СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ДОНОРОВ ЭМБРИОНОВ И РАННЕЙ ПОЛОВОЗРЕЛОСТИ У ОВЕЦ Российский патент 1995 года по МПК A01K67/02 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к разведению овец, и может быть использовано для повышения скорости воспроизводства выдающихся по продуктивным и воспроизводительным качествам овцематок.

Проблема ускоренного размножения выдающихся в продуктивном и племенном отношениях самок крупного рогатого скота и овец, необходимого для повышения эффективности селекции, решается с помощью различных способов, в том числе, биотехнологического способа трансплантации эмбрионов, применение которого в животноводстве за последнее десятилетие достигло промышленных масштабов (1). Необходимым этапом в осуществлении этого способа является использование выдающихся по продуктивности животных доноров эмбрионов, предназначенных для стимуляции у них функции яичников суперовуляторными дозами гонадотропных гормонов с целью получения максимально возможного числа эмбрионов.

Однако, использование способа трансплантаций эмбрионов ограничивается огромной вариабельностью суперовуляторной реакции яичников, делающей непредсказуемой величину суперовуляторного ответа индивидуальных доноров (1, 2). Снижение вариабельности и увеличение числа эмбpионов не может быть достигнуто за счет увеличения дозы гонадотpопинов, поскольку увеличение дозы приводит к увеличению вариабельности реакции яичников, снижению оплодотворяемости и жизнеспособности эмбрионов, что особенно проявляется при использовании гонадотропинов сыворотки жеребых кобыл. В связи с этим, актуальной является задача определения потенциальных доноров эмбрионов, т.е. животных, способных давать большое число эмбрионов при суперовуляторной стимуляции яичников.

Другим известным способом ускорения размножения является селекция овец на достижение полного воспроизводительного потенциала (половозрелости) к 7-8-и месячному и более раннему возрасту. Преимущества покрытия овец в раннем возрасте заключаются в снижении затрат на содержание животных до начала их размножения, сокращения периода жизни без приплода, а соответственно, и более быстрой отдаче от селекции и увеличении продолжительности продуктивной жизни животных. Особое значение селекции на раннюю половую зрелость приобретает в условиях интенсификации производства сельскохозяйственной продукции. Однако, селекция на раннюю половую зрелость, использующая для определения скорости полового созревания овец традиционный способ выявления раннеполовозрелых ярок с помощью баранов-пробников, является трудоемким процессом, вследствие значительной продолжительности периода полового созревания ярок, необходимости ежедневного выявления достигших половой зрелости особей и такого недостатка как зависимости скорости полового созревания от условий среды, включая кормление.

Известен способ определения потенциальных доноров эмбрионов у коров посредством быстрого полуколичественного определения прогестерона в молоке, необходимого для корректировки времени начала суперовуляторных гормональных обработок с соответствующей фазой эстрального цикла коров. Данный способ не является способом определения истинно потенциальных доноров эмбрионов, поскольку он не дифференцирует животных по эндокринным параметрам, определяющим фолликулогенез и овуляцию, а только в равной мере для всех животных позволяет более точно соотносить начала суперовуляторных обработок с фазой желтого тела.

Наиболее близким к заявляемому способу прототипом является способ определения раннеполовозрелых особей у овец посредством ежедневного выявления в сезоне размножения и предшествующий ему период достигших половой зрелости ярок по признаку наличия у них половой охоты с помощью баранов-пробников. Данный способ не предназначен для отбора потенциальных доноров эмбрионов. Недостатками известного способа являются: продолжительность периода выявления и трудоемкость определения раннеполовозрелых особей, вследствие необходимости ежедневного выявления ярок, проявляющих половую охоту, в течение 150-160 сут. периода их полового созревания (август-ноябрь месяцы); отсутствие точности в определении раннеполовозрелых особей, вследствие кратковременности проявления первой половой охоты, зависимости скорости полового созревания и проявления охоты от условий среды, уровня кормления и достижения особями критической живой массы половозрелости. Так, после перевоза в новую местность селекционированных на раннюю половую зрелость овец породы DLS, характерное для этих животных внесезонное проявление половой охоты полностью отсутствовало.

На известен способ определения потенциальных доноров эмбрионов у овец.

Задачей изобретения является повышение эффективности и уменьшение длительности способа определения потенциальных доноров эмбрионов и ранней половозрелости у овец.

Вышеназванный технический результат достигается тем, что в период сезонного анэструса яркам в возрасте 11-12 мес. и овцематкам разного возраста делают инъекцию тестостерона пропионата в оптимальной дозе и затем в течение 5 сут. выявляют животных в половой охоте, при этом особи, проявляющие половую охоту, определяются как реактивные к действию тестостерона. Экспериментально установлено, что оптимальной дозой тестостерона пропионата является 0,226-0,230 мг/кг живой массы для овец следующих пород: советская мясошерстная, финский ландрас и гибридных животных от скрещивания советская мясо-шерстная х финский ландрас.

Сущность заявляемого способа определения потенциальных доноров эмбрионов и ранней половозрелости у овец заключается в следующем. Яркам в возрасте 11-12 мес. и овцематкам разного возраста в период сезонного анэструса (январь-июль) вводят по 0,226-0,230 мг/кг живой массы тестостерон пропионат в 2 мл масляного раствора, в/мышечно. Начиная с утра следующего дня в течение 5 сут, дважды в день (8.00 и 19,00 ч) проводят выявление особей в половой охоте с помощью вазэктомированных баранов-пробников, предварительно активированных тестостероном. Ярки и овцематки, проявившие индуцированную тестостероном пропионатом половую охоту определяются как реактивные к тестостерону, причем реактивные ярки являются раннеполовозрелыми животными, а ярки, не проявившие охоту, являются неполовозрелыми животными.

В период сезона размножения реактивных овцематок (ярок, достигших 18 мес. возраста, переводят в разряд овцематок) используют как потенциальных доноров эмбрионов.

Способ обеспечивает быстроту определения потенциальных доноров эмбрионов и ранней половозрелости у овец (5 дней вместо 150-160 у прототипа), причем потенциальные доноры характеризуются дополнительным признаком "ранняя половозрелость" или "скороспелость", имеющим самостоятельную селекционную и хозяйственную ценность.

Принципиальным отличием заявляемого способа от прототипа является то, что потенциальных доноров эмбрионов и раннеполовозрелых особей определяют в период сезонного анэструса по различиям в реактивности гипоталамо-гипофизарного звена половой системы к действию оптимальной дозы тестостерона пропионата, индуцирующего секрецию этим звеном фолликулстимулирующего (ФСГ) и лютеинизирующего (ЛГ) гормонов, т.е. гонадотропных гормонов, определяющих процессы фолликулогенеза и овуляции, а в качестве феноменологического индикатора индивидуальных различий по реактивности центрального звена половой системы, взаимосвязанных с различиями в скорости эндогенной секреции генадотропинов, используют признак наличия или отсутствия половой охоты у опытных животных, что позволяет сократить длительность способа с 160 до 5 сут. и повысить эффективность способа.

Существенными признаками заявляемого способа являются: яркам в возрасте 11-12 мес. и овцематкам разного возраста в период сезонного анэструса делают инъекцию тестостерона пропионата в дозе 0,226-0,230 мг/кг живой массы, а затем в течение 5 сут. выявляют животных в половой охоте, при этом особей, проявивших половую охоту, определяют как реактивных к действию тестостерона, что позволяет повысить эффективность способа, за счет: предварительной отбраковки овцематок, не способных давать большое число яйцеклеток и соответственно эмбрионов при суперовуляторной стимуляции яичников; использования для трансплантации эмбрионов овец, потенциальных доноров эмбрионов, величина суперовуляторной реакции у которых выше средней популяционной на 3,5 желтых тела и выше, чем у нереактивных к тестостерону доноров в пределах от 6,4 до 10,2 желтых тела.

В предлагаемом способе использованы следующие биологические закономерности.

Известно, что концентрация гипофизарных гонадотропинов в крови регулируется как объемом стероидов и ингибина секретируемых яичниками, так и чувствительностью (реактивностью) гипоталамуса и гипофиза к действию отрицательной обратной связи половых стероидов. Отсюда следует, что существующие индивидуальные различия у овец по скорости секреции гипофизом гонадотропинов и соответственно их концентрациям в крови взаимосвязаны с различной реактивностью гипоталамо-гипофизарного звена половой системы к действию веществ, регулирующих гипофизарную секрецию. Качественную оценку индивидуальных различий по реактивности гипоталамо-гипофизарного звена к минимальным дозам веществ, индуцирующих гипофизарную секрецию, можно провести в период сезонного анэструса, характеризующегося функциональной неактивностью половой системы. При подборе минимальной "пороговой" дозы индуцирующего вещества у реактивных к его действию особей должно происходить "включение" гипофизарной секреции гонадотропинов, тогда как у нереактивных особей "включения" не будет или оно будет минимальным. Известно также, что в яичниках овец различного возраста, включая препубертатный, имеются зрелые граафовы фолликулы, способность к овуляции которых определяется, в основном, наличием секреции гипофизом ЛГ. Поэтому, наличие или отсутствие "включения" на действие индуктора гипофизарной секреции гонадотропинов, феноменологически проявляется как наличие половой охоты у реактивных к действию индуктора особей и ее отсутствие у нереактивных к индуктору особей. Качественный признак "наличие-отсутствие" индуцированной охоты используется для качественной дифференциации особей по реактивности гипоталамо-гипофизарного звена половой системы, сопряженной с различиями в скорости секреции гонадотропных гормонов и скорости полового созревания у овец.

Определение тесторного вещества, индуктора гипофизарной секреции гонадотропинов, необходимого для качественного выявления различий по реактивности гипоталамо-гипофизарного звена и скорости секреции гипофизом гонадотропинов, проводили опытным путем при сравнении нескольких индуцирующих веществ: рилизинг-гормона лютеинизирующего гормона (ЛГ-РГ), эстрадиола и тестостерона. В качестве опытных животных использовали ярок в возрасте 11-12 мес. с предварительно определенным у них в возрасте 6-8 мес. особенностями полового созревания, что позволило подразделить их на раннеполовозрелых и позднеполовозрелых особей. Для выявления возможных особенностей действия изучаемых веществ на гипоталамо-гипофизарное звено половой системы, в состав каждой опытной группы включали как раннеполовозрелых, так и неполовозрелых ярок. Гормональные обработки проводили в период сезонного анэструса, характеризующегося функциональной неактивностью периферического (яичники) и центрального (гипоталамус-гипофиз) звеньев половой системы, следующим образом: ЛГ-РГ (Calbiochem, USA) вводили 2-х кратно с интервалом в 24 ч по 100 мкг/ярка в 1 мл раствора, в/мышечно, эстрадиол-17 β (Sigma, USA) в разных дозах по 2 мл масляного раствора, в/мышечно, и аптечный препарат тестостерона пропионата в разных дозах по 2 мл масляного раствора, в/мышечно. Проведенные эксперименты показали, что качественные различия по реактивности гипоталамо-гипофизарного звена половой системы выявляются только с помощью тестостерона пропионата, в действии которого на овец проявились свойства специфичности и дозовой зависимости.

