УСТРОЙСТВО ДЛЯ РЕГИСТРАЦИИ ПРИ КОМНАТНОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН Российский патент 1995 года по МПК G01N21/64 G01N21/76 

Изобретение относится к техническим средствам для проведения люминесцентного анализа при исследованиях в биологии, медицине и др. и может быть использовано преимущественно для изучения структурно-функциональной организации биологических мембран, в том числе для решения научно-практических и фундаментальных задач гигиены, фармакологии и токсикологии, сельского хозяйства, экологии и т.д.

Одним из важнейших направлений в биологии и медицине является изучение биологических мембран - многокомпонентных надмолекулярных систем, обеспечивающих структурную обособленность и целостность клеток и их внутриклеточных органелл. Практически все фундаментальные жизненные процессы - такие как биоэнергетика, деление клеток, транспорт веществ, возбудимость и проведение нервного импульса, иммунный ответ, двигательная активность и т.д. - осуществляются с прямым или косвенным участием биологических мембран. Как единое функциональное образование они определяют топографию и внутреннее устройство ферментов, полиферментных комплексов и через межмолекулярные взаимодействия регулируют уровень их каталитической активности и специфичности. Благодаря этому разнообразные аспекты функциональной активности мембран определяются их структурной организацией и прежде всего структурно-динамическим состоянием основных компонентов мембран - белков и липидов. Для изучения биологических мембран широко используются биофизические методы исследования. К ним относятся и люминесцентные методы: хемилюминесцентный, фосфоресцентный и метод флуоресцентных зондов. Указанные методы обладают исключительно высокой чувствительностью, быстротой анализа и возможностью исследовать мембраны, не вызывая разрушающего действия. Установлено, что биологические мембраны хемилюминесцируют и фосфоресцируют. Хемилюминесценцию связывают с перекисным окислением липидом и полагают, что она содержит информацию об уpовне радикально-цепных реакций, протекающих в мембранах, о степени насыщенности жирных кислот, входящих в состав липидов, об уровне антиоксидантной активности антиоксидантов, контролирующих интенсивность радикально-цепных реакций, и т.д. фосфоресценцию биологических мембран связывают с ароматическими аминокислотами: триптофаном, тирозином и фенилаланином, входящими в состав практически всех белков, в том числе и мембранных, и полагают, что она содержит информацию о временах жизни в триплетном состоянии вышеупомянутых аминокислот, о жесткости их микроокружения, о структурно-динамических свойств мембранных белков, о структурных перестройках в мембране, которые происходят при физико-химических и физиологических воздействиях на клетку, организм и т.д. Важную информацию дает и метод флуоресцентных зондов. С его помощью можно изучать заряд поверхности мембран, состояние воды в примембранном слое, микровязкость, белково-липидные взаимодействия в мембране и т.д. Таким образом, вышеперечисленные три люминесцентных метода дают возможность получить информацию о статистических и динамических аспектах структурной организации биологических мембран. Однако все это предполагает наличие у исследователя трех соответствующих приборов: хемилюминометра, флуориметра и устройства для регистрации фосфоресценции. Отсюда возникает необходимость в разработке такого устройства, в котором были бы совмещены все три вышеупомянутых прибора, т.е. с помощью данного прибора можно было бы регистрировать хемилюминесценцию, фосфоресценцию и флуоресценцию одного и того же образца и в одних и тех же условиях.

Известна импульсная фосфороскопическая установка для измерения люминесценции и поглощения [1] , в состав которой входят источник света, монохроматор, фосфороскоп (с дисками), ФЭУ-38, усилитель постоянного тока, самописец. При этом фосфороскоп содержит корпус с входным и выходным окнами, два диска, установленных на валу фосфороскопа и имеющих соответствующие окна, камеру для образца, установленную на оптическом пути возбуждающего света. Между ФЭУ и выходным оком фосфороскопа установлен светофильтр.

К недостаткам данной установки следует отнести низкую светозащиту ФЭУ, невозможность регистрирования слабых сигналов хемилюминесценции и фосфоресценции невозможность регистрировать фосфоресценцию биологических мембран при комнатной температуре, отсутствие перемешивания суспензии биологических мембран.

Наиболее близко по технической сущности к предлагаемому устройству является автоматизированная система для регистрации параметров фосфоресценции при комнатной температуре клеток и их компонентов [2], которая включает в себя осветитель - pтутную лампу ДРК-120 А, монохроматор ЗМГ-3, фосфороскоп с вращающимися дисками, двойной монохроматор ДФС-12, фотоумножитель ФЭУ-39 А, ультракриостат для охлаждения ФЭУ, резонансный усилитель опорного сигнала У2-6, усилитель-повторитель, логарифмический усилитель, быстродействующий потенциометр Н3021-1, АЦП, интерфейс, микроЭВМ "Электроника ДЗ-28", цифропечатающее устройство.

