствора с наполнителем и прилипателем с дальнейшим высушиванием целевого продукта. Способ отличается от известного тем, что перед выделением дельта-эндотоксина из биомассы, биомассу подвергают центрифугированию или сепарации для удаления растворимых компонентов среды и микробных метаболитов (β, γ, α экзотоксины), не обладающих избирательной токсичностью. Затем в полученный осадок, содержащий кристаллы, споры и вегетативные клетки, вносят водный раствор смеси щелочи (0,16% гидроксида натрия или калия) и 0,07-0,17% гидросульфит натрия, а в качестве прилипателя используют гидролизованный хитин, или мелассу, или сухую пахту, или сыворотку, или рыбий клей размолотый, или пектин из свекловичного или яблочного жома.

Объектом данного изобретения является также инсектицидный препарат, полученный предложенным способом.

Препарат имеет следующий состав (мас.%):

Действующее начало - растворенный дельта-эндотоксин

Bacillus thuringiensis10-20%Щелочь (NaOH или КОН)3-8%Восстановитель гидросульфит натрия1-8%Прилипатель - стабилизатор рабочей суспензии -  

меласса, или сухая пахта, или сыворотка, или

гидролизованный хитин, или рыбий клей

размолотый, или пектин из свекловичного или яблочного жома3-20%Наполнитель, н-р, NaClдо 100%

Опытным путем установлено то, что предлагаемые технологические приемы позволяют значительно снизить время растворения. Так по экспериментальным данным в способе согласно RU 2062577 время растворения составляет 6-8 ч, тогда как в новом способе в присутствии восстановителя время сокращается до 2-3 ч. При этом более длительные сроки нецелесообразны, т.к. токсин в основном переходит в растворимое состояние за 2-3 часа, а продление времени ухудшает технологические характеристики процесса (его продолжительность). При использовании предложенного способа выход препарата увеличился в 1,5-2 раза. В таблице 1 приведены сравнительные данные по количеству токсина, получаемого известным и предлагаемым способом.

Таблица 1Время растворения, минКоличество токсина в надосадочной жидкости мг/г сухой массыЩелочь (прототип)Щелочь+ восстановитель (новый способ)3060,3±11,0136,3±9,66086,4±6,5156,2±10,5

Предлагаемый способ позволяет сократить время растворения. Например, при растворении в щелочи в течение часа в раствор переходит около 90 мг токсина из 1 г сухой бактериальной биомассы, а в случае щелочь + восстановитель - около 160 мг/г. Таким образом, улучшаются технологические параметры процесса (время), т.к. растворение прошло в течение 0,5 ч.

Кроме того, повышается активность продукта, а именно скорость наступления конечного эффекта при применении, так как продукт не требует активации в кишечнике насекомого. В таблице 2 приведены сравнительные данные о скорости воздействия инсектицидных препаратов на непарного шелкопряда III возраста.

Таблица 2Препарат*Эффективность, % по часам361224Полученный5177296известным    способом    Полученный235893100предлагаемым    способом    (содержит 3%    гидросульфит    натрия)    * Препараты содержат 10% действующего вещества.

Важным результатом снижения времени действия, кроме увеличения % погибших насекомых, является снижение поврежденности растений.

Технический результат предложенной группы изобретений состоит в том, что предлагаемый способ по сравнению с прототипом позволяет снизить время растворения дельта-эндотоксина в 2 раза и более и получить препарат, обладающий большей инсектицидной активностью при одном и том же времени растворения в кишечнике насекомого. При этом содержащийся в препарате дельта-эндотоксин соответствует по активности токсину, приобретшему токсичность в кишечнике насекомого, т.е. он может сразу же действовать на чувствительные клетки кишечника, разрушая их. Это сокращает время начала действия и усиливает общий эффект (смертность насекомых).

Изобретение также позволяет повысить избирательность и эффективность препаратов на основе Bacillus thuringiensis, увеличить выход целевого продукта путем более полного растворения кристаллов дельта-эндотоксина и расширить арсенал средств, используемых для борьбы с вредными насекомыми.

Инсектицидный препарат может быть получен предлагаемым способом практически из любого штамма вида Bacillus thuringiensis, поскольку известно, что все подвиды данного вида микроорганизма продуцируют дельта-эндотоксин. Изобретение реализуется следующим образом.