В табл.1 представлена зависимость реактивности гипоталамо-гипофизарного звена половой системы ярок от используемых веществ-индукторов секреции гонадотропинов. Из данных табл.1 видно, что только реакция на тестостерон оказалась дозозависимой и специфической, поскольку частоты проявления индуцированной охоты были специфически связаны с половозрелостью ярок. Так, в первой повторности опыта индуцированная половая охота проявлялась только у раннеполовозрелых ярок. Проявление половой охоты у неполовозрелых ярок во 2-й повторности опыта определяется спонтанным приходом ярок в половую охоту, что подтверждается контролем, и вызвано проведением опыта в период, пограничный с окончанием сезона размножения овец. Дозозависимый эффект тестостерона имел двоякое проявление. Во-первых, увеличение дозы тестостерона выше 0,230 мг/кг не вело к увеличению общего числа приходящих в охоту ярок. Во-вторых, увеличение дозы вело к утрате специфичности в реакции половой системы на тестостерон, поскольку при этом увеличивалось число неполовозрелых ярок, проявляющих половую охоту. Так как известно, что скорость секреции ЛГ у раннеполовозрелых ярок выше, чем у неполовозрелых, то проявление специфичности в реакции ярок на тестостерон указывает на факт выявления с помощью данного тесторного вещества качественных различий по реактивности центрального регуляторного звена половой системы и скорости секреции гонадотропинов у овец. Минимальной "пороговой" концентрацией тестостерона пропионата, определяющей сохранение специфичности реакции на этот индуктор у раннеполовозрелых ярок, является доза 0,226-0,230 мг/кг живой массы, принятая в дальнейшем в качестве оптимальной дозы.

В табл.2 представлена динамика прихода в открытую половую охоту ярок после индукции эструса тестостероном пропионатом (0,230 мг/кг) в период анэструса. Из табл. 2 видно, что проявление индуцированной охоты оказывается максимальным в первые трое суток и заканчивается на пятые сутки после инъекции тестостерона. Поэтому для гарантированного выявления реактивны к оптимальной дозе тестостерона животных в дальнейшем был принят период выявления, равный 5 сут.

В связи с тем, что в известных научно-технических и патентных источниках способа, аналогичного заявляемому, не обнаружено, можно сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критериям "новизна и изобретательский уровень".

П р и м е р 1. Испытания способа проводили в Экспериментальном хозяйстве СО АН СССР, на поголовье мясо-шерстных и гибридных ярок (168 голов) в возрасте 6-8 и затем 11-12 мес. и овцематках (75 голов) в возрасте 2-х и более лет, включающих овцематок чистопородный финский ландрас и гибридов 1 и 2-го поколений от скрещивания пород советская мясо-шерстная х финский ландрас. Скорость полового созревания ярок в возрасте 6-9 мес. определяли в сезоне размножения (август-ноябрь) посредством ежедневного выявления в 8.00 ч ярок в половой охоте вазъэктомированными баранами-пробниками. Характеристики достигших в этот период половой зрелости (раннеполовозрелые) и оставшихся неполовозрелыми ярок приведены в табл.3. Определение реактивности гипоталамо-гипофизарного звена половой системы овец к тестостерону проводили в период сезонного анэструса, у ярок (возраст 11-12 мес.) в январе и у овцематок в июне через 14 дней после отъема у них ягнят. Яркам и овцематкам вводили тестостерон пропионат в дозе 0,230 мг/кг живой массы в 2 мл масляного раствора, в/мышечно. Начиная с утра следующего после инъекции тестостерона дня, в течение 5 дней проводили дважды в день (8.00 и 19.00 ч) выявление животных в половой охоте с помощью вазэктомированных баранов-пробников, предварительно активированных тестостероном. Результаты определения реактивности гипоталамо-гипофизарного звена к тестостерону, определяемой по наличию или отсутствию индуцированной половой охоты у ярок и овцематок, представлены в табл.4.

Суперовуляторную реакцию яичников у реактивных и нереактивных к тестостерону овцематок-доноров эмбрионов определяли в сезоне размножения, в сентябре и октябре месяцах, в двух повторностях опытов. Суперовуляторную стимуляцию яичников у всех доноров проводили с помощью ФСГ-Р (ФСГ, выделенный из гипофизов свиней) (Sigma, USA) по принятой схеме, включающей ежедневные 2-х кратные инъекции 5, 4 и 3 мг ФСГ-Р (всего 24 мг/овцу, подкожно) на 11, 12 и 13 дни полового цикла (день спонтанного эструса принят за день 0), а также инъекцию 150 мкг клопростенола (Эстрофан, ЧССР) через 48 ч от начала обработки гонадотропином. Выявление овцематок, пришедших в половую охоту после гонадотропной обработки, проводили с помощью вазэктомированных баранов-пробников. Величину суперовуляторной реакции определяли по общепринятому способу путем визуального подсчета числа желтых тел в яичниках при лапаротомии овцематок на 5-7 день эстрального цикла, под общим наркозом. Различия по величине суперовуляторной реакции и возрастные особенности этой реакции у реактивных и нереактивных к действию тестостерона овцематок-доноров, представлены в табл.5 и 6.