К недостаткам данной системы следует отнести следующее. Прибор регистрирует только фосфоресцентное излучение биологических мембран и не позволяет наблюдать хемилюминесценцию и флуоресценцию того же самого объекта исследования. Наблюдение фосфоресценции возможно лишь в прозрачных средах, так как прохождение возбуждающего света через исследуемый образец является сквозным, что не позволяет изучать мутные растворы и твердые непрозрачные объекты. Отсутствует механизм перемешивания жидких растворов. Нет приспособления для ввода в измерительную кювету в процессе регистрации фосфоресценции веществ-добавок, представляющих интерес для исследования. Для регистрации фосфоресценции необходимо из раствора с биологическим образцом удалить кислород - тушитель фосфоресценции и флуоресценции.

Целью изобретения является расширение функциональных возможностей устройства за счет совмещения в нем трех соответствующих устройств для регистрации при комнатной температуре фосфоресценции, хемилюминесценции и флуоресценции с автоматизацией всех процессов регистрации, что позволяет уменьшить динамическую ошибку измерения путем регистрации с одного образца трех характеристик люминесценции, а также снижение расхода экспериментального материала и материалоемкости.

Цель достигается тем, что в устройстве для регистрации при комнатной температуре фосфоресценции, хемилюминесценции и флуоресценции биологических мембран, включающий источник возбуждающего света, монохроматор, фосфороскоп с вращающимися дисками, кварцевую кювету, фотоэлектронный умножитель (ФЭУ), измерительную электрическую систему, в фосфороскопе дополнительно установлены зеркало, два диска, которые с имеющимися дисками образуют две пары. Эти пары дисков установлены на вращающемся валу фосфороскопа, причем пара дисков со стороны монохроматора формирует импульсы возбуждающего света, а пара со стороны ФЭУ позволяет регистрацию фосфоресценции в промежутке между импульсами возбуждающего света. При этом между дисками в каждой паре введена неподвижная пластина с соответствующим оптическим окном, обеспечивающая защиту ФЭУ от внешнего света и регистрацию фосфоресценции и хемилюминесценции в режиме счета фотонов. Кроме того, фосфороскоп дополнительно снабжен вторым ФЭУ для регистрации флуоресценции, установленным перпендикулярно оптической оси возбуждающего света. Кювета выполнена цилиндрической из плавленого кварца и снабжена устройствами перемешивания и дозатором вводимого реагента. При этом фосфороскоп снабжен блоком автоматики с программным управлением.

То, что в фосфороскопе дополнительно установлено зеркало, обеспечивает регистрацию фосфоресценции твердых, жидких, прозрачных, непрозрачных и мутных образцов, что расширяет круг задач, решаемых на практике.

То, что дополнительно введены два диска, которые с имеющимися дисками образуют две пары, установленные на вращающемся валу фосфороскопа, при этом между дисками в каждой паре введена неподвижная пластина с соответствующим оптическим окном, обеспечивает абсолютную светозащиту ФЭУ. Именно данный признак позволяет использовать режим регистрации счета фотонов, тем самым измерять хемилюминесценцию и фосфоресценцию биологических мембран, поскольку для них характерны исключительно низкие уровни хемилюминесценции и фосфоресценции.

То, что фосфороскоп дополнительно снабжен вторым ФЭУ для регистрации флуоресценции, установленным перпендикулярно оптической оси возбуждающего света, расширяет возможности предлагаемого устройства при решении широкого круга практических задач и с применением флуоресцентных зондов обеспечивает комплексное исследование структурно-функционального состояния биологических мембран, взаимно дополняя информацию, получаемую с помощью фосфоресценции.

То, что кювета выполнена цилиндрической из плавленого кварца, обеспечивает регистрацию хемилюминесценции, фосфоресценции и флуоресценции с одного образца. Плавленый кварц характеризуется минимальной фосфоресценцией в спектральной области, где наблюдается фосфоресценция биологических мембран.

То, что кювета снабжена устройством перемешивания, обеспечивает воспроизводимость результатов, так как процесс перемешивания исключает осаждение клеток и внутриклеточных структур в суспензии. Дозатор вводимого реагента позволяет в любой момент регистрации люминесценции биологического образца ввести реагент, представляющий интерес для исследователя, в частности, при изучении индуцированной хемилюминесценции, что расширяет функциональные возможности предлагаемого устройства.

То, что фосфороскоп снабжен блоком автоматики с программным управлением, обеспечивает очередность регистрации хемилюминесценции, фосфоресценции и флуоресценции, стандартизацию измерения, снижение трудозатрат, проведение опытов в динамическом режиме и т.д.

Новым также является то, что введенное зеркало выполнено с алюминиевым покрытием для отражения импульсов возбуждающего света на поверхность образца, просматриваемой со стороны ФЭУ. Данный признак исключает собственную фосфоресценцию зеркала, что нежелательно для регистрации слабых потоков фосфоресценции от биологических мембран.

