СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ РИБОФЛАВИНА Российский патент 1995 года по МПК C12P25/00 

Изобретение относится к микробиологическому способу получения рибофлавина (витамина В₂), в частности к способу выделения рибофлавина из раствора ферментации.

Известен способ выделения рибофлавина из раствора ферментации, на котором раствор ферментации, содержащий максимальное количество рибофлавина, в течение 15-45 мин нагревают при температуре 50-65^оС с последующим разбавлением 25-100 об. водой, полученный разбавленный раствор подвергают центрифугированию с последующим суспендированием полу- ченного центрифугата в 100-300 об. воде и повторным центрифугированием, и в случае необходимости сушкой центрифугата, причем с целью повышения степени выделения путем солюбилизации протеинсодержащего или подобного протеину материала или его перевода в материал сниженной плотности, поддающийся отделению путем центрифугирования, перед центрифугированием можно обрабатывать раствор протеолитическим энзимом при значении рН 6,0-9,0 в течение 1-5 ч [1]
Недостаток известного способа заключается в том, что из-за разбавления получают значительно большее количество суспензии ферментации, подлежащей обработке, вследствие чего значительно повышаются расходы на обработку и потери рибофлавина из-за растворенного в добавленной воде рибофлавина. Кроме того, несмотря на использование сравнительно дорогостоящих протеолитических энзимов, выход не полностью удовлетворяет.

Задача изобретения заключается в развитии способа, позволяющего при ферментации рибофлавина по возможности простым и экономичным образом повысить содержание рибофлавина в сушенном, в частности прошедшем распылительную сушку, продукте ферментации и до минимума сократить потери рибофлавина во время переработки.

Поставленная задача решается в способе выделения рибофлавина из раствора ферментации путем обработки раствора, содержащего максимальное количество рибофлавина, отделения содержащего рибофлавин осадка от раствора и сушки за счет того, что обработку осуществляют в условиях, индуцирующих автолиз полученных клеток.

Под индукцией автолиза понимают образование и активацию собственных внутриклеточных энзимов, разлагающих стенки клеток и протеины.

Автолиз микроорганизмов может индуцироваться путем т.н. факторов стресса в микроорганизмах.

Такими факторами стресса для микроорганизмов являются, например, нехватка питательных веществ, повышение температуры, нехватка кислорода, изменения значения рН и изменения давления или осмотического давления в среде, а также добавление к среде солей, тензидов или жирных кислот и облучение ультрафиолетовым светом или рентгеновскими лучами (Acta Biotechnol, 5, 1985, 2, с. 129-136).

В качестве образующих рибофлавин микроорганизмов можно использовать, например, штамм-продуцент Ashbya gossypii и его мутанты, штамм-продуцент Eremothecium ashbyii и его мутанты, и микроорганизмы родов Candida, Torulopsis, Bacillus или Saccharomyces.

Особенно пригодным фактором стресса является повышение при нехватке кислорода.

Таким образом, у образующих рибофлавин штаммов Ashbya gossypii и его мутантов образование и активацию энзимов, разлагающих стенки клеток и протеины, можно индуцировать путем нагревания раствора ферментации, содержащего максимальный выход рибофлавина, при температуре 35-55^оС, предпочтительно 40-49^оС, в частности 40-48^оС, а именно при значении рН 4-9, предпочтительно 5-8, в частности 6-7, при почти полном исключении кислорода, т.е. без вентиляции, в течение 6-28 ч, предпочтительно 14-24 ч.

Получение рибофлавина путем ферментации или брожения известно. Данный метод включает стерилизацию питающей среды и прививку в нее способного к образованию рибофлавина микроорганизма, например Ashbya gossypii или Eremothecium ashbyii, с последующим инкубированием. При достижении или примерном достижении выхода рибофлавина путем ферментации максимума ферментацию оканчивают. После предлагаемого индуцированного автолиза раствора ферментации рибофлавин можно выделять известным образом путем центрифугирования или декантирования и последующей сушки осадка. Сушку можно осуществлять путем распылительной сушки.

П р и м е р 1. По окончании ферментации рибофлавина, при которой в растворе ферментации достигнуто содержание рибофлавина > 5 г/л, раствор при указанных в табл. 1 значениях рН и при умеренном размешивании без введения воздуха нагревают при температуре 45^оС в течение 17 ч. Затем твердые компоненты нагреваемого таким образом раствора ферментации в лабораторной центрифуге количественно осаждают. Осадок затем сушат до того, как вес больше не изменяется, и определяют содержание рибофлавина в сушенном осадке.

П р и м е р 2. По окончании ферментации рибофлавина в сосуде ферментации емкостью 2000 л, при которой достигнуто содержание рибофлавина > 5 г/л, раствор ферментации в квазианаэробных условиях (умеренное размешивание без введения воздуха) при значении рН, равном 6,8, инкубируют при температуре 45^оС в течение 24 ч. Затем автолизованный раствор ферментации декантируют и подвергают распылительной сушке. При этом содержание рибофлавина в прошедшем распылительную сушку осадке составляет 90 мас.

П р и м е р 3. По окончании ферментации рибофлавина, осуществляемой с использованием штамма Ashbya gossypii, полученный раствор ферментации, имеющий содержание рибофлавина > 5 г/л, при умеренном размешивании без введения воздуха при значении рН 6,5, инкубируют при температуре 45^оС. Несколько раз отбирают пробы, каждый раз по истечении 2-4 ч. Для исследования проб 45 мл пробы подвергают центрифугированию в лабораторной центрифуге при 2200 об. в 1 мин в течение 5 мин. Затем осадок ресуспендируют в одинаковом количестве 0,9% -ного водного раствора поваренной соли и дополнительно центрифугируют в указанных выше условиях. Затем полученный осадок подвергают лиофилизации. Результаты приведены в табл.2.

П р и м е р 4. По окончании ферментации рибофлавина с использованием Ashbya gossypii полученный раствор ферментации, имеющий содержание рибофлавина, превышающее 5 г/л, разделяют и инкубируют.

Пробы затем центрифугируют в лабораторной центрифуге, полученный осадок дважды промывают солевым раствором, ресуспендируют и вновь центрифугируют. Затем осадок лиофилизуют. Полученные результаты приведены в табл.3.

Путем нагревании при температуре 50-60^оС в течение 45 мин (согласно прототипу) достигается лишь открытие содержащих рибофлавин клеток, благодаря чему содержание клеток может вытекать. Поэтому в микроскопическом изображении стенки клеток (в опытах А и Б) полностью сохранились, и биомасса содержится в лиофилизованном осадке. В отличии от этого в условиях автолиза согласно изобретению (опыт 1) клетки полностью разлагаются энзимом, т.е. в микроскопическом изображении раствора ферментации не видно ни клеток, ни стенок клеток.

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: способ предусматривает нагрев полученной после ферментации суспензии рибофлавина с максимальным содержанием сухих веществ при температуре 35 - 55°С в квазианаэробных условиях в течение 6 - 28 ч и при значении pH 4 - 9. Из полученного после индуцированного автолиза раствора, содержащего рибофлавин, последний выделяют центрифугированием, декантированием и сушат. 2 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ РИБОФЛАВИНА, предусматривающий нагрев ферментативной суспензии рибофлавина, содержащей максимальное количество рибофлавина, отделение содержащего рибофлавин осадка от жидкой фракции центрифугированием и сушку, отличающийся тем, что нагрев ферментативной суспензии ведут при 35 - 55^oС в квазианаэробных условиях в течение 6 28 ч и pH 4 9. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что нагрев осуществляют при 40 - 49^oС. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что нагрев осуществляют в течение 14 24 ч.