Способ получения иммобилизованного ферментного препарата глюкозоизомеразы Советский патент 1980 года по МПК C07G7/02 C12D13/10 

Изобретение относится к микробиол гической промышленности и касается получения иммобилизованного ферментного препарата глюкозоизомеразы. Известен способ получения иммобилизованного ферментного препарата глюкозоизомеразы, предусматривающий смешивание культуральной жидкости, содержащей клетки микроорганизмов с раствором глутарового альдегида 1 Одйако известный способ не позволяет получить водонерастворимый препарат с высокой физической устой чивостью в процессе изомеризации глюкозы. Цель изобретения - получение вод нерастворимого препарата и повьвдени его физической устойчивости в процессе изомеризации глюкозы. Это достигается тем, что культуральную жидкость перед смешиванием концентрируют до содержания сухих веществ 3-30 вес.%, в полученном ко центрате разрушают клетки микроорганизмов до содержания разрушенных клеток в нем 25-100%, при этом глутаровый альдегид используют в количестве 0,01-1,0 вес.ч. на 1 вес.ч. сухого вещества концентрата и смесь выдерживают при температуре окруждю щей среды до образования геля после чего гель гранулируют, полученный препарат обезвоживают, промывают и вновь обезвоживают. Кроме того, используют культуральную жидкость микроорганизмов рода Bacillus, а также культуральную жидкость микроорганизмов Bacillus coagylans. Клетки разрушают путем автолиза или гомогенизации. В концентрат после автолиза вводят флокулянт и затем после смешивания с глутаровым ошьдегидом разбавляют водой и фильтруют . Обезвоживают препарат сушкой или замораживанием.. Способ осуществляют взаимодействием клеточного концентрата, по крайней мере частично разрушенных клеток микроорганизмов, содержащего от О до 75% неповрежденных клеток и от 3 до 30 вес.% по объему сухого вещества, с 0,01-1,0 вес.ч. глутарового альдегида на 1 вес.ч. сухого вещества концентрата. Таким образом, получают сцепленный твердый продукт, после чего удаляют воду и формируют катализатор изомеризации глюкозы. Удаление воды, которое может производиться до различной степени, обычно осуществляют в две стадии: оР- воживание механическим путем, т.е. путем фильтрации., и осушка конечного формованного продукта. Для этого применяют клеточный концентрат с содержанием сухого вещества от 8 до 20 вес,% по объему, желательно от 10 до 16 вес.% по объему.

Изобретение касается также энзимтически физически устойчивого, водонерастворимого,катализатора изомеризации глюкозы из клеток микроорганизмов, обладающих способностью катализировать изомэризацию глюкозы Этот катализатор получают взаимодействием клеточного препарата из частично разрушенных клеток, который содержит от О до 75% поврежденных клеток и имеет содержание сухого вещества от 3 до 30 вес.% по объему с 0,01-1,0 вес.ч глутарового альдегида на 1 вес.ч. сухого вещества концентрата. Таким образом,синтезируют сцепленный твердый продукт, после чего обезвоживают и формируют катализатор изомеризации глюкозы.

сцепленный твердый катализатор изомеризации глюкозы можно получить без разбавления энзима при введении инородного реагента иммобилизации. Было установлено, что сами клетки содержат более чем достаточное количество азотных (и других) составляющих, способных реагировать с глутаровым альдегидом с образованием гел Эти азотные вещества первоначально должны быть выделены из клеток микроорганизмов, а затем их можно использовать, минуя стадию очистки.

Выделение азотных веществ, {протеины и нуклеиновые кислоты)- осуществляют механически или путем автолиза. Выделение не обязательно должно быть полным. Разрушение 25% клеток (75% остаются неповрежденными) дает достаточное количество реагентов для образования сцепленного твердого продукта, который может представлять собой гель. Сцепленный -продукт реакции обезвоживают и подвергают формованию с образованием частиц размером в 10 мкм.

Особый источник микроорганизмов не является обязательным, поскольку катализатор изомеризации глюкозы является внутриклеточным продуктом. Многие микроорганизмы могут катализировать изомеризацию глюкозы. ОднакЬ большинство из этих известных микроорганизмов производят энзим внутриклеточно.

Клетки микроорганизмов можно култивировать любым подходящим способом, в частности наиболее подходящим для получения клеток, обладающих высокой активностью катализировать изомеризацию глюкозы. Клетки соответственно отделяют от ферменг-ативного бульона фильтрацией, центрифугированием или подробным способо

и получают концентрат, содержащий 3-30 вес.% по объему сухого вещества. Присутствие аутолизированных и разрушенных клеток и даже свободного энзима в клеточном концентрате является критическим, что позволяет применять концентрирование микробиологических клеток с помощью больших промышленных установок (самоочистительные отстойные центрифуги). Обычно допускаются сравнительно не жесткие условия эксплуатации, даже автолиз.