Кроме того, новым является и то, что кювета совместно с крышкой люка фосфороскопа образует замкнутую систему, что обеспечивает воспроизводимость опытов, так как влияние кислорода внешнего воздуха практически исключается, при этом устройство перемешивания выполнено в виде капилляра, введенного внутрь кюветы. Для перемешивания в кювете жидких растворов применен способ, лежащий в основе барботирования жидкостей газов (воздухом), однако в данном случае борботирование полностью исключается благодаря использования тонкого капилляра, погруженного в раствор кюветы, в котором столбик жидкости полностью не вытесняется воздухом, поступающим импульсами по резиновому шлангу от резиновой груши с клапаном (от пульверизатора) и приводом для формиpования импульсов давления, в результате чего столбик жидкости в капилляре ведет себя как поршенек, сообщая окружающей капилляр жидкости импульс и таким способом осуществляя необходимое перемешивание раствора, при этом капилляр в силу малых размеров не оказывает существенного влияния на сигнал фосфоресценции изучаемого раствора. Применение капилляра вызвано тем, что все твердые вещества в большинстве своем сильно фосфоресцируют под действием ультрафиолета, поэтому непpименим в качестве перемешивающего материала.

Кроме того, с целью исследования характера влияния на параметры люминесценции изучаемого образца различных веществ-добавок в крышке люка фосфороскопа вмонтирована труба для ввода иглы дозатора. При этом конструкция крышки выполнена такой, чтобы полностью исключить попадание внешнего света внутрь камеры фосфороскопа.

Новым является также то, что используется ФЭУ, предназначенный для измерения пороговых потоков света, причем ФЭУ работает в режиме счета фотонов, что позволяет работать вблизи теоретического предела чувствительности, а это дает возможность анализировать тонкие измерения в структурно-функциональной организации биомембран.

Новым также является то, что второй ФЭУ соединен с фосфороскопом через блок, содержащий сменный светофильтр и регулируемую щель. При этом ФЭУ используется в режиме аналогового усиления. Использование таких признаков технического решения обеспечивает оптимальную компоновку трех каналов, соответственно измеряющих хемилюминесценцию, фосфоресценцию и флуоресценцию.

Новым является и то, что блок автоматики включает в себя скоростной и медленный электродвигатели, связанные с валом фосфороскопа, два электромагнита, один из которых соединен со шторкой, перекрывающей в нужный момент времени доступ возбуждающего света к образцу, а друг соединен с муфтой, обеспечивающей в заданный момент времени связь медленного электродвигателя с валом фосфороскопа, при этом скоростной электродвигатель снабжен регулятором и счетчиком оборотов.

Для обеспечения очередности и стандартизации условий регистрации хемилюминесценции, фосфоресценции и флуоресценции изучаемого образца разработан на базе шагового искателя ШИ-25/8 блок программы, который позволяет осуществить пять режимов регистрации в следующей последовательности: регистрацию фосфоресценции кварцевой кюветы без образца; регистрацию спонтанной хемилюминесценции введенного в кювету образца, возбуждающий свет при этом перекрыт шторкой; регистрацию фосфоресценции образца; регистрацию индуцированной хемилюминесценции (введение в кювету индуктора, например двухвалентного железа, перекиси водорода и др.), возбуждающий свет перекрыт шторкой; регистрацию фосфоресценции образца в присутствии вещества (индуктора), введенного в предыдущем режиме. Регистрация флуоресценции образца осуществляется во втором и четвертом режимах по окончании регистрации хемилюминесценции, при этом параллельно регистрируются темновой ток первого ФЭУ и флуоресценция вторым ФЭУ, шторка открыта. В третьем и пятом режимах флуоресценция регистрируется одновременно с фосфоресценцией.

Команды блока программы исполняет блок автоматики, в функции которого входят во втором и четвертом режимах регистрации закрыть (регистрация темнового тока) и открыть первый ФЭУ (регистрация хемилюминесценции исследуемого образца), исполнительными элементами служат медленный электродвигатель и электромагнит, осуществляющий в нужный момент времени с помощью муфты связь между медленным электродвигателем и валом фосфороскопа; в первом, третьем и пятом режимах обеспечить вращение дисков фосфороскопа с заданной скоростью с помощью регулятора скорости, а также закрыть (регистрация фона) и открыть доступ возбуждающего света к образцу (регистрация фосфоресценции и флуоресценции). Исполнительными механизмами служат скоростной электродвигатель и электромагнит, связанный со шторкой.

Таким образом, в предлагаемом техническом решении все перечисленные признаки отличаются как от известного устройства-прототипа, так и от аналогов. Поэтому в предлагаемом устройстве благодаря новым признакам обеспечиваются критерии "Существенные отличия", "Новизна" и "Положительный эффект".

