11β -АЦИЛОКСИ- 17α -ГИДРОПЕРОКСИ- 16α -МЕТИЛПРЕГНАНЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ МЕСТНОЙ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 1995 года по МПК C07J5/00 A61K31/57 

Изобретение относится к химии и медицине и касается новых химических соединений - группы гидроперекисей ряда прегнана, содержащих в 11-положении молекулы сложноэфирную группировку, а именно 11β-ацилокси-17α-гидроперокси-16 α-метилпрегнанов общей формулы 1,
где R₁ и R₂ - ацетоксигруппы; х - атом фтора,
R₁ и R₂ - ацетоксигруппы; х - атом водорода;
R₁ - ацетоксигруппа; R₂ - пропионилоксигруппа; х - атом фтора,
R₁ - ацетоксигруппа; R₂ - гептаноилоксигруппа; х - атом фтора,
R₁ и R₂ - пропионилоксигруппы; х - атом фтора, обладающих местной противовоспалительной активностью.

Наиболее близким аналогом по структуре является 17 α-гидроперекись ряда прегнана формулы А
который проявляет противовоспалительную активность, но обладает отчетливым резорбтивным действием.

Наиболее близким аналогом заявляемого соединения по биологической активности является 17α-гидроперекись ряда прегнана формулы Б
Соединение Б обладает местной противовоспалительной активностью.

Основным недостатком соединения Б является относительно невысокая степень указанной активности (2).

Цель изобретения - новые производные группы 17α-гидроперекисей ряда прегнана, содержащие в 11 положении молекулы сложноэфирную группу и обладающие более выраженной местной противовоспалительной активностью.

Поставленная цель достигается химической структурой новых соединений ряда прегнана, а именно 11β-ацилокси-17α-гидроперокси-16α-метилпрегнанов общей формулы 1, обладающих местной противовоспалительной активностью.

Заявляемые соединения представляют собой кристаллические вещества белого или белого с желтоватым оттенком цвета, не растворимые в воде, хорошо растворимые в смеси низшего спирта и хлоруглеводорода (хлороформа или хлористого метилена).

Структура заявляемых соединений подтверждена элементным анализом и спектральными данными, чистота - методом тонкослойной хроматографии (ТСХ).

Способ получения заявляемых соединений заключается в том, что исходные Δ¹⁶-20-кетопрегнаны подвергают взаимодействию с метилмагнийбромидом в присутствии катализатора CuCl (2-2,5 мас.%) в среде ацетонитрила и ароматического углеводорода (толуола, бензола), взятых в соотношении (1-1,5) - (1,5-2) при (-15)-(-30)^оС с последующим разложением реакционной массы хлористым аммонием при (+2)-(-2)^оС.

Целевые продукты выделяются высаживанием из органического слоя (1).

В качестве исходных Δ¹⁶-20-кетопрегнанов использованы соединения общей формулы II
где а) R₁ и R₂ - ацетоксигруппы; х - атом фтора,
б) R₁ и R₂ - ацетоксигруппы; х - атом водорода,
в) R₁ - ацетоксигруппа; R₂ - пропионилоксигруппа; х - атом фтора,
г) R₁ - ацетоксигруппа; R₂ - гептаноилоксигруппа; х - атом фтора,
д) R₁ и R₂ - пропионилоксигруппы; х - атом фтора.

Исходные соединения IIa и IIб описаны в литературе (3, 4), соединения IIв, IIг и IIд новые, в литературе не описаны.

Соединения IIв и IIг получены известным способом - путем избирательного гидролиза 21-ацетоксигруппы соединения IIа и последующей этерификацией свободного гидроксила; имеют т. пл. 282^оС (с разложением) и 184,5-186^оС (соответственно); не растворимые в воде, плохо растворимые в эфире, ацетоне, хорошо растворимые в смеси низших спиртов и хлоруглеводородов.

Соединение IIд получено исчерпывающей этерификацией известного 11β, 21-дигидрокси-9α-фторпрегна-1,4,16-триен- 3,20-диона (5) и представляет собой белый кристаллический порошок с т.пл. 254,5-256^оС.

П р и м е р 1. Получение 11β, 21-диацетокси-17α-гидроперокси-16α-метил-9α-фторпрегна-1,4-диен-3,20-диона (Ia).