Пример 1. Глубинное культивирование штамма Вас.thuringiensis subsp. Kurstaki Z-52 осуществляли в рабочих ферментерах при 28-30°С. Затем выделили активную фракцию сепарацией биомассы. Полученная после сепарации пастообразная активная фракция содержит элементы культуральной среды, бактериальные клетки, споры, действующее начало кристаллы дельта-эндотоксина и другие продукты метаболизма. Указанную активную фракцию (осадок) растворяли в водном растворе гидросульфит натрия в концентрации 0,07% в 0,16% растворе едкого натра, при объемном соотношении к растворителю 1:4. После чего отделили осадок сепарацией или центрифугированием и получили щелочной раствор восстановителя, содержащий действующее начало - дельта-эндотоксин в качестве основного компонента. Далее в раствор добавляют сухую сыворотку из расчета 20% на общую массу готового препарата и NaCl. После тщательного перемешивания раствор высушивали путем сублимационной или распылительной сушки.

Получили препарат следующего состава: содержание действующего начала - растворенный дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis - 10%, NaOH - 3%, гидросульфит натрия - 1%, сухая сыворотка 20%, NaCl - остальное. Активность препарата ЕА/мг 14000.

Пример 2. Способ реализуется согласно примеру 1. В качестве растворителя использовали водный раствор гидросульфита натрия в концентрации 0,17% в 0,16%-ном растворе едкого калия. В качестве прилипателя и наполнителя использовали мелассу.

Получили препарат следующего состава: содержание действующего начала - растворенный дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis - 20%, КОН - 6%, гидросульфита натрия - 8%, меласса - 5%, NaCl - остальное. Активность препарата ЕА/мг 20000.

Пример 3. Способ реализуется согласно примеру 1. В качестве растворителя использовали водный раствор гидросульфит натрия в концентрации 0,1% в 0,16%-ном растворе едкого натрия. В качестве прилипателя и наполнителя использовали рыбий клей размолотый.

Получили препарат следующего состава: содержание действующего начала - растворенный дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis - 15%, NaOH - 5%, гидросульфит натрия - 3%, рыбий клей размолотый - 10%, NaCl - остальное. Активность препарата ЕА/мг. 19000.

Пример 4. Способ реализуется согласно примеру 1. В качестве растворителя использовали водный раствор гидросульфита натрия в концентрации 0,1% в 0,16%-ном растворе едкого калия. В качестве прилипателя и наполнителя использовали гидролизованный хитин.

Получили препарат следующего состава: содержание действующего начала - растворенный дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis -15%, КОН - 6%, гидросульфит натрия - 5%, гидролизованный хитин - 3%, NaCl - остальное. Активность препарата ЕА/мг 19000.

Пример 5. Способ реализуется согласно примеру 1. В качестве растворителя использовали водный раствор гидросульфита натрия в концентрации 0,07% в 0,16%-ном растворе едкого калия. В качестве прилипателя и наполнителя использовали сухую пахту.

Получили препарат следующего состава: содержание действующего начала - растворенный дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis - 10%, КОН - 6%, гидросульфит натрия - 3%, сухая пахта - 20%, NaCl - остальное. Активность препарата ЕА/мг 14000.

Пример 6. Способ реализуется согласно примеру 1. В качестве растворителя использовали водный раствор гидросульфита натрия в концентрации 0,17% в 0,16%-ном растворе едкого калия. В качестве прилипателя и наполнителя использовали пектин из свекловичного или яблочного жома.

Получили препарат следующего состава: содержание действующего начала - растворенный дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis - 20%, КОН - 8%, гидросульфит натрия - 6%, пектин из свекловичного или яблочного жома - 3%, NaCl - остальное. Активность препарата ЕА/мг 20000.

В лабораторных условиях сравнивали физические свойства известного (RU 2062577) и полученного согласно примерам 1-6 инсектицидных препаратов. Опыты проводили в пяти повторностях. Сравнивали смачиваемость и стабильность рабочей суспензии нового бактериального препарата и известного препарата. Оценку смачиваемости и стабильности препарата производили по известной методике (см. Штерншс М.В. О методах оценки физических показателей бактериальных инсектицидов // с.-х. биология, 1985, №9, с.120-123). Достоверность полученных результатов оценивали методом дисперсионного анализа. Результаты приведены в табл.3.