На фиг. 1 представлена структурно-функциональная схема устройства для регистрации при комнатной температуре фосфоресценции, хемилюминесценции и флуоресценции биологических мембран; на фиг.2 изображен фосфороскоп, разрез по вертикальной плоскости через ось вала; на фиг.3 - вид А на фиг.2; на фиг. 4 - вид Б на фиг.2; на фиг.5 показана камера фосфороскопа; на фиг.6 - втулка и связанные с нею вращающиеся диски; на фиг.7 и 8 - кварцевая кювета и крышка люка фосфороскопа в отдельности и в рабочем состоянии соответственно; на фиг. 9 показано перемешивающее устройство; на фиг.10 представлены блок программы и блок автоматики (электрическая функциональная схема).

Предлагаемое устройство (фиг. 1) состоит из источника 1 возбуждающего света, монохроматора 2, служащего для выделения спектрального участка возбуждения фосфоресценции и флуоресценции изучаемого образца, фосфороскопа 3, который обеспечивает разделение во времени процессов облучения образца, находящегося в кварцевой кювете 4, и регистрации его фосфоресценции, ФЭУ 5, служащего для регистрации флуоресценции образца и подсоединенного к фосфороскопу 3 перпендикулярно направлению распространения возбуждающего света с помощью блока 6, содержащего регулируемую оптическую щель 7 и сменный светофильтр 8, аналогового усилителя 9, сигнал с которого поступает на самописец 10, второго ФЭУ 11, предназначенного для регистрации в режиме счета фотонов хемилюминесценции и фосфоресценции изучаемого образца, электрической измерительной системы 12, состоящей из широкополосного усилителя 13, анализатора 14 импульсов, поступающих от усилителя 13, счетчика 15 импульсов с цифропечатающим устройство 16, блока 17 программы, обеспечивающего очередность регистрации хемилюминесценции, фосфоресценции и флуоресценции, блока 18 автоматики, выполняющего команды блока 17 программы, регулятора 19 скорости вращения дисков фосфороскопа, измерителя 20 скорости вращения дисков, мешалки 21.

Фосфороскоп (фиг. 2) содержит вал 22 с подшипниками 23 и 24, два идентичных набора в определенной последовательности металлических квадратных пластин 25. ..38 размером 170х170 мм, крепящихся с помощью винтов к основе 39, представляющей собой полый параллелепипед 170х170х50 мм, выполненный из металлических пластин толщиной 8 мм. Набор состоит из наружной пластины 25 (26) толщиной 8 мм с центральным отверстием для подшипника 23 (24) и оптическим окном 40 (41), двух пластин 27 и 28 (29 и 30) толщиной 3 мм с центральным отверстием диаметром 134 мм, причем внутри пластин 27 и 28 (29 и 30) располагаются светонепроницаемые с оптическим окном вращающиеся диски 31 и 32 (33 и 34) диаметром 130 мм, пластины 35 (36) толщиной 1 мм с центральным отверстием 24 мм и окном, соответствующим по размерам и форме окну наружной пластины 25 (26), пластина 35 (36) разделяет пластины 27 и 28 (29 и 30) и соответственно вращающиеся диски 31 и 32 (33 и 34), обеспечивая надежную защиту ФЭУ 11 от засветки, пластины 37 (38) толщиной 2 мм с центральным отверстием диаметром 14 мм и окном, соответствующим размерам и форме окна наружной пластины 25 (26) набора, при чем пластины 37 и 38 с помощью втулки 42 (см. также фиг.5) совместно образуют кюветное отделение. Диски 31 и 32 (33 и 34) объединены в пары с помощью втулки 43 (фиг.6), насаженной на вал 22. Такая связь обеспечивает диском 31 и 32 (33 и 34) вращательное движение. Назначение дисков 31 и 32 (33 и 34) следующее: в режиме регистрации хемилюминесценции они выполняют функцию шторки: открывают-закрывают ФЭУ 11, обеспечивая при этом надежную светозащиту; в режиме регистрации фосфоресценции они вращаются (скорость вращения дисков регулируется от 10 до 120 об/с) и делают возможным разделение во времени процессов облучения образца и регистрации его фосфоресценции. Диски 31 и 32 и 33 и 34 выполнены из алюминиевой фольги толщиной 0,1 мм.

Чтобы совместить требования регистрации хемилюминесценции, фосфоресценции и флуоресценции в качестве кюветы 4 применена цилиндрическая пробирка из плавленого кварца высотой 70 мм и диаметром 20 мм. С помощью шлифа 44 из фторопластовой трубки пробирка присоединяется к крышке 45, закрывающей сверху люк 46 фосфороскопа 3. В таком исполнении кварцевая пробирка 4 и крышка 45 в рабочем состоянии представляют собой замкнутую систему (фиг.7 и 8), исключающую доступ внутрь кюветы внешнего воздуха, что обеспечивает воспроизводимость опытов, так как влияние кислорода внешнего воздуха практически исключается.