К раствору 10 г (0,025 г/м) 11β,21-диацетокси-9α -фторпрегна-1,4,16-триен-3,20-диона в 260 мл смеси ацетонитрила и толуола (1:1,6), содержащему 0,23 г CuCl, прибавляют при перемешивании и температуре (-20)-(-25)^оС 28 мл реактива Гриньяра, приготовленного в растворе тетрагидрофурана (≈1,7 н.). Через 15 мин реакционную массу выливают при интенсивном перемешивании и температуре (-2)-(+2)^оС в 500 мл 20%-ного водного раствора хлорида аммония. Смесь выдерживают 20 мин при этой же температуре. Органический слой отделяют, промывают 100 мл 20%-ного водного раствора хлорида аммония и водой. К органическому слою при перемешивании и температуре 0-2^оС постепенно приливают 200 мл гексана, перемешивают 2 ч при этой же температуре. Осадок отфильтровывают.

Получают 9,44 г технического продукта Ia.

После очистки из хлористого метилена и гексана (кипячение с 4-кратным количеством хлористого метилена и высаживание 8-кратным количеством гексана) получают 7,87 г (71,1%) 11β,21-диацетокси-17α-гидроперокси-16α-метил- 9α-фторпрегна-1,4-диен-3,20-диона (Ia) в виде белого с желтоватым оттенком кристаллического порошка, т.пл. 190^оС с разложением, [α]_D²⁰ +107,6^о (1%-ный раствор в хлороформе).

Найдено,%: C 64,23; H 6,88.

C₂₆H₃₃FO₈.

Вычислено, %: С 63,4; Н 6,75.

ИК-спектр, ν , см^-1: 3140 (ООН), 1740, 1670 (С=0), 1615, 1605 (С=С), 1230, 1210 (С-0).

П р и м е р 2. Получение 11β,21-диацетокси-17α-гидроперокси-16α -метилпрегна-1,4-диен-3,20-диона (Iб).

Исходя из 10 г (0,0234 г-м) 11β ,21-диацетоксипрегна-1,4,16-триен-3,20-диона в условиях, аналогичных примеру 1, проводят реакцию Гриньяра и аутоокисления. Продукт выделяют упариванием органического слоя досуха при температуре не выше 40^оС. Остаток растирают с гексаном, осадок отфильтровывают, промывают гексаном.

Получают 8,92 г (79,9%) 11β,21-диацетокси-17α-гидроперокси-16α -метилпрегна-1,4-диен-3,20-диона (I, б) в виде кристаллического порошка, т.пл. 163^оС с разложением, [α]_D²⁰ +109^о (1%-ный раствор в хлороформе).

Найдено,%: С 65,73; Н 7,51.

С₂₆H₃₄O₈.

Вычислено,%: С 65,80; Н 7,22.

ИК-спектр, ν,см-1: 3140(ООН), 1750, 1740, 1730 (С=О), 1660 (С=О), 1620, 1600 (С=С).

П р и м е р 3. Получение 11β-ацетокси-21-пропионилокси-17α-гидроперокси-16α- метил-9α-фторпрегна-1,4-диен-3,20-диона (Iв).

Исходя из 2,65 г (0,0058 г/м) 11β-ацетокси-21-пропионилокси-9α -фторпрегна-1,4,16-триен-3,20-диона в условиях, аналогичных примеру 1, получают 1,84 г (62,9%) 11β-ацетокси-21-пропионилокси-17 α-гидроперокси-16 α-метил-9α -фторпрегна-1,4-диен-3,20-диона (Iв) в виде белого кристаллического порошка, т. пл. 153^оС с разложением, [α]_D²⁰ +105^о (1%-ный раствор в хлороформе).

Найдено,%: С 63,63; Н 6,89.

С₂₇Н₃₅О₈F.

Вычислено, %: С 64,01; Н 6,96.

П р и м е р 4. Получение 11β-ацетокси-21-гептаноилокси-17α -гидроперокси-16α - метил-9α-фторпрегна-1,4-диен-3,20-диона (Iг).

Исходя из 3,18 г (0,0062 г-м) 11β-ацетокси-21-гептаноилокси-9α-фтопрегна-1,4,16- триен-3,20-диона в условиях примера 1 получают 1,75 г (50,2%) 11β-ацетокси-21-гептаноилокси-17α -гидроперокси-16α-метил- 9 α-фторпрегна-1,4-диен-3,20-диона (Iг) в виде белого кристаллического порошка, т.пл. 145^оС с разложением, [α]_D²⁰ +96,2^о (1%-ный раствор в хлороформе).

Найдено,%: С 65,48; Н 7,63.

С₃₁Н₄₃О₈F.

Вычислено,%: С 66,2; Н 7,7.

П р и м е р 5. Получение 11β,21-дипропионилокси-17α-гидроперокси-16α-метил- 9 α-фтопрегна-1,4-диен-3,20-диона (Iд).