Из табл. 3 видно, что численность раннеполовозрелых особей в популяции ярок достигает 63,1% а возраст достижения ими половозрелости составляет в среднем 8 мес. По сравнению с позднеполовозрелыми ярками, раннеполовозрелые или "скороспелые" ярки являются более продуктивными животными, имеющими более высокий темп роста. Так, живая масса раннеполовозрелых особей достоверно выше, чем у недостигших к этому возрасту половой зрелости ярок на 19,1%
Из табл.4 видно, что, во-первых, при учете частот спонтанной охоты численность реактивных к тестостерону раннеполовозрелых ярок (75,0 22,2 52,8%) не отличается от численности реактивных к тестостерону овцематок (52,7%) и, во-вторых, что среди неполовозрелых ярок численность реактивных к тестостерону особей составляет всего 3,5% (28,5 25,0 3,5%). По сравнению со спонтанной охотой, продолжительность индуцированной тестостероном охоты больше у ярок на 82,6% (Р < 0,001) и у овцематок на 75,5% (Р < 0,001). Эти данные подтверждают надежность и точность выявления животных с индуцированной тестостероном половой охотой.

Из табл. 5 видно, что как в первой, так и второй повторностях опытов, суперовуляторная реакция реактивных доноров была достоверно выше, чем у нереактивных в среднем на 7,6 желтых тела. Эти данные указывают на эффективность использования реактивных к тестостерону овцематок, являющихся потенциальными донорами эмбрионов.

Из табл. 6 видно, что как реактивные, так и нереактивные доноры в возрасте 18 мес. имели более низкую величину реакции яичников, чем доноры в возрасте 3-х и более лет. Следовательно, при практическом осуществлении метода трансплантации эмбрионов у овец правильно использовать в качестве потенциальных доноров эмбрионов реактивных к тестостерону овцематок в возрасте старше 18 мес. При объединении данных по реактивным и нереактивным донорам возрастные различия по величине суперовуляторного ответа не проявляются. Подразделение общей изменчивости величины суперовуляторного ответа на изменчивость, определяемую различиями между реактивными и нереактивными донорами, а также изменчивость, зависящую от возраста животных, приводит к снижению коэффициента вариации суперовуляторного ответа с 53,1-43,7% до 38,2-27,5%

Использование: в ветеринарии, в частности в способе определения потенциальных доноров эмбрионов и ранней половозрелости у овец. Сущность: способ предусматривает яркам в возрасте 11 - 12 месяцев и овцематкам в период сезонного анэструса инъекцию тестостерона пропионата, преимущественно в дозе 0,225 - 0,230 мг/кг живой массы, а затем выявление в течение 5 суток животных в половой охоте. Способ повышает эффективность отбора животных при сокращении его длительности в 30 раз. 1 з.п. ф-лы, 6 табл.

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ДОНОРОВ ЭМБРИОНОВ И РАННЕЙ ПОЛОВОЗРЕЛОСТИ У ОВЕЦ, включающий отбор выдающихся в продуктивном и племенном отношениях животных и выявление у них половой охоты с помощью баранов-пробников, отличающийся тем, что отобранным яркам в возрасте 11 12 месяцев и овцематкам разного возраста в период сезонного анэструса дополнительно вводят тестостерона пропионат в оптимальной дозе, а затем в течение 5 суток выявляют животных в половой охоте. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что тестостерона пропионат берут в дозе 0,226 0,230 мг/кг живой массы в случае использования овец пород советская мясошерстная, финский ландрас и гибридных от скрещивания этих пород животных.