Если значительная часть клеток разрушается, автолиз или ему подобное явление не происходит во время выделения и концентрирования: клетки разрушаются так, чтобы концентра содержал не более 75%, желательно менее 60% целых (неповрежденных) клеток. Полное или 100%-ное разрушение клеток является оптимальным, так как позволяет исключить диффузионные проблемы и получить наиболее физически устойчивый продукт.

Реакцию с глутаровым альдегидом проводят в водной суспензии фрагментированных клеток и некоторое количество выделенных клеточных составляющих, включая катализатор изомеризации глюкоз, находится в растворе. Соответственно разрыв или разрушение клеток должно проводиться только после концентрирования клеток выше их обычного содержания в ферментативной среде. Это означает, что микроорганизм обычно отделяют от своей питательной среды, например, центрифугированием, поскольку концентрат бактериальных клеток содержит 3-20% сухого вещества. Затем одновременно с концентрированием или сразу после него проводят необходимое разрушение клеток, например, с помощью автолиза или гомогенизации В промышленных масштабах концентрирование клеток проводят с помощью самоочищающих сепараторов, например, SAMS 15037 или SAMR.

Эти сеп1Ьраторы рекомендуются для применения в том случае, если степень разрушения клеток не является критической, потому что используются большие физические силы в процессе периодической выгрузки из корзины центрифуги через периферийные отверстия, при этом клетки переходят из области высокого давления в корзине в область атмосферного давления снаружи.

. %

Степень разрушения клеток может меняться в зависимости от типа

микроорганизма, что объясняется размером и прочностью клеточных стенок. Для Bacillus coagulans было найдено, что степень разрушения обычно выше 50% при использовании ЙАМБ 15037.

Давление на стенку корзины центрифуги можно вычислить по формуле

.)

где G - плотность сырья (в данном случаа около 1030 кг/м) , to - скорость вращения сепаратора;

г - радиус корзины; г, - радиус от центра уровня

сырья который в этой уста новке близок нулю.

Было найдено, что давление на периферии корзины в таком сепараторе равно 50-100 кг/см.. Корзина аппарата SAMS 15037 имеет радиус 25 см и обычно вращается со скоростью 5000 об./мин при соответствующем давлении на стенку корзины около 80 кг/см.

Известно, что некоторые микроорганизмы, особенно Bacillus species, чувствителен к автолизу. Найдено дл Bacillus coagulans что, если клеточный концентрат получают с помощью упомянутого самоочищающего сепаратора, выделяется большее количество катализатора изомеризации глюкозы, если отстой выдерживать в течение нескольких часов при 10-40°С. Через 3-6 час хранения обычно более 80% клеток разрушается или лизируется.

Активность катализатора изомеризации глюкозы суспензии неповрежденных клеток Bacillus coagulans составляет только 1/3 активности суспензии полностью лизированных клеток, полученных при обработке лизозмом.

Активность (в GINU/r) свежего пительного бульона без лизозима 2,14, с лизозимом через 30 мин при - 3,97, через 60 мин - 6,02.

Лизозим представляет собой Sigma Grade I с 25000 Sigma ед./мг.

Питательный бульон разбавляют в 20 раз и в разбавленную суспензию добавляют 1,5 мг лизозима на 1 мл. Затем образцы анализируют через 30 и 60 мин согласно стандартной методке- для неиммобилизированного катализатора изомеризации глюкозы.

Стандартная методика для измерения полной активности клеточного концентрата включает инкубацию в течение 1 час с лизозимом после разбавления в 150-200 раз. Затем определяют активность образца, не обработанного лизозимом, процент растворимой активности можно вычислить допуская, что активность неповрежденных клеток равна максимально 35%. Например, если активность после обработки отстоя лизозимом равнялась 135 GlNU/r, а без обработки лизозимом 120 GlNU/r, процент растворимого энзима может быть

найден как X по следующему уравнению:

,35+(igO-X)1,35Х 0,

Другим преимуществом высокой степени разрушения клеток является то, J что физическая стабильность конечного продукта все более и более увеличивается и клетки (и другие суспендированные вещества) лучше расщепляются. Для обеспечения оптимальных условий полезно нагнетать;насо0сом отстой через промьаиленный гомогенизатор.

Известно несколько методов разрушения клеток, однако только немногие пригодны в промьпипенных масштабах. Обычный и сравнительно дешевый способ размельчения клеток заключается в использовании шаровой мельницы.

Катализатор изомеризации глюкозы 0 катализирует изомеризацию глюкозы во фруктозу. Образующаяся фруктоза анализируется с помощью цистеинкарбазольного метода, применяемого для кетоз.