Исходя из 2,6 г (0,0055 г-м) 11β,21-дипропионилокси-9α -фторпрегна-1,4,16-триен-3,20-диона в условиях примера 1 получают 1,5 г (52,4%) 11β, 21-дипропионилокси-17α-гидроперокси-16α-метил- 9α-фторпрегна-1,4-диен-3,20-диона (Iд), в виде белого кристаллического порошка, т.пл. 168,5^оС с разложением, [α]_D²⁰ +119,8^о (С=1 в растворе метанола).

Найдено,%: С 64,59; Н 7,10,
С₂₈Н₃₇FO₈.

Вычислено,%: С 64,60; Н 7,16.

С и н т е з и с х о д н ы х с о е д и н е н и й.

П р и м е р 6. Получение 11β-ацетокси-21-пропионилокси-9α -фторпрегна-1,4,16-триен-3,20-диона (IIв).

К суспензии 4 г (0,0099 г-м) 11β-ацетокси-21-гидрокси-9α -фторпрегна-1,4,16-триен-3,20-диона в 16 мл сухого пиридина при перемешивании и комнатной температуре добавляют по каплям 4 мл (0,03 г-моля) ангидрида пропионовой кислоты. Реакционную массу выдерживают 40 мин и выливают при перемешивании в 160 мл 5%-ного раствора соляной кислоты при 0-5^оС. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают водой.

Получают 3,77 г (80,2%) 11β-ацетокси-21-пропионилокси-9α -фторпрегна-1,4,16-триен-3,20-диона (IIв) в виде белого кристаллического порошка, т.пл. 282^оС с разложением, [α]_D²⁰ +152,6^о (1%-ный раствор в метаноле), пригодного для синтеза соединения Iв.

П р и м е р 7. Получение 11β-ацетокси-21-гептаноилокси-9α -фторпрегна-1,4,16-триен-3,20-диона (IIг).

К раствору 3,8 г (0,0094 г-м) 11β-ацетокси-21-гидрокси-9α -фторпрегна-1,4,16-триен-3,20-диона в 20 мл смеси пиридина и бензола (1:2) при перемешивании и температуре не выше 10^оС прикапывают 4,6 мл смеси хлорангидрида гептановой кислоты и бензола (1:1,3). Реакционную массу выдерживают 1 ч при этой же температуре, затем выливают в 100 мл 5%-ного раствора соляной кислоты. Органический слой отделяют, промывают водой до нейтральной реакции, упаривают растворитель до небольшого объема и остаток наносят на колонку с силикагелем. Элюируют бензолом. Растворитель упаривают, остаток растирают с эфиром, осадок отфильтровывают.

Получают 3,46 г (56,4%) 11β-ацетокси-21-гептаноилокси-9α -фторпрегна-1,4,16-триен-3,20-диона (IIг) в виде белого кристаллического порошка, т.пл. 184,5-188^оС, [α ] _D²⁰ +137,9^о (1%-ный раствор в метаноле), пригодного для синтеза соединения Iг.

П р и м е р 8. Получение 11β,21-дипропионилокси-9α -фторпрегна-1,4,16-триен-3,20-диона (IIд).

К смеси 50 мл хлористого метилена и 25 мл (0,19 г-моля) пропионового ангидрида при перемешивании и температуре 0-5^оС прикапывают 0,7 мл 57%-ного раствора хлорной кислоты, затем постепенно при этой же температуре загружают 5 г (0,014 г-м) 11β,21-дигидрокси-9α-фторпрегна-1,4,16-триен-3,20-диона. Реакционную смесь выдерживают 1 ч при температуре не выше 10^оС, затем выливают в 660 мл 3%-ного раствора аммиака при температуре не выше 10^оС и выдерживают 1,5 ч.

Органический слой отделяют, промывают водой, упаривают досуха. Остаток растирают с ацетоном, отфильтровывают осадок.

Получают 5,4 г (82,4%) 11β,21-дипропионилокси-9α -фторпрегна-1,4,16-триен-3,20-диона (IIд) в виде кристаллического порошка, т.пл. 254,5-256^оС, [α]_D²⁰ +146,6^о (1%-ный раствор в метаноле), пригодного для синтеза соединения Iд.

Изучение биологической активности заявляемых соединения.

В лаборатории фармакологии ЦХЛС-ВНИХФИ изучено влияние заявляемых соединений при местном применении на хроническое пролиферативное воспаление и оценены некоторые системные глюкокортикостероидные эффекты у крыс. Активность и токсичность сравнивали с соединением Б. В результате проведенных экспериментов было отобрано соединение Ia, проявившее наиболее высокую противовоспалительную активность, и исследовано более подробно с точки зрения его безопасности.