Приведенные в таблице 3 данные показывают, что адгезивная способность и стабильность рабочей суспензии бактериального препарата, полученного предлагаемым способом, не уступает таковым у препарата, полученного известным способом. Обусловлено это тем, что в качестве наполнителя и прилипателя также использованы биологически и химически инертные компоненты, повышающие адгезивную способность препарата. Кроме того, высокие физические свойства препарата обусловлены еще и тем, что частицы полученного целевого продукта меньшего размера, чем частицы известного продукта, поскольку способ позволяет достичь более полного растворения кристаллов. Следовательно, предлагаемый способ позволяет расширить возможность использования в качестве стабилизаторов и прилипателей при получении инсектицидных препаратов отходов пищевых и микробиологических производств.

В лабораторных условиях определяли инсектицидную активность бактериального инсектицидного препарата, полученного заявляемым способом, по сравнению с препаратом, полученным известным способом, на гусеницах капустной белянки. Опыты проводили в пяти повторностях. Гусениц заражали перорально и высаживали в садки на корм по 15 особей в каждый. Достоверность полученных результатов оценивали методом дисперсионного анализа. Результаты представлены в табл.4. Полученный предлагаемым способом препарат обладает значительно большей инсектицидной активностью, чем препарат, полученный известным способом. Концентрации предлагаемого препарата в рабочей суспензии, обеспечивающие 100% гибель гусениц, в 2 раза меньше, чем концентрация известного препарата. Это позволяет значительно снизить нормы расхода препарата и повысить экономическую эффективность при применении инсектицидных средств.

Анализ данных табл.4 также показывает, что в препарат нецелесообразно вводить больше 20% действующего начала, т.к 100% гибель гусениц достигается и при такой концентрации. Увеличение концентрации также приведет к удорожанию препарата. При концентрации препарата в рабочей суспензии менее 10% значительно снижается его эффективность.

Инсектицидную активность препарата, полученного заявляемым способом, сравнивали с инсектицидной активностью препарата, полученного известным способом, определяя концентрацию, вызывающую гибель на третьи сутки 50% насекомых (гусениц капустной белянки, участвующих в опыте (ЛК50). Результаты приведены в таблице 5.

Как следует из данных, приведенных в табл.5, препараты, полученные предлагаемым способом, более эффективны по сравнению с препаратом, полученным известным способом.

Летом 2001 препарат был испытан для защиты леса от чешуекрылых листогрызущих вредителей (шелкопряд монашенка) против гусениц 1-2 возраста на сосне с примесью лиственных пород. Площадь испытаний составила 15 га. Использовали препараты, полученные по примерам 1-3. Для обработок использовали аэрозольный генератор ГАРД-М-20. Норма расхода препаратов по примерам составляла 0,01 кг/га при расходе рабочей жидкости 0,2 л/га. Действие препарата сравнивали с действием бактериального лепидоцида (норма расхода 1 кг/га) и химического Децис (0,05-0,06 кг/га). Препарат, полученный по примеру 2, показал при учетах на 5-е сутки эффективность 92%, лепидоцид - 80% и Децис - 92%. Испытания подтвердили высокую инсектицидную активность препарата, сравнимую с действием химических инсектицидов. В ходе испытаний были также получены данные о безопасности препарата для полезной энтомофауны (перепончатокрылых насекомых опылителей и энтомофагов). В результате обработки не пострадал ни один из установленных видов, тогда как в результате действия химического препарата Децис исчезло 10 видов из 17. Экономическая оценка показала, что применение предлагаемого препарата аэрозольным способом оказалось в 4-7 раз дешевле, чем лепидоцида тем же способом и в 1400 раз дешевле, чем авиационным способом Известно, что недостаточно эффективные дозы препаратов, а также продолжительность их действия приводят к тому, что часть пораженных насекомых выживает, что приводит к накоплению мутаций в популяциях насекомых. При этом эффективность от последующих применений подобных препаратов снижается и способствует повышению адаптационных способностей у насекомых. Предлагаемое изобретение позволяет получить высокоэффективный быстродействующий инсектицидный препарат. А также повысить избирательность и эффективность препаратов на основе Bacillus thuringiensis, увеличить выход целевого продукта путем полного растворения кристаллов дельта-эндотоксина и расширить арсенал средств, используемых для борьбы с вредными насекомыми.

Таблица 3
Физические свойства препаратовПрепаратФизические свойствасмачиваемость, садгезивная способность, %стабильность рабочей суспензии, %препарат по прототипу606689препарат по примеру 1536490препарат по примеру 2607092препарат по примеру 3566593препарат по примеру 4506789препарат по примеру 5506089препарат по примеру 6536590

Таблица 4
Инсектицидная активность бактериального препарата, полученного заявляемым способом, на гусеницах капустной белянки.ПрепаратНеобходимая концентрация препарата в рабочей суспензии, %Гибель гусениц по суткам в зависимости от концентрации рабочей суспензии, %I-суткиIII-суткипрепарат по0,024885прототипу0,0576100препарат по0,015084примеру 10,02578100препарат по0,017490примеру20,02597100препарат по0,017088примеру 30,02589100препарат по0,016987примеру40,02587100препарат по0,016893примеру 50,02595100препарат по0,0188100примеру 60,025100100

Таблица 5
Данные по определению концентрации, вызывающей гибель на третьи сутки 50% насекомых (гусениц капустной белянки (ЛК50)).ПрепаратЛК50, % на III-сутки Х10^-3препарат по прототипу0,4препарат по примеру 10,08препарат по примеру 20,02препарат по примеру 30,15препарат по примеру 40,14препарат по примеру 50,14препарат по примеру 60,14препарат по примеру 70,06препарат по примеру 80.14

Изобретение относится к микробиологической промышленности, к производству средств защиты растений от вредных насекомых. Предложен способ получения инсектицидного препарата и препарат на основе бактерий Bacillus thuringiensis. Способ включает культивирование бактерий Bacillus thuringiensis, выделение из биомассы дельта-эндотоксина путем введения растворителя, удаление осадка и смешивание раствора с наполнителем и прилипателем с дальнейшим высушиванием целевого продукта. Инсектицидный препарат, полученный предложенным способом, имеет следующий состав (мас.%): действующее начало - растворенный дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis - 10-20%, щелочь (NaOH или КОН) - 3-8%, восстановитель - гидросульфит натрия - 1-8%, прилипатель - стабилизатор рабочей суспензии - меласса, или сухая пахта, или сыворотка, или гидролизованный хитин, или рыбий клей размолотый, или пектин из свекловичного или яблочного жома - 3-20%, наполнитель, например NaCl, - до 100%. Способ позволяет получить высокоэффективный быстродействующий инсектицидный препарат. 2 н.п. ф-лы, 5 табл.

1. Способ получения инсектицидного препарата, включающий культивирование бактерий Bacillus thuringiensis, выделение из биомассы дельта-эндотоксина путем введения растворителя, удаление осадка и смешивание раствора с наполнителем и прилипателем с дальнейшим высушиванием целевого продукта, отличающийся тем, что перед выделением из биомассы дельта-эндотоксина из нее выделяют активную фракцию - осадок, который растворяют в водном растворе восстановителя в щелочи, при этом в качестве восстановителя используют гидросульфит натрия в концентрации 0,07-0,17%, а в качестве прилипателя используют гидролизованный хитин, или мелассу, или сухую пахту, или сыворотку, или рыбий клей размолотый, или пектин из свекловичного или яблочного жома.2. Инсектицидный препарат на основе бактерий Bacillus thuringiensis, содержащий в качестве действующего начала растворенный дельта-эндотоксин, а в составе целевых добавок растворитель, прилипатель-стабилизатор, наполнитель, отличающийся тем, что получен согласно способу по п.1 и имеет следующий состав, мас.%:

Действующее начало - растворенный дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis10-20%Щелочь-NaOH или КОН3-8%Восстановитель - гидросульфит натрия1-8%Прилипатель - стабилизатор рабочей суспензии - меласса, или сухая пахта, или сыворотка, или гидролизованный хитин, или рыбий клей размолотый, или пектин из свекловичного или яблочного жома3-20%НаполнительДо 100%