5 Единица измерения катализатора изомеризации глюкозы (GINU) определяется как такое количество энзима , которое катализирует образование 1 мкмоля фруктозы в 1 мин при следующих стандартных условиях:

Температура 65,0с Концентрация

субстрата 5 % глюкозы Буферная кон- 0,25 М малеат5 цектрация ный буферный

раствор рН 6,50

20

Время реакции

мин

Оборудование включает магнитную 40 мешалку, водяные бани (30,0°С и 65,0°С) рН-метр, спектрофотометр, секундомер и ротамиксер.

Используют следующие реагенты. 1. Буферный раствор, рН 6,50 45 (0,25 М малёатный буфер, 0,1 М сульфата магния, 1,0% хлорида калия).

К малеиновой кислоте (29,0 г) NaOH (19,0 г)., MgSO THjO (24,7 г), KCfc (10,0 г) добавляют деионизированную воду до 1000 мл.

Когда все реагенты растворены, рН контролируют рН-метром ипоказатель буферного раствора доводят до

6,50 путем добавления 1 н. NaOH

или 1 н. нее. Добавление NaOH увеличивает осаждение Мд(ОНе.), который вновь растворяется при перемешивании. Поэтому NaOH должен добавляться очень медленно.

2, Субстрат глюкозы - содержит 10% глюкозы безводной (100 г), СоСЙ16Н О (475 мг) ,- рН буфера 6,5; цеионизированную воду добавляют

до 1000 мл. Когда реагенты растворены, рН снова контролируют рН-метром и доводят до 6,50 , как описано вьше. Для сохранения субстрата добавл ют 0,1%-ный хлороформ (1,0 ил) . Субстрат хранят при охлс дении до момента использования. 3.Хлорная кислота - приблизите но 0,1 М 70%-ный (10 мл) и деионизировйнная вода до 1000 мг. 4.Раствор L-цистеин - 2,2% НСЙ 240 мг цистеина солянокислого (доногидрат) и деионизированная вода до 10 мл. Этот раствор приготавливают заново ежедневно. 5.Раствор карбазола - 400 мг 0,4%-ного карбазола и 96%-ный этан до 100 мл. Раствор необходимо хранить приохлаждении. 6.Серная кислота (80%-ная) - 300 мл деионизированной воды и 775 мл HgSO (96%-ной). Воду охлаждают на ледяной бане и осторожно добавляют охлажденную серную кислоту. Необходимо использовать безосколочное стекло. 7.Серная кисдюта - карбазол 100 мл 80%-ной серной кислоты и 0,4%-ный раствор карбазола в 1 мл этанола. Приготовляют заново кажды день. Нужно хранить в холодильнике до самого момента использования. 8.Стандарт фруктозы I 20 m Molar (сырьевой раствор) - 360 мг фруктозы и 0,1 М хлорная кислота до 100 мг. Этот раствор необходимо хранить при охлаждении. 9.Стандарт фруктозы И 1 m Molar - 5,0 мл стандарта фруктозы I и 0,1 М хлорная кислота до 100 мл Готовят заново каждый день и испол зуют в качестве стандарта при- опре лении фруктозы. Образец для опыта разбавляю буфером до концентрации 0,10,8 GlNU/мл. При этом экстинкция ка 0,2-1,7 при 560 нм. Изомеризацию ведут следующим о разом. Из разбав1ленного образца отбира ют 1 мл пробы для опыта и контрол Используют 10X 160 мм пробирки. Включают секундомер и помещают субстрат глюкозы, опытные образцы и образцы контроля в водяную бани при 65°с и закрывают стеклянными пробками. Чеоез 10 мин добавляют 1,0 мл субстрата глюкозы в первый образец и встряхивают. Через 10 мин 10 сек добавляют 1,0 мл субстрата глюкозы во второ опытный образец и встряхивают. Пр должают добавлять в следующую про бирку через 10 мин 20.сек и т.д. Через 30 мин добавляют 10,0 мл 0,1 М хлорной кислоты в первый опы ный образец и удаляют из водяной бани. Через 30 мин 10 сек добавляют 10,0 мл 0,1 М хлорной кислоты во второй опытный образец и удаляют из водяной бани. Повторяют добавление в третий опытный образец через 30 мин 20 сек и т.д. После удаления последнего опытного образца продолжают добавление 10,0 мл 0,1 М хлорной кислоты во все образцы контрольного опыта и затем их также вынимают из водяной бани. В конце добавляют 1,0 мл субстрата глюкозы во все образцы контрольного опыта. Обеспечивают тщательное встряхивание всех образцов и определяют фруктозу. Для этого из охлажденных и тщательно перемешанных образцов пипеткой отбирают О,5О,мл пробы в 10« 160 мм пробирки. К этим пробиркам, присоединяют два стандарта фруктозы (/J ) и две пробирки с деионизированной водой. Пробирки с водой используют в качестве эталона при измерении экстинкции. В каждую пробирку добавляют 100 мл раствора цистеина НС. После встряхивания помещают все пробирки в водяную баню (30°с) . Включают секундомер, добавляют 3,0 мл охлажденного реагента серная кислота - карбазол к первому эталону и тщательно перемешивают на ротамиксере (применяют безосколочное стекло). На 30 сек добавляют 3,0 мл реагента серная кислота - карбазол ко второму эталону и т.д. С интервалами в 30 сек обрабатывают образцы в следующем порядке: контрольный, опытные образцы, стандарты фруктозы. На -30 мин калибруют спектрофотометр на 100%-ное пропускание при 560 нм по первому эталону. На 30 мин 30 сек контролируют настройку спектрофотометра по.второму эталону. На31 мин определяют экстинкцию первого контрольного опыта. Активность вычисляют по следующей формуле: ()-iZ-V-f QlW/r, Std-2auj где S -экстинкция опытного образца;в -экстинкция контрольного опыта; -количество образца после изомеризации, мл-экстинкция стандарта фруктозы;-коэффициент; -количество взятого образца, г; -объем, мл; -коэффициент разбавления. Пример. 1 г энзима растворя ют в буфере и доводят до 100 мл. От бирают 1,0 мл этого раствора и дово дят до 100 мл с помощью буферного раствора. Анализ проводят, как опи сано выше. Показания прибора: S 0,365; В 0,128; S-B 0,237; Std 1,162 пып/ -&)-/. 0,237-i2-m-W NU/г 5ld.2btu - 1,16 -го-i Кпеточный концентрат после иммоб лизации и связывания в результате реакции с глутаровым альдегидом содержит 0-75% неповрежденных клеток и 3-30 вес.% сухого вещества. Весь выделенный катализатор изомеризации глюкозы в растворимой форме остается в концентрате для включения в энзим. Сухое вещество представляет собо остаток после сушки при в течение 16 час. Сушка в течение 24 ча при 60°с в вакууме дает альтернатив ное сухое вещество. Количество глутарового альдегида реагирующего с клеточным концентратом, может быть в интервале от 1 до 100% по весу глутарового альдеги да в зависимости от концентрации су хого вещества. Небольшоеколичество глутарового альдегида приводит к по чению продукта, неприемлемого для промышленного использования, а слиш ком большое количество снижает удельную активность конечного энзима. Подходящий интервал соотношения сухого веса глутарового альдегида и сухого вещества исходного сырья колеблется от 0,01 до 1 (желательно от 0,04 до 0,4 и в особенности от 0,05 до 0,3). Относительное содержа ние используемого глутарового альде гида может меняться в зависимости от типа микроорганизма, даже в зависимости от масштабов промышленного производства конверсии глюкозы., Хлутаровый альдегид можно добавлять к клеточному концентрату в виде коммерческого концентрированного (например 25%-ного),раствора глутарового альдегида, смесь тщательно перемешивают для получения дисперсии глутарового альдегида. Реакция связывания и регенерация продукта могут осуществляться самыми разнообразны1А1 способами. Согласно одной из методик, исход ное вещество представляет собой либо концентрированный автоматизирова ный ферментативный бульон, либо го могенизированный концентрат. Количество добавляемого глутарового аль дегида и температуру выбирают так. чтобы в течение 1 час смесь превратилась в гель. По другой методике исходное вещество, которое может быть либо автоматизированным концентратом, либо гомогенатом, обрабатывают флоккулянтом перед добавлением глутарового альдегида с целью образования агрегатов и усиления реакции связывания. Согласно следующей методике, связанную смесь-вымораживают, с целью образования неоднородного геля, что ведет к получению более пористого продукта. Что касается исходного продукта, можно использовать любую форму энзима, условия стадии связывания не должны выбираться так, чтобы допустить гелеобразование перед замораживанием. После замораживания гель плавится при температуре выше температуры замерзания. Это позволяет продолжить реакцию связывания и образовать пористый продукт. Гомогенат или автоматизированный концентрат обрабатывают глутаровым альдегидом, а затем смесь выдержи;вают в состоянии покоя при температуре окружающей среды, пока, вся масса не превратится в гель. Пока гель мягок, его гранулируют и иногда промывают . После этого гель осушают, желательно при средней температуре (30-50С) , например, до 88% сухого веществаi Затем продукт промывают и вновь осушают. В результате получают гранулированный высокоактивный продукт. При желании грануляцию катализатора изомеризации глюкозы проводят экструзией. Твердость гранулированного продукта контролируют путем регулирования исходного количества глутарового альдегида или степенью промывки. При промывке удаляютнепрореагировавший глутаровый альдегид и получают более мягкий продукт. Реакцию продолжают при осушке, продукта и приводят к его отвердеванию. Последнюю стадию промывки проводят -в основном для удаления очень мелких частиц. Сухие частицы продукта обладают исключительной размерной стабильностью и структурной прочностью, сохраняя высокую активность природного энзима, присущего микробиологическим клеткам. Катализатор изомеризации глюкозы в виде частиц пригоден для многократного использования для конверсии глюкозы во фруктозу в реакторах периодического действия или в колонных реакторах. Клеточный концентрат желательно после стадии автолиза обработать флоккулянтом для аггломерации клеток и клеточных осколков, а затем подвергнуть взаимодействию с глутаровым альдегидом. Хорошо первоначально добавить глутаровый альдегид и затем сразу же после глутарового альдегида или перед фильтрацией раз рушенного геля флоккулянт. После об разования геля его промывают и фильтруют, удаляя воду, флоккулянт и/или непрореагировавший глутаровый сшьдегид. Для фильтрации можно использовать фильтр любого типа. Для переноса суспензии на пресс используют насос. Подходящими являю ся МоЬпонасосы, поскольку они обычно не разрушают сырья. На этой стадни содержание сухого вещества в массе геля повышается, например, с 11 до 30%. После этого фильтпрессну лепешку гранулируют и осушают, напри мер, 88% сухого вещества. В рёзульТате получают твердые частицы с высокой активностью энзима. Основным преимуществом флоккуляции клеточног концентрата является то, что получа ют более обезвреженный гель, что снижает нагрузку на осушительное оборудование. Подходящими флоккулйн тами являются ЕС 25 и Superfloc С 521. Использование физического обезво живания на стадии фильтрования заключается в том, что фильтпрессную лепешку с более низким содержанием водылегче подвергать грануляции, чем гель, который можно только разделить на неправильной формы куски перед осушкой. Фильтпрессн5ю лепешку можно гранулировать на осцилятор ном грануляторе. Другой способ получения частиц из фильтрпрессной Лепешки состоит 13 экструдировании лепешки через отверстия необходимого диаметра на плите. Можно использовать любой экструдер с правильными отверстиями Диаметр отверстий решета экструдера может быть от 200 М до 2 мм или даже больше. При слишком большом диаметре возникают осложнения, связанные с диффузией. С другой стороны, слишком маленький диаметр дает частицы, которые вызывают значитель ные падения давления в крупных колоннах, когда используются реакторы с .неподвижным слоем. Последовательность обработки, включающая стадию замораживания обработанного глутаровнм альдегидом клеточного концентрата, дает преиму щества в технологии при получении продукта. Замораживание можно проводить как после гелеобразования, так и . перед ним, сразу же после смешения концентрата и глутарового альдегида В этом случае реакция полностью 3dканчивается после плавления. После промывки водой и удаления воды получают продукт, имеющий некоторое количество сухого вещества, наприме 30% сухого вещества. После этого продукт осушают, например, до 88% сухого вещества. Замораживание дает пластинчатый или хлопьевидный продукт, который по своей природе является упругим,- волокнистым и/или почти пористым. Если сравнивать его с гранулированными продуктами, продукт процесса замораживания почти не имеет очень маленьких частиц. Еще один вариант процесса включает сушку при температуре ниже 0°С замороженного продукта реакции. Однако такая сушка требует дорогостоящего вакуумного оборудования и приводит к сравнительно высокой стоимости процесса. Поскольку любой вариант испарительной осушки требует технологических затрат, обезвоживание, которому способствует замораживание и флоккуляция, имеет некоторые преимущества. Связанный промытый продукт можно подвергнуть прессованию (на фильтре) для удаления первоначального количества воды и получения продукта с содержанием сухого вещества около 30%. По желанию этот продукт можно использовать для изомеризации глюкозы. Однако предпочтительна некоторая осушка и желателен продукт с содержанием сухого вещества 80%. Микроорганизм, который используют согласно изобретению в качестве источника катализатора изомеризации глюкозы, является Bacillus coagulaus. Этот микроорганизм легко распадается, выделяя как энзим в растворимой форме, так и такие составляющие, как-протеины и нуклеиновые кислоты. Типичными штаммами являются NRRL В-5649 до В-5666 и В-5351. Пример 1. Получение концентрата и иммобилизация. Культивируют клетки Bacillus штамиа NRRL В-5656, содержание катализатор изомеризации глюкозы. Затем клетки удаляют из ферментативного бульона путем центрифугирования на West- talia Sams с самоочищгшзщейся корзиной, рН доводят до 6,3. Анализ показал, что концентрат содержит приблизительно 10 вес.% по объему сухого вещества и около 40% неповрежденных клеток. В 1 кг концентрата добавляют 38 мл коммерческого 50%-ного глутарового альдегида при перемешивании, тщательно перемешивают глутаровый альдегид и клеточный концентрат. После этого реакционную массу выдерживают при температуре окружающей среды в состоянии покоя. Через 1 час происходит гелеобразование реакционной смеси до вязкой массы с консистенцией, напоминающей сырный творог. Массу разрушают умеренным перемешиванием, промывают двумя объемами де ионизированной воды и воду удаляют. Куски геля переносят затем на вакуумный осушительный барабан, где приблизительно 1 кг дегидратируют

при до веса около 130 г. В хоце дегидратации мягкие куски геля превращаются в твердый, устойчивый по размеру материал.

Дегидратированные куски дробят на частицы диаметром менее 1 мм. Выделение энзима изменяется от заГрузки к загрузке, составляет при этом первоначальной активнпсти. Однако около 15 вес.% продукта составляют очень маленькие частицы ( 1-70 мкм).

Пример 2. Иммобилизация пр замораживании.

По методике примера 1 приготовляют 1 кг клеточного отстоя (40% неповрежденных клеток). Затем методику примера 1 повторяют до стадии получения смеси глутатового альдегида и клеточного концентрата и гелеобразования. После этого гель (в том же сосуде) эамооаживают и оставляют на ночь. На следующий день гел расплавляют, поднимая температуру до температуры окружающей среды, и получают водянистую массу. Добавляют еще воды при перемеишвании, а затем зоду удаляют. Продукт сушат на сушильном барабане до веса около 130 г. Конечный продукт состоит из пористых частиц, имеет хлопьевидную внешность. Активность меняется от загрузки к загрузке от 60 до .70%. Однако образование мелких частиц не наблюдается.

Пример 3, Иммобилизация при флоккуляции.

1550 л питательного бульона ферментации coagufaus (NRRL в 5656), производящих катализатор изомерации глюкозы, концентоипуют центрифугированием на Westfafia sanis 15037 при 10°С с образованием отсто содержащего около 12 г сухого веса {105°С) на 100 мл концентрата,

11 кг этого концентрата (рН 7,9) выдерживают при 20с в течение 3 час при комнатной температуре и умеренном перемешивании для того, чтобы вызвать аутолиз клеток coaguPaus. затем рН доводит до 6,5 разбавленной уксусной кислотой. К отстою, имеющему 73% активности и растворимой форме, добавляют 330 мл 50%-иого раствора глутарового альдегида и получают концентрацию около 1,5% вес/об, глутарового альдегида в реакционной смеси. Через 1 час частично связанный гель энергично перемешивают после добавления 20 л дионизированной водьт.

К полученной таким образом суспензии добавляют 80 мл 30%-ного расвора DrewfPoc КС 25 для получ-ения прозрачного раствора. Суспензию отфильтровывают для удаления как можн большого количества воды. Отжатый осадок cyiMET в вакууме при и

затем этот осушенный осадок превращают в частицы размером менее 300 М.

Активность определяют путем изомеризации загрузки в присутствии осушенного распылением порошка из концентрата в качестве эталона. Условия: рН 7,0, 65°С, 0,1 г СоЗО. на 1 л и 2,0,-MjfSO 7Н2О на1л, 40% глюкозы вес,/вес. Смесь продувают азотом. Активность иммобилизированноQ го энзима 70% от эталона. После опыта им лoбилизиpoвaнный энзим выделяют фильтрацией и повторно используют. Это проделывают пять раз и после пятикратного использования не наблюдается значительного понижения

5 активности.

Вторую порцию аутолизированного клеточного концентрата обрабатывают 20 мл 30%-ного Drewf oc ЕС 25 на 1 кг

0 отстоя с последующей реакцией с 1,4% вес./вес. глутарового альдегида .

Получают тот же продукт, Пример 4. Гомогенат (обра5 зование поперечных связей).

12 л отстоя, полученного по методике примера 3, гомогенизируют для того, чтобы получить свободный энзим и другие внутриклеточные протеины

0 путем разрушения клеток.

При рН около 7,5 клеточный концентрат прокачивают насосом через гомогенизатор Manton

Давление 400 кг/см . Гомогонат, обладающий активностью более 95%

5 в растворимой форме, подвергают взаимодействию с 40 мл/л 50%-ного вес./вес. раствора глутарового альдегида в растворе. После протекания реакции в течение 1 час при темпера0 туре окружающей среды образовавшийся гель разрушают механически, разбавляют 20 л деионизированной воды и дальше следуют методике примера 1. Получают необходимый продукт.

5Пример 5, Добавление флоккулянта к гомогенату после глутарового альдеп да.

12 л отстоя, полученного по методике примера 3, гомогенизируют по

0 методике примера 4. Получили 95% активности в растворимой форме. К гомогенату при рН 7,0 и температуре добавляют 50%-нь1й вес,/вес. раствор глутарового альдегида и поf лучают концентрацию 2,0% вес./вес. глутарового альдегида в растворе. Через 1 час гель разрушают механически, разбавляют 2 об. воды и рН доводят до 7,5. Добавляют 150 мл 30%-ного вес./вес. в Dreu.fte ЕС 25

О и получают прозрачную водную суспензию. Смесь фильтруют на рамном фильтрпрессе. Фильтрпрессную лепешку вентилируют сжатым воздухом д.пя удаления некоторого количества сво5 бодной воды. Провентилированную

фильтрпрессную лепешку экструдируют на осевом экструдере МопогоС из Simon Heesen, снабженном экраном с 0,8 мм отверстиями. Продукт cyrjar в осуимтеле с псевдосжиженным слоем с воэдутаным водводом при температуре

300 г загружают в снабженную рубашкой колонну объемом 1 л и при i температуре iSO-C и рН 7,2 прокачивают через колонну со скоростью 1 л/ча 40%-ного вес./вес, в раствор глюкозы )Сонверсия 43%, Раствор глюкозы содержит 0,1 г и 2,0 г Mg-5О/ на 1 л.

Пример 6, Полученг;е концентрата из ферментативного бульона и его иммобилизация.

1000 л бульона ферментации на V/estfa ia Sams № 5ббб, выделяю цих катализатор изомеризации глюкозы концентрируют центрифугированием при IQ°C coag-(J onstlKKl- i5037 на Ьамоочищающемся сепараторе и получают отстой, содержащий 12 г сухого 100 мл концентрата и 56% растворимого энзима. 20 л концентрата обрабатывают буферным раствором 20%-ной водной уксусной кислоты с рН 3,5 с понижением рН концентрата до 6,3. Затем добавляют 800 мл водного раствора 50%-ного глутарового альдегида смесь тщательно переменивают, выдерживают при в течение 45 мин для образования геля. Полученный гель диспергируют в 20 л ионизированной водаз, фильтруют на фильтрпрессе и фильтрпрессную лепешку продувают сжатым воздухом на фильтрпрессе для удаления избытка воды. Частично Осушенный осадок (11,6 кг) гранулируют на колебательном грануляторе и сушат в сушильной печи при 35®С с образованием 2,3 кг очень твердых частиц, которые сохраняюсвои физические свойства даже после перемешивания в 40%-ном вес./вес сиропе глюкозы при температуре 60 С в течение нескольких дней.

Затем гранулы (размером от 88 до 300 М) перемешивают в течение 20 час при 65°С в водной среде, содержащей 40% вес,/вес. глюкозы, 0,1% вес./об. M S04-7H20 и 0,01 вес./об. при рН 6,6 и получают 63% от активности осушенного распылением порош-i ка концентрата, испытанного в тех же условиях.

Осадок с поперечными связями/ полученный по описанной методике из того же отстоя, экструдируют на осевом экструдере с размером экрана 0,5 мм и осушают в псевдоожиженном слое с воздушным подводом при , Получают частицы цилиндрической формы с очень небольшим разбросом по размерам.

Некоторое количество этого же клеточного концентрата смеиливают с глутаровым альдегидом при рН 6,3,

получают концентрацию 1,2%, пометают на полки осуиштельной печи циркулирующим воздухом при температуре , Конечный осадок размегчивают в ступке и испытывают как описано выше. Получают 43% от активности эталонного осушенного распылением порошка.

10 л того же клеточного концентрата гомогенизируют с помошью Manfon Caufin . гомогенизатора при 400 атм и получают гомогенат с более чем 95%-ной активностью в растворимой форме.

100 мл гомогената перемесчивают в течение 20 мин с 5 мл 20%-ного вес./вес. раствора глутарового альдегида при рН 6,8, распределяют на поверхности в виде 1 см слоя, сушат при температуре 20°С и размалывают в ступке с образованием 11,6 г частиц. Частицы перемешивают в течение 20 мин в 200 мл деионизированной во и сушат с образованием 9,7 г твердых частиц.

Твердые частицы загружают в снабженную рубашкой колонну, выдерживаемую при температуре 65°С, и через ее пропускают со скоростью 45 мл/ч сырье, состоящее из 40% вес./вес, глюкозы и 0,1% вес./вес. Mg5O/ -7Hg O при рН 7,8. Через 44 час конверсия составляет 45,2%.

Пример 7i Концентрат, замораживание.

1000 л бульона ферментации Bacillus coagulans, выделяющих катализатор изомеризации глюкозы, концентрируют центрифупированием при 10°С на Westfalia Sams 15037 сепараторе и получают отстой, содержащий 12 г сухого веса на 100 мл отсто концентрата. Этот отстой аутализируют в течение 8 час при температуре 15®С и рН 7,2. Растворимая активность 84%. 10 л аутолизированного концентрированного отстоя охлаждают до , смешивают тщательно с 300 мл 50%-ного вес./вес. раствора глутарового альдегида, помещают на лолку и понижают температуру до -20®С для замораживания. После того, как замораживание окончено, замороженный концентрат расплавляют при температуре 2Ос и полученную пористую массу диспергируют в 20 л деионизированной воды, фильтруют на корзиночной центрифуге, снабженной грубой фильтрационной тканью, гранулируют на колебательном грануляторе с экраном 7 меш, сушат в осушителе с псевдоожиженным слоем с воздушным подводом при температуре 60°С и получаиот волокнистые, пористые гранулы.

Гранулы (размером от 83 до 300 М) перемешивают в течение 20 час при температуре в водной среде, содержащей 40 вес.% глюкозы, 0,2% вес./об. MgSO; 7Н2О и 0,1 вес.% CoSO 7Н2О при рН 6,6. Получают 79% от активности эталонного осушенного распылением порошка. Гранулы, полученные этим же способом, исключая стадию осушки, мене твердые, но более упругие. Они проявляют 81% активности. Пример 8. Различные концен рации энзима. Три порции по 100 МП гомогената примера 6 более чем с 95% растворимого энзима обрабатывают следующим образом: 1.Смешивают с 10 мл 20%-ного вес./вес. глутарового альдегида при рН 6,8. 2.Аналогично 1 , только сначала разбавляют 100 мл деионизированной воды. 3.Аналогично 1 , только сначала разбавляют 200 мл деионизированной воды. Все три порции замораживают при температуре -18°С, затем расплавляю при 20°С, образовавшиеся пористые вещества диспергируют в 300 мл даИонизированной воды, фильтруют, су(иат при 20°с и гранулируют; 5 г каж дого образца испытывают в снабженно рубашкой колонне при 65 С, рН 7,8, скорости 30 мл/час 40%-ного вес./ве раствора глюкозы, содержащего 0,1 вес./об и-0,01 % вес CoSO VHgO, 20 час. Процент конверсии первой порции 46,4, второй - 6,8, третьей - 47,4. Пример 9. Сравнение образцов с различной степенью разрушени клеток. Концентрат (60% разрушенных клеток) и гомогенат (более 95% разрушенных клеток) готовят по методике примера 6. 200 мл каждого образца смешивают в течение 20 мин с 8 мл 50%-ного вес./вес. раствора глутарового аль дегида, замораживают при температур и расплавляют при 20с. Полученный пористый продукт отжимают, разрушают, перемешивают в течение 20 мин в 1 л деионизированной воды, ;фильтруют на воронке Бюхнера, прессуют на фильтре, диспергируют в 1 л деионизированной воды, вновь фильтруют, сушат при 20°С и гранулируют; 5 г каждого гранулята испытывают в колоннах по методике примера 6 при скорости подачи сырь 30 мл/час. Через 20 час получены следующие результаты: конверсия концентрата 40%, гомогената - 45,1%. Замеряют жесткость частиц после опыта, частицы концентрата мягкие, а частицы гомогената жесткие. Образец неразрушенных клеток Arthrobacter В 3726 обрабатывают так же, однако иммобилизация не уд летворительная, так как не образуется устойчивых по форме тел. Пример 10. Сравнение образцов с различной степенью разрушения клеток. Концентрат а, имеющий 56% разрушенных клеток, был получен по методике примера 6, в имеющий более 95% разрушенных клеток, так же по методике примера 6. 200 мл каждого из них смешивают в течение 20 мин с 8 мл 50%-ного вес./вес. раствора глутарового альдегида, замораживают при температуре , расплавляют при , полученныйпористый продукт отжимают, разрушают, перемешивают в течение 20 мин в 1 л деионизированной воды, Ьтфильтровывают на воронке Бюхнера, Ьпрессовывают на фильтре, вновь диспергируют в 1 л деионизированной 8оды, отфильтровывают, осушают при 20°С и гранулируют; 5 г каждого гранулята испытывают в колоннах по методике примера 6, используя 40%-ную вес./вес. глюкозу при скорости подачи 30 мл/час. Через 20 час получены следующие результаты: конверсия концентрата - 40,, концентрата - 45,1. Определение жесткости после опыта дало следующие результаты: а - мягйий продукт, в жесткий продукт. Пример 11. Требования глутарового альдегида, концентрат и гомогенат. Гранулы готовят из концентрата (55% разрушенных клеток) и из гомогената (96% разрушенных клеток) по методике примера 10, но используя различные концентрации глутарового альдегида. Затем их перемешивают в течение 20 час в деионизированной воде при , после чего определяют жесткость по следующей методике: частицы сжимают сильно насколько возможно между двумя пальцами и результаты определяют по следующей шкапе: 1Полностью склеены 2Склеены в значительной степени 3Склеены только в малой степени 4Нет Склеивания, жесткие 5Очень жесткие 6В высшей степени жесткиеМинимальная жесткость, пригодная в промышленных масштабах, равна 3 .или 4. В таблице приведены результаты по, определению жесткости гранул.