СПОСОБ ОБРАБОТКИ СПОНГИОЗНОГО КОСТНОГО КСЕНОТРАНСПЛАНТАТА ДЛЯ КОСТНОЙ ХИРУРГИИ Российский патент 2003 года по МПК A01N1/02 A61L27/14 

Изобретение относится к медицине, а именно к восстановительной костной хирургии, и может быть использовано для обработки спонгиозного костного ксенотрансплантата.

Известно, что лучшим способом костной пластики является замещение кости костью. Другие же пластические материалы оцениваются с точки зрения того, насколько они близки к природной костной ткани. В медицине издавна применяются костные ауто-, алло- и ксенотрансплантаты, причем первые из них по своим биологическим свойствам являются, естественно, лучшими. Алло- и ксенотрансплантаты уступают им благодаря наличию факторов тканевой несовместимости, требующих преодоления, что особенно важно при использовании ксенотрансплантатов и резко ограничивает их применение.

Костные ксенотрансплантаты благодаря их высокой антигенности, связанной с видовыми различиями донора и реципиента, требуют наиболее сильных воздействий при обработке с целью предупреждения явлений тканевой несовместимости, могущих развиться после ксенотрансплантации.

Основными методами снижения антигенности костных ксенотрансплантатов до последнего времени были различные способы денатурации и коагуляции входящих в их состав белков путем воздействия сильными химическими реактивами или высокой температурой с целью так называемой "депротеинизации".

Известен получивший наибольшее распространение за рубежом способ получения так называемой "Кильской кости" (Kiel Bone), разработанный в ФРГ [1], заключающийся в последовательной обработке губчатых бычьих ксенотрансплантатов раствором перекиси водорода в высокой концентрации и парами эфира по способу R.Maatz и A. Banermeister (патент 9616154 ФРГ, НКИ 30 Н 2/36, 1957). Однако специальными экспериментальными исследованиями многих зарубежных авторов было установлено, что этот материал часто рассасывается [2], а по клиническим наблюдениям результаты костнопластических операций с использованием "Кильской кости" оказались в целом неудовлетворительными [3], что авторы публикаций связывают с отрицательным воздействием применяемых химических реактивов на костное вещество трансплантатов и их пластические свойства.

В течение последнего десятилетия предложен и рекомендуется для практического применения наиболее близкий по технической сущности к заявляемому способ получения нового пластического материала Pyrost^® (ФРГ, 1998), испытанный при костной пластике в эксперименте и в клинике (более чем у 1000 больных), представляющий собой бычий костный спонгиозный ксенотрансплантат, подвергнутый воздействию высокой (1250^oС) температуры [4]. Авторы называют его "керамизированной костью". Однако применение этого материала, по рекомендациям авторов, ограничено замещением небольших костных дефектов при использовании в качестве дополнения к аутогенным костным трансплантатам, причем, к тому же, противопоказанием является наличие инфицированного костного ложа.

Общим недостатком указанных ксенотрансплантатов, включая и Pyrost^®, является глубокая денатурация основного вещества кости и коагуляция белка при их получении, лишающие их биологических преимуществ естественной костной ткани и уравнивающие предлагаемые материалы с многочисленными неорганическими заменителями кости, не способными к истинной ассимиляции их тканями костного ложа (металл, полимеры, керамика и др.).

Задача изобретения заключается в создании способа обработки спонгиозных костных ксенотрансплантатов, снижающего их антигенность до уровня, приемлемого для клинического применения, при максимальном сохранении нативных пластических свойств костной ткани.

Задача изобретения решается тем, что производят обработку губчатой кости, полученной от крупного рогатого скота или других животных-доноров, которая предполагает:
- энзиматическую обработку в растворе протеолитического фермента террилитина в концентрации 60 ПЕ на 1 мл в течение 24 ч при температуре 37^oС;
- тщательное промывание подогретым до температуры 37^oС 0,9% раствором хлористого натрия до полного удаления костного мозга из межбалочных пространств;
- выдерживание в фосфатном буфере при рН 7,4 в течение 4 суток при температуре 37^oС;
- обработку тритоном Х-100, растворенным в физрастворе, в концентрации 0,1% в течение 24 ч при комнатной температуре с последующим промыванием 0,9% физраствором.