Люк 46 фосфороскопа 3 представляет собой полый цилиндр диаметром 35 мм, жестко вмонтированный в основу 39 и выступающий над ней на высоту 30 мм (см. также фиг.4). При закрывании люка 46 крышкой 45 люк 46 входит в паз 47 крышки 45 и тем самым в процессе регистрации люминесценции предохраняется ФЭУ от засветки. Аналогично трубка 48 входит в паз дозатора 49 с вводимой иглой 50, и здесь исключается засветка ФЭУ.

Существенной деталью фосфороскопа 3 является зеркало 51 с алюминиевым покрытием (фиг. 2 и 3), используемое для отражения возбуждающего света на поверхность изучаемого образца, просматриваемой со стороны ФЭУ 11. Применение зеркала 51 позволяет изучать фосфоресценцию прозрачных и непрозрачных жидких и твердых образцов, а также мутных растворов, каковыми являются растворы, содержащие суспензии живых клеток, их внутриклеточных органелл, (ядра, митохондрии и др.).

На фиг.9 представлено устройство 21 для перемешивания жидких растворов суспензий в малых объемах. Электродвигатель 52 с помощью кривошипно-ползунного механизма 53 приводит в колебательное движение пластину 54 и через нее резиновую грушу 55 (от пульвеpизатора), генерируя в резиновом шланге 56 пульсовое давление воздуха. Противоположный конец шланга 56 надевается на штуцер 57, жестко вмонтированного в крышку 45 (фиг.2, 6, 7), к которому подсоединяется полиэтиленовый капилляр 58. Применение капилляра полностью исключает барботирование раствора, содержащегося в кювете 4, и в то же время осуществляется необходимое перемешивание.

Блок 17 программы (фиг.10) содержит шаговый искатель 59, группу реле 60...64, индикацию 66 и имеет электрическую связь со счетчиком 15 импульсов и регистратором 10 (в момент регистрации флуоресценции включает, а по окончании регистрации отключает самописец 10). Блок 18 автоматики (см. также фиг. 3 и 4) включает в себя скоростной 67 и медленный 68 электродвигатели, связанные с валом 22 фосфороскопа 3, и два электромагнита 69 и 70. Электромагнит 69 соединен со шторкой 71, перекрывающей доступ возбуждающего света к кювете 4, электромагнит 70 соединен с муфтой 72, обеспечивающий в заданный момент времени связь медленного электродвигателя 68 с валом 22. Скоростной электродвигатель 67 снабжен регулятором 19 и счетчиком 20 оборотов. Существенными элементами блока 18 автоматики являются жестко связанный с валом 22 диск 73 с отверстием 74 и три пары: осветительная лампочка 75 - светодиод 76, осветительная лампочка 77 - светодиод 78, осветительная лампочка 79 - светодиод 80. Первые две пары 75-76 и 77-78 в режиме регистрации хемилюминесценции (фиг.2) обеспечивают позиции "закрыто ФЭУ 11" и "открыто ФЭУ 11" соответственно. Третья пара 79-80 (фиг.3) контролирует скорость вращения вала 22 и, следовательно, дисков 31 и 32, 33 и 34.

Электрическая функциональная схема, представленная на фиг.10, работает следующим образом.

Для запуска блоков программы 17 и автоматики 18 служит команда, поступающая с таймера счетчика 15 одновременно на цифропечатающее устройство 16 (на перевод каретки на новую строку) и маломощное электромагнитное реле 60. Сигнал с реле 60 поступает на реле 61, содержащее две группы контактов. Однако группа контактов реле 61 включена в цепь питания электромагнита шагового искателя 59, другая группа контактов - в цепь реле 62 времени, назначение которого состоит в том, чтобы обеспечить очередность включения электромагнита шагового искателя 59 (первым), электромагнита 70 (вторым) в режиме регистрации хемилюминесценции, так как питание электродвигателя 68 находится под контролем шагового искателя 59 и фотоэлектронного реле 63. Поступивший импульс от реле 61 на электромагнит шагового искателя 59 вызывает переход щетки искателя на очередную группу контактов, подключая к ним соответствующие исполнительные механизмы, обеспечивающие режим регистрации в данный момент либо хемилюминесценции, либо фосфоресценции.

Работа устройства. Вначале включается питание ФЭУ 5 и 11, электрической измерительной системы 12, блоков программы 17 и автоматики 18. Нажатием кнопки 65, связанной с шаговым искателем 59, устройство приводится в исходное состояние (ФЭУ 11 закрыто дискетами 35 и 34, доступ возбуждающего света к кювете 4 закрыт шторкой 71). После этого кварцевая кювета 4 заполняется рабочим раствором (без изучаемого образца), подсоединяется к крышке 45 (фиг.7 и 8) и, закрывая люк 46, вводится внутрь камеры фосфороскопа 3 (фиг. 2). Затем на счетчике 15 устанавливается время регистрации отдельного измерения (время выдержки), количество измерений, записываемых в одной строке цифропечатающего устройства 16, и кнопкой 65 диски 31 и 32, 33 и 34 фосфороскопа 3 приводятся в быстрое вращение. Скорость вращения устанавливается исследователем с помощью регулятора 19 и счетчика 20. Включается счетчик 15 и устройство регистрирует фосфоресценцию кварцевой кюветы 4 с рабочим раствором (первый режим). Первая строка (два, три и т.д. до восьми измерений) представляет собой запись регистрации фона (темновой ток), доступ возбуждающего света к кювете 4 перекрыт шторкой 71. После записи первой строки и перевода каретка цифропечатающего устройства 16 на новую строку шторка 71 автоматически открывает доступ возбуждающего света к кювете 4, и регистрируется фосфоресценция кюветы с рабочим раствором (вторая, третья, четвертая строки). С переводом каретки на запись пятой строки шторка 71 автоматически перекрывает доступ возбуждающего света к кювете 4, и снова записывается фон ФЭУ 11. По окончании записи пятой строки диски 31, 32 и 33, 34 автоматически останавливаются, при этом шаговый искатель 59 включает медленный электродвигатель 68, а электромагнит 70 после некоторой задержки (2-4с) подсоединяет его с помощью муфты 72 к валу 22 фосфороскопа 3, вал 22 и, следовательно, диски 31, 32 и 33, 34 вращаются, пока отверстие 74 диска 73 не окажется против фотодиода 76. Свет от лампочки 75, находящейся напротив фотодиода 76, но по другую сторону диска 730 попадает через отверстие 74 на фотодиод 76, срабатывает фотоэлектронное реле 63 и вращение вала 22 прекращается, при этом диски 33 и 34 надежно закрывают ФЭУ 11. Счетчик 15 выключается. После этого извлекается кварцевая кювета 4, вводится в нее (в рабочий раствор) исследуемый материал и снова помещают ее в камеру фосфороскопа 3. Включается счетчик 15, и осуществляется регистрация спонтанной хемилюминесценции исследуемого образца (второй режим). Вначале измеряется темновой ток ФЭУ 11 (первая строка), затем шаговый искатель 59 отключает фотодиод 76, ответственный за состояние "ФЭУ 11 закрыто" и включает фотодиод 78, ответственный за состояние "ФЭУ 11 открыто", и регистрируется хемилюминесценция образца (вторая, третья и четвертая строки), доступ возбуждающего света к кювете закрыт шторкой 71. По окончании записи четвертой строки и перевода каретки устройства 16 на пятую строку шаговый искатель 59 отключает фотодиод 78 и включает фотодиод 76, диски 31, 32 и 33, 34 при этом поворачиваются, закрывают ФЭУ 11, и снова записывается величина темнового тока ФЭУ 11. Одновременно регистрируется флуоресценция с помощью ФЭУ 5, поскольку доступ возбуждающего света к образцу в момент записи пятой строки открыт. По окончании записи пятой строки, т.е. темнового тока, устройство автоматически переходит в режим регистрации фосфоресценции образца (третий режим). Регистрация фосфоресценции образца осуществляется по той же схеме, что и в первом режиме, причем сигнал фона в данном режиме представляет собой сумму сигналов темнового тока ФЭУ 11 и спонтанной хемилюминесценции образца. По окончании регистрации фосфоресценции образца устройство автоматически переходит к регистрации индуцированной хемилюминесценции (четвертый режим). Схема регистрации в этом режиме та же, что и во втором режиме с той лишь разницей, что вначале записи второй строки в кювету с образцом с помощью дозатора 49 вводится вещество-индуктор (двухвалентное железо, перекись водорода и т.д.). Доступ возбуждающего света к образцу в этом режиме открыт при записи пятой строки, в этот момент одновременно с темновым током ФЭУ 11 регистрируется флуоресценция образца в присутствии добавленного вещества-индуктора. По окончании четвертого режима регистрации устройство автоматически переходит в последний пятый режим, при котором регистрируется фосфоресценция образца в присутствии вещества-индуктора, введенного в четвертом режиме. С окончанием пятого режима регистрации устройство автоматически возвращается в исходное состояние, т. е. ФЭУ 11 закрыто, доступ возбуждающего света к кювете также закрыт. В этом состоянии можно извлекать из камеры фосфороскопа 3 кварцевую кювету 4, освободиться от образца, тщательно обработать кювету и снова заполнить рабочим раствором для последующих измерений.

П р и м е р 1. Регистрация спонтанной хемилюминесценции сыворотки крови человека (кювета содержала 4 мл трис-буфера и 1 мл сыворотки).

001.004942. 002. 004986 003.004867 Σ₁= 14795; (Σ₁+Σ₅)/2=14810=
004.004978. 005. 004986 006.005012 Σ₂= 15096; Σ₂- = 285
007.005002. 008. 005208 009.005165 Σ₃= 15376; Σ₃= = 564
010.005137. 011. 005199 012. 005119 Σ₄= 15455; Σ₄- =
013.004952. 014. 004984 015. 004890 Σ₅= 14826
Здесь первая (001, 002, 003) и пятая (013, 014, 015) строки - запись регистрации темнового тока, вторая, третья и четвертая строки (004, 005, 006, 007, 008, 009, 010, 011, 012) - запись намерения хемилюминесценции сыворотки крови на фоне темнового тока, время отдельного измерения 10с, числа 004942 и т.д. - количество импульсов за 10 с.

Обработка представленной цифровой информации заключается в следующем: количество импульсов темнового тока первой строки и количество импульсов пятой строки суммируются, делятся пополам и найденная средняя величина темнового тока вычитается из суммы второй, третьей и четвертой строк, полученные разности затем суммируются, в результате чего находится количество импульсов хемилюминесценции сыворотки крови за 90 с, которое можно принять за показатель измерения.

При разработке предлагаемого способа регистрации слабой хемилюминесценции и фосфоресценции были приняты во внимание результаты анализа, выполненного И.М.Карнаухом, согласно которому для повышения порога чувствительности хемилюминометра и достоверности полученной информации необходимо увеличение времени набора информации, т.е. увеличение времени экспозиции и количества циклов измерений. В заявляемом устройстве минимальное время экспозиции (отдельного измерения) 10 с и минимальное количество измерений темнового тока третий до и три после регистрации хемилюминесценции и фосфоресценции, на долю которой отведены три строки по три измерения в каждой.

П р и м е р 2. Регистрация люминесценции ядер почки белой крысы (кювета содержала 4 мл трис-буфера и 0,2 мл суспензии ядер, в режиме индуцированной хемилюминесценции вводилось 0,05 мл 10^-4%-ного FeSO₄).

001.004030 002.004037 003.004000 12067
004.005272 005.005320 006.005157 15751-12151=3599 ФФ кюветы 007.005328 008.005350 009.005346 16024-12151=3872
010.005385 011.005454 012.005305 16144-12151=3992
013.004083 014.004096 015.004057 12236
001.003870 002.003988 003.004007 11865
004.004458 005.004446 006.004627 13531-12019= 1512 СХЛ 007.004439 008.004360 009.004438 13237-12019=1218
010.004620 011.004421 012.004431 13472-12019=1453
013.004075 014.004173 015.003925 12173
001.004230 002.004318 003.004037 12585
004.010531 005.010780 006.010546 31857-12565=19292 ФФ образца 007.010596 008.010558 009.010435 31589-12565=19024
010.010386 011.010491 012.010225 31102-12565=18537
013.004250 014.00414 015.004153 12545
001.004231 002.003815 003.003919 11965
004.006300 005.005293 006.004516 16109-1208= 4098 ИХЛ 007.004461 008.004278 009.004395 13137-1208=1053
010.004293 011.004589 012.004616 13498-1208=1417
013.004078 014.003959 015.004159 12196
001.004215 002.004313 003.004284 12812
004.008750 005.008723 006.008720 26193-12771= 13421 ФФ_Feобразца 007.008719 008.008719 009.008788 26226-12771=13454
010.008793 011.008766 012.008601 26160-12771=13338
013.004327 014.004261 015.004143 12731
Σ _к= 11464; Σ_схл=4183; Σ_фф=56853-11464=45388; Σ _ихл=6499_;Σ _фф=40264-11464=28800
Здесь фф кюветы - фосфоресценция кюветы; СХЛ - спонтанная хемилюминесценция образца; ФФ образца - фосфоресценция образца; ИХЛ - индуцированная двухвалентным железом хемилюминесценция; ФФ_Fe образца - фосфоресценция образца в присутствии железа.

Обработка данных осуществлена по программе, составленной для микрокалькулятора "Электроника БЗ-34":
ИП1 ИП2 + ИП3 + ПО С/П ИП1 ИП2 + ИП3 + ПА С/П ИП1 ИП2 + ИП3 + ПВ С/П ИП1 ИП2 + ИП3 + ПС С/П ИП1 ИП2 + ИП3 + ПД С/П ИПО ИПД + 2: П9 С/П ИПА ИП9 - ПА С/П ИПВ ИП9 - ПВ С/П ИПС ИП9 - ПС С/П ИПА ИПВ + ИПС + П8 С/П.

Таким образом, как видно из описания и примеров, предлагаемое устройство обеспечивает регистрацию хемилюминесценции, фосфоресценции и флуоресценции от одного биологического образца, при этом реализованы различные режимы измерения, в том числе и индуцированная хемилюминесценция. Устройство выполнено настольного типа в малогабаритном исполнении, расход биологического материала не более 0,3 мл (не более 5-6 мг в пересчете на белок), время отдельного измерения широко варьируется (от 1 с до 10 мин), ширина печати от 1 до 6 (по усмотрению исследователя), в качестве показателя принимается количество импульсов за строго определенный промежуток времени (устанавливается исследователем). Возможна обработка данных на микроЭВМ по любой из существующих программ статистических исследований. Потребность такого типа устройств огромна.

Изобретение относится к технике люминесцентного анализа и может быть использовано преимущественно для исследования люминесценции биологических мембран (липидной и белковой их частей). Целью изобретения является регистрация при комнатной температуре хемилюминесценции, фосфоресценции и флуоресценции одного и того же образца, получение комплексной информации о структурно-функциональном состоянии биологической мембраны, снижение расхода экспериментального материала. Цель достигается благодаря введению в фосфороскоп четырех вращающихся дисков, объединенных в две пары, и неподвижной пластины между дисками каждой пары, что обеспечивает абсолютную защиту ФЭУ от внешнего света и тем самым регистрацию фосфоресценции и хемилюминесценции в режиме счета фотонов. Для регистрации флуоресценции изучаемого образца фосфороскоп снабжен вторым ФЭУ. Кроме того, применена цилиндрическая кювета из плавленного кварца, образующая совместно с крышкой люка фосфороскопа замкнутую систему, исключающую доступ внутрь кюветы внешнего воздуха. Для регистрации твердых, жидких, прозрачных образцов применено зеркало для отражения возбуждающего света на поверхность образца, просматриваемой со стороны ФЭУ. Для перемешивания жидких растворов применен капиллярный способ. Разработан блок программы, обеспечивающий в автоматическом режиме очередность регистрации хемилюминесценции, фосфоресценции и флуоресценции. 5 з.п. ф-лы, 10 ил.

1. УСТРОЙСТВО ДЛЯ РЕГИСТРАЦИИ ПРИ КОМНАТНОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН, включающее оптически связанные источник излучения, монохроматор, фосфороскоп, кювету и первый фотоэлектронный умножитель, присоединенный к измерительной электрической системе, причем кювета установлена в фосфороскопе и расположена на оптической оси первого фотоэлектронного умножителя, а фосфороскоп снабжен окнами и вращающимся валом, на котором установлены первый и второй диски, отличающееся тем, что, с целью расширения функциональных возможностей устройства за счет регистрации наряду с фосфоресценцией образца его флуоресценции и хемилюминесценции, в устройство дополнительно введены второй фотоэлектронный умножитель, регистратор флуоресценции, шторка, дозатор ввода реагента в кювету и устройство перемешивания, переотражающее зеркало, два дополнительных диска и две пластины с оптическими окнами, блок управления и блок автоматики, содержащий высоко- и низкооборотный электродвигатели, два электромагнита и муфту, при этом второй фотоэлектронный умножитель оптически связан с кюветой и расположен так, что его оптическая ось перпендикулярна оптической оси источника, шторка установлена между монохроматором и фосфороскопом, оптическая ось первого фотоэлектронного умножителя параллельно смещена относительно оси источника излучения, кювета оптически связана с источником излучения посредством переотражающего зеркала, установленного в фосфороскопе под углом к оптической оси источника, при этом кювета выполнена цилиндрической из плавленного кварца и соединена с дозатором ввода реагента и устройством перемешивания, дополнительные диски установлены на валу фосфороскопа и образуют с первым и вторым дисками фосфороскопа соответственно первую и вторую пары дисков, при этом между дисками в каждой паре закреплена неподвижная пластина, оптические окна каждой пластины совмещены с окнами фосфороскопа, вход блока управления присоединен к выходу электрической измерительной системы, первый выход блока управления связан с регистратором флуоресценции, а второй выход - с блоком автоматики, при этом оба электродвигателя блока автоматики подсоединены к валу фосфороскопа, причем низкооборотный электродвигатель соединен с валом посредством муфты, к которой подсоединен один из электромагнитов, другой электромагнит соединен со шторкой. 2. Устройство по п.1, отличающееся тем, что переотражающее зеркало выполнено с алюминиевым покрытием. 3. Устройство по п.1, отличающееся тем, что, с целью исключения доступа воздуха к образцу, кювета установлена во фосфороскопе так, что образует совместно с крышкой фосфороскопа замкнутую систему, устройство перемешивания выполнено в виде капилляра, соединенного с резиновой грушей, при этом и патрубок дозатора, и капилляр через крышку введены в кювету. 4. Устройство по п.1, отличающийся тем, что, с целью регистрации сверхслабого свечения в режиме счета фотонов, измерительная электрическая система включает последовательно соединенные широкополосный усилитель импульсов, анализатор и счетчик импульсов, к которому подключено цифропечатающее устройство. 5. Устройство по п.1, отличающееся тем, что в него дополнительно введены регулируемая щель и сменный светофильтр, последовательно установленные между фосфороскопом и вторым фотоэлектронным умножителем. 6. Устройство по п.1, отличающееся тем, что, с целью повышения воспроизводимости измерений при регистрации фосфоресценции путем регулирования и стабилизации частоты вращения дисков в фосфороскопе, в устройство дополнительно введены регулятор частоты вращения и счетчик оборотов, соединенные с высокооборотным двигателем.