В частности, изучено влияние в средней эффективной противовоспалительной дозе на функциональную активность надпочечников, содержание глюкозы в крови и гликогена в печени, соотношение Na⁺ / K⁺ в моче.

На кафедре молекулярной фармакологии и радиобиологии 2 ММИ им. Н.И.Пирогова оценено воздействие соединения Ia на гормональную функцию вилочковой железы.

Влияние на хроническое пролиферативное воспаление у крыс при местном применении заявляемых соединений.

Противовоспалительную активность и резорбтивное действие заявляемых соединений при местном введении изучали по методу (6).

В опытах использовали адреналэктомированных (7) крыс-самцов линии Вистар массой 80-100 г. Животных содержали на стандартной диете и поили 1%-ным раствором NaCl. Через 1 неделю после операции крысам подкожно имплантировали два стерильных фетровых шарика (по одному в каждую подмышечную впадину) массой 8 мг, предварительно напитанные заявляемыми соединениями (доза 600 мкг/животное). На восьмой день после введения имплантатов животных забивали ингаляцией углекислого газа, гранулемы извлекали и взвешивали после высушивания при 80^оС в течение 24 ч. О противовоспалительном действии испытываемых веществ судили по их способности уменьшать массу высушенной грануляционной ткани. В тех же экспериментах с целью изучения побочного действия определяли влияние заявляемых соединений на массу тимуса и на прирост массы тела животных. Активность и токсичность заявляемых соединений сравнивали с соединением Б. Результаты представлены в табл.1.

Из табл.1 видно, что заявляемые соединения обладают выраженным местным противовоспалительным действием. Наименее активное соединение Iб было сравнимо с соединением Б - антипролиферативный эффект составил 35%. Заявляемые соединения Iв, Iг и Iд, снижая массу сухой гранулемы на 50-73%, продемонстрировали более выраженный по сравнению с соединением Б противовоспалительный эффект. Самым активным оказалось соединение Ia, которое снижало массу гранулемы на 87%.

Что касается системных эффектов, то в значительной степени они наблюдались только в группе животных, получавших местно соединение Iд: так, по сравнению с контролем, привес уменьшался на 75%, а масса тимуса - на 84%. Все остальные заявляемые вещества, как и соединение Б, не влияли на привес крыс: соединение Ia и Iв не обладали тимолитическим действием, а соединения Iб и Iд незначительно (на 30%) снижали массу тимуса.

Соединение Ia, проявившее наиболее отчетливое противовоспалительное действие и не оказавшее системных эффектов, было исследовано подробнее.

В табл. 2 представлены средние эффективные противовоспалительные и резорбтивные дозы (ЭД₅₀) и вычисленные на основании них терапевтические индексы для соединения Ia.

Из табл. 2 видно, что соединение Ia не обладает катаболическим и тимолитическим действием даже в максимальной испытанной дозе 1200 мкг на животное, в то время как масса воспалительной гранулемы на 50% снижается уже при дозе 152 мг на животное. Терапевтические индексы, характеризующие безопасность соединения Ia, демонстрируют, что его эффективные противовоспалительные дозы превышают токсические почти в 8 раз.

Определение влияния глюкокортикоидов на углеводный и электролитный обмен.

Опыты проводили на адреналэктомированных нелинейных крысах-самцах массой 120-140 г. О глюкокортикоидной активности соединения Ia судили по его влиянию на содержание гликогена в печени и глюкозы в крови, показателем минералокортикоидного действия являлась экскреция с мочой ионов натрия и калия. Стероид применяли местно (в фетровом шарике) в средней эффективной противовоспалительной дозе. Количественный анализ глюкозы выполняли с помощью набора реактивов "Биола-Ла-Тест" (Чехословакия), гликогена - по методу (8), ионов натрия и калия методом пламенной фотометрии (9).

Результаты экспериментов представлены в табл.3.

Из табл.3 видно, что соединение Ia при местном применении не влияет на углеводный обмен и электролитный баланс организма, т.е. не вызывает характерных для глюкокортикоидных препаратов побочных эффектов.

Оценка функциональной активности коры надпочечников крыс.

Функциональную активность коры надпочечников оценивали по содержанию кортикостерона в плазме крови у крыс, которое определяли по методу (10) в модификации (11).

Опыты проводили на крысах-самцах линии Вистар массой 100-120 г. Ход определения включал двухэтапную экстракцию кортикостерона, обработку флюорогенным реактивом и флюориметрию.

Измерения проводили на флюоресцентном спектрофотометре МРF - 2А HitAchi (Япония) при длинах волн возбуждения и эмиссии соответственно 470 и 520 нм.

Соединение Iа применяли местно (в фетровом шарике) в средней эффективной противовоспалительной дозе. Показателем отрицательного резорбтивного действия являлось снижение концентрации кортикостерона в плазме крови, которое регистрировали через 1, 3 и 7 суток после применения заявляемого соединения.

Результаты представлены в табл.4.

Из табл.4 видно, что соединение Iа не отличается от контроля по исследованным показателям, что может свидетельствовать об отсутствии угнетающего действия на функцию надпочечных желез.

Влияние на эндокринную функцию вилочковой железы.

Работа выполнена на крысах-самцах линии Вистар массой 80-100 г и мышах линии С 57 Bl/6 массой 12-14 г. Исследовано резорбтивное действие соединения Iа при применении в средней эффективной противовоспалительной дозе в течение 7 сут после местного введения. Через 1 и 7 сут после введения стероида животных декапитировали под эфирным наркозом, кровь собирали в пластиковые пробирки и центрифугировали при 800 g в течение 10 мин. Затем 1 мл сыворотки подвергали ультрафильтрации с использованием фильтров "Amicone". Ультрафильтрат до измерения хранили при -25^оС. Определение содержания тимусного сывороточного фактора (ТСФ) осуществляли по методике (1). Суспензию клеток селезенки получали от мышей С57В1/6, тимэктомированных за 10 сут до эксперимента. К 100 мкл суспензии спленоцитов, приготовленных на среде 199, добавляли 100 мкл цельного и серийно разведенного средой 199 (1:2 - 1:8) ультрафильтрата, и инкубировали 1 ч при 37^оС. Затем в пробы вносили 200 мкл раствора азатиоприна на среде 199 до конечной концентрации 12,5 мкг/мл, инкубировали 1 ч при 37^оС, после чего добавляли 100 мкл 0,1%-ной суспензии эритроцитов барана, центрифугировали и помещали в холодильник (0-4)^оС. Через 16-18 ч пробы ресуспендировали и подсчитывали количество розеток в двух сетках камеры Горяева. За титр ТСФ принимали последнее разведение сыворотки, вызывающее 50%-ное подавление розеткообразования. Результаты выражали в log₂ титра с учетом разведения пробы суспензии клеток.

Результаты представлены в табл.5.

Из табл.5 видно, что заявляемое соединение не влияло на содержание тимусного сывороточного фактора в плазме, что свидетельствует об отсутствии у него резорбтивного действия.

Таким образом, впервые в ряду 11-замещеных 17α-гидроперокси-16α -метилпрегнанов обнаружены производные, оказывающие отчетливое местное противовоспалительное действие. Соединение Ia, у которого антипролиферативная активность существенно превалирует над системными побочными эффектами, было изучено более подробно. Результаты исследования свидетельствуют о том, что в средней эффективной противовоспалительной дозе соединение Ia не проявляет характерных для глюкокортикостероидов побочных эффектов, обусловленных резорбцией активного вещества с места нанесения, что имеет существенное значение для создания безопасного препарата для местной терапии воспалительных заболеваний.

Использование: в качестве местного противовоспалительного средства. Сущность изобретения: продукт - 11 b - ацилокси - 17 a - гидроперокси - 16-a - метилпрегнаны ф-лы 1, где а) R₁ и R₂ - ацетокси; X - H; б) R₁ и R₂ - ацетокси; X - F; в) R₁ - ацетокси; R₂ - пропионилокси; X - F; г) R₁ - ацетокси; R₂ - гептаноилокси; X - F; д) R₁ и R₂ - пропионилокси; X - F. Реагент 1: соответствующие Δ¹⁶-кетопрегнаны. Реагент 2: метилмагнийбромид в присутствии CuCl в среде ацетонитрила и смеси толуола/бензола при (-15) - (-30)°С. Реагент 3: NH₄Cl Структура ф-лы 1 см. рис.

11β -АЦИЛОКСИ- 17α -ГИДРОПЕРОКСИ- 16α -МЕТИЛПРЕГНАНЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ МЕСТНОЙ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ.

11β - Ацилокси - 17α - гидроперокси - 16α - метилпрегнаны общей формулы

где а) R₁ и R₂ - ацетоксигруппы, X - фтор;
б) R₁ и R₂ - ацетоксигруппы, X - водород;
в) R₁ - ацетоксигруппа, R₂ - пропионилоксигруппа, X - фтор;
г) R₁ - ацетоксигруппа, R₂ - гептаноилоксигруппа, X - фтор;
д) R₁ и R₂ - пропионилоксигруппы, X - фтор,
обладающие местной противовоспалительной активностью.