Предпосылки для решения задачи, определяющего преимущества предлагаемого способа получения пластического материала, созданы благодаря научным достижениям в области трансплантологии и трансплантационного иммунитета, базирующихся на клинических экспериментальных исследованиях основоположника учения о трансплантационном иммунитете, лауреата Нобелевской премии Питера Медавара, его современников и соотечественников, в особенности тех работах, которые относятся непосредственно к костной трансплантации в эксперименте [5, 6, 7], открывших пути снижения антигенности костных ксенотрансплантатов и их использования в клинической медицине без подбора доноров по антигенной совместимости и применения иммуносупрессивных воздействий. Учитывая уникальные биологические особенности костной ткани, преимущественно состоящей из неорганических веществ (70%), и сравнительно низкую антигенную активность ее органического компонента - опорного коллагена, значимость индивидуальной и видовой принадлежности трансплантируемой кости не является решающей.

Из специальной литературы по трансплантационному иммунитету к настоящему времени известно:
1) трансплантационные антигены кости сосредоточены, главным образом, в немногочисленных собственных костных клетках (остеоцитах), преимущественно в их оболочках; 2) по своей химической природе трансплантационные антигены, содержащиеся в кости, это, главным образом, водорастворимые гаптеновые гликопротеиды, или гидрофобные гликопептиды; 3) межклеточное вещество, опорный коллаген, обладает намного более низкой видовой специфичностью в сравнении с другими белками организма; 4) минеральные вещества (гидроксиапатит - основной компонент кости) не имеет антигенных свойств; 5) Т-антигены, определяющие трансплантационный иммунитет, имеющий клеточную природу, в отличие от Н-антигенов, ответственных за продукцию гуморальных антител, сравнительно нестойкие и разрушаются рядом щадящих, мягких, физических и химических воздействий.

Способ осуществляется следующим образом.

Полученный от животного-донора блок спонгиозной кости после удаления кортикальных пластинок помещают в раствор протеолитического фермента - террилитина, концентрацией 60 ПЕ в 1 мл с таким расчетом, чтобы объем раствора в 10 раз превышал объем обрабатываемых фрагментов спонгиозы. Емкость помещают в термостат при температуре 37^oС на 24 ч, после чего трансплантаты промывают сильными струями 0,9% физраствора, подогретого до температуры 37^oС в течение 10 мин. Полноту удаления костного мозга контролируют визуально. При необходимости всю процедуру можно повторить до 2-3 раз.

Для экстракции свободных водорастворимых антигенов (гидрофобных гликопептидов) спонгиозный ксенотрансплантат, освобожденный от костного мозга, помещают в 0,1 М фосфатный буфер с рН 7,4 того же объема и при температуре 37^oС на 4 суток, меняя раствор ежесуточно.

Для удаления связанных антигенов в качестве мягкого детергента применяют 0,1% раствор тритона Х-100, которым в объеме, в 5 раз превышающем объем трансплантата, заливают последний на 24 ч при комнатной температуре, периодически встряхивая.

По окончании указанных этапов обработки полученный спонгиозный ксенотрансплантат промывают физраствором в течение 10 мин, стерилизуют общепринятым способом (окисью этилена, растворами антисептиков и антибиотиков и др. ) и консервируют глубоким замораживанием. Применение трансплантата возможно в сроки от 2 до 6 месяцев после окончания обработки.

С целью оценки полученного пластического материала были поставлены эксперименты на 77 кроликах, которым произведено 80 ортотопических и 36 гетеротопических трансплантаций губчатой костной ткани, полученной от животных разных видов, различными способами обработанной. Для оценки результатов экспериментов использованы оригинальная методика остеоспонгиозных тестов, микрорентгенография, гистологические исследования. Количественные данные обрабатывались статистически.

В процессе исследований трансплантировались как нативные кости, так и прошедшие обработку различной интенсивности. Установлена прямая связь полученных результатов с глубиной обработки, что потребовало обязательного применения всех перечисленных в описании способа этапов.

Использование оптимального варианта способа обработки ксенотрансплантата позволило у 28 животных получить положительный эффект - полную ассимиляцию пересаженной ксеногенной кости без выраженных явлений тканевой несовместимости. Впервые наблюдались не описанные ранее в мировой литературе истинное сращение костных ксенотрансплантатов с костной тканью ложа, лакунарная резорбция и крадущееся замещение ксеногенной кости собственной костной тканью реципиента, явление транзиторного "тканевого химеризма" со слиянием костной ткани животных двух различных видов, с остеопластической оппозицией новообразованной кости на балочках ксенотрансплантата. Полное замещение пересаженной кости новообразованной происходит, в основном, так же, как это наблюдается при ауто- и аллопластике, но в более длительные сроки с участием процессов аутолиза в толще костных балочек ксенотрансплантата. Все это обеспечивало благоприятные результаты применения обработанных по заявленному способу спонгиозных ксенотрансплантатов. Отрицательные результаты пластики отмечались только в случаях нарушения технологии получения пластического материала.

В качестве теста на антигенность ксенотрансплантатов использована классическая методика, примененная названными ранее [5, 6, 7] основоположниками учения о трансплантационном иммунитете - изучение реакции регионарных лимфатических узлов на гетеротопическую пересадку различных ксенотрансплантатов. Изучались: объем и масса регионарных лимфатических узлов и морфометрическая характеристика их клеточного состава. Особое внимание обращалось на соотношение малых, средних и больших лимфоцитов в кортикальных и паракортикальных зонах лимфатических узлов. Получены статистически достоверные данные о резком уменьшении антигенности спонгиозных костных ксенотрансплантатов, обработанных по заявляемому способу, причем остаточная антигенность была тем меньшей, чем более полно произведена обработка. При сравнении клеточных реакций лимфатических узлов на обработанные по нашему способу бычьи ксенотрансплантаты и на кроличьи аллотрансплантаты они оказались весьма близкими. Так, число малых лимфоцитов в кортикальной зоне в случаях аллотрансплантации составляло 51,67±1,26-58,01±0,42%, в то же время в аналогичной зоне после пересадки обработанных по предлагаемому способу ксенотрансплантатов с редуцированной антигенностью эти показатели составили 55,67-59,33±0,42%. Близкие показатели получены и по количеству средних лимфоцитов.

В целом, исследования показали, что в эксперименте предлагаемым способом получен новый пластический материал на базе ксеногенной спонгиозной костной ткани путем максимального снижения антигенности трансплантата при сохранении его биологических и пластических свойств.

Источники информации
1. Maatz R. , Bauermeister A. Verfahrung zur Präparierung von zur Verpflanzung geeigneten Knochen // Deutsches Patentamt. Patentschrift 961654.

2. Uehlinger E. Die allogeneinen Grundlagen der Transplantation //Beitr. Orttop. Traumat. - 1967. - B.M. 11. - S.610-623.

3. Chakour К. Klinische Untersuchungen über die Zeitungsfähigkeit der Kieler Knachen Spanes // Ztschr. Orthop. - 1974. - B.112 1. - S.207-217.

4. Mittelmeier H, Mittelmeier W, Gleitz M. Mineralisches, spongiöses Knochenersatzmaterial Pyrost. Experimentelle Grundlagen und 13 Jahre klinische Erfahrung bei 1000 Fällen//Orthopäde. - B.27 2. - S.121-136.

5. Medawar P. The future of transplantation biology and medicine // Transplant. Proc. - 1969. - V.1. 3. - P.666-669.

6. Burwell R G., Gowland G. Studies in transplantation of bone III. The immune responses of lymph nodes draining components of fresh homologous cancellous bone and homologous bone treated by different methods // J. Bone Joint Surg. - 1962. - V.44. -В. 1. - Р.131-138.

7. Burwell R. G. et al. Studies in the transplantation of bone V. The capacity of fresh and treated homografts of bone to evoke transplantation immunity // J. Bone Joint Surg. - 1963. - V.45. - В. 2. - Р.386-401.

Изобретение относится к медицине, а именно к восстановительной костной хирургии. Способ обработки спонгиозного костного ксенотрансплантата для костной хирургии заключается в том, что спонгиозный костный ксенотрансплантат (СКК) помещают в раствор террилитина в концентрации 60 ПЭ на 1 мл в течение 24 ч при температуре 37^oС, промывают ксенотрансплантат сильными струями подогретого до той же температуры 0,9%-ного физиологического раствора в течение 10 мин, после чего СКК выдерживают в течение четырех суток в 0,1 М фосфатном буфере при рН 7,4 и температуре 37^oС, а затем обрабатывают СКК 0,1%-ным раствором тритона Х-100 в течение 24 ч при комнатной температуре с последующим промыванием 0,9%-ным физиологическим раствором. Технический результат - способ обеспечивает снижение антигенности спонгиозных костных ксенотрансплантатов при максимальном сохранении нативных пластических свойств костной ткани.

Способ обработки спонгиозного костного ксенотрансплантата для костной хирургии, включающий применение физических воздействий и химических реактивов, отличающийся тем, что спонгиозный костный ксенотрансплантат (СКК) помещают в раствор террилитина в концентрации 60 ПЭ на 1 мл в течение 24 ч при температуре 37^oC с последующим промыванием ксенотрансплантата сильными струями подогретого до той же температуры 0,9%-ного физиологического раствора в течение 10 мин, после чего СКК выдерживают в течение четырех суток в 0,1 М фосфатном буфере при рН 7,4 и температуре 37^oC, а затем обрабатывают СКК 0,1%-ным раствором тритона Х-100 в течение 24 ч при комнатной температуре с последующим промыванием 0,9%-ным физиологическим раствором.