КОНСЕРВАНТ ДЛЯ ХРАНЕНИЯ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОК Российский патент 1995 года по МПК C12N5/02 A01N1/00 

Изобретение относится к биотехнологии и касается составов сред-консервантов для хранения (или транспортирования) перевиваемых клеток и может быть использовано для вирусологических исследований с вирусами, имеющими большой цикл размножения (например, вирусы парагриппа).

Известен способ сохранения культур клеток животных (авт. св. СССР N 1339127, 1985), позволяющий длительное время поддерживать жизнеспособность культуры клеток. Суспензии клеток животных СПЭВ, ПТ-80 и ТР хранят в предварительно обработанных силиконом емкостях в среде роста с 10% сыворотки крупного рогатого скота (КРС). Все три перевиваемые культуры клеток при хранении способны к длительному пассированию в течение 2 лет (срок наблюдения).

Известна среда для консервации клеточных культур (авт. св. СССР N 1192762, 1984), содержащая питательную среду и криопротектор, в качестве которого использован оксиэтилированный глицерин, среду 199 или 0,5%-ный гидролизат лактольбумина на растворе Хэнкса. Известная среда может быть использована при низкотемпературной консервации культур клеток.

Известен также способ хранения культуры микроорганизмов путем подращивания культуры и выдерживания ее при пониженной температуре (авт. св. N 1157054, 1981). Подращивание проводят в течение 3-4 ч и хранят культуру в 2% -ном сывороточном агаре при 4-10^оС.

Известен способ консервации клеток Fesarlum Moniliforme Pg-7 путем замораживания в среде криопротектора, в качестве которого используют 1-3%-ный раствор сахарозы или 1-5%-ный раствор глицерина. Известный способ обеспечивает 100%-ную жизнеспособность клеток.

Известен способ хранения культур бактерий (авт. св. СССР N 1074900, 1982), в котором предусмотрен посев суспензий бактерий в пробирку с питательной средой, содержащей тиосульфат натрия в качестве источника энергии, источник азота, минеральные соли, дрожжевой экстракт и выщелочный агар. Известный способ позволяет сохранять в течение длительного периода времени высокую активность и сохранность культур.

Известен способ сохранения иммунокомпетентных клеток путем культивирования их в питательной среде (авт. св. СССР N 1073281, 1983), при котором питательную среду предварительно охлаждают до 5-15^оС и вводят в нее 10%-ный раствор желатина. Затем питательную среду постепенно охлаждают и хранят при температуре от 0 до 4^оС.

Известен способ хранения культур клеток в среде поддержания (авт. св. СССР N 905281, 1980), в качестве которой используют ультрафильтрат сывороточной ростовой среды, содержащей компоненты с молекулярным весом до 14 тыс. Да. Использована ростовая питательная среда Игла, содержащая 10% сыворотки, в которую помещают перевиваемые культуры клеток ВНК-21. Через 2 дня ростовую среду меняют на поддерживающую, в качестве которой используют ультрафильтрат ростовой среды, и инкубируют при 37^оС. При ежедневной смене среды роста жизнедеятельность клеток сохраняется в течение 40 сут.

Известен консервант для микрофлоры (авт. св. СССР N 514018, 1974), содержащий кислый фосфатный натрий, хлористый натрий и вазелиновое масло. Консервант может быть использован в эпидемиологических и микробиологических исследованиях.

Хлористый натрий вводят для поддержания жизнеспособности микроорганизмов, а вазелиновое масло для уменьшения испарения консерванта.

Известен способ стабилизации клеточных мембран (заявка Франции N 2617185 кл. С 12 N 5/09, 1988) путем обработки их бифункциональным стабилизатором, который способствует их отверждению и консервации клеток.

Известен способ сохранения и поддержания активности микроорганизмов (международная заявка (РСТ) N 87/06257, кл. С 12 М 1/12, 1987) и способ замораживания и хранения биологических клеток или тканей (заявка Японии N 1-60441, кл. А 01 N 1/02, 1989), в которых используют холод, подаваемый в камеру с суспензией биологических клеток или тканей.

Известна транспортная среда для микроорганизмов (заявка ФРГ N 3812194, кл. С 12 N 1/20, 1989), состоящая из 2-10 г агара, 1-3 г мясного экстракта, 0,1-1,0 г хлорида натрия, 0,1-0,5 г хлорида кальция, 0,1-0,5 г хлорида магния, 0,5-2,0 г триоглюколята натрия, 2,0-10,0 г глицеринфосфата натрия, воды до 1000 г. Среда имеет рН 7,3±0,1, при 25^оС (ПРОТОТИП).

Анализируя известные консерванты для сохранения клеток или тканей, можно сделать вывод о том, что в них либо необходимо применение криопротекторов при замораживании объектов хранения, либо известные консерванты сложны в изготовлении.

Целью изобретения является упрощение изготовления консерванта.

Для этого в известном консерванте для хранения (или транспортирования) культуры первичных и перевиваемых клеток, содержащем основу, стабилизатор состояния клеток и воду, в качестве стабилизатора состоянии клеток используют экстракт растительный конденсированный; среду роста +5% НБС в качестве основы.

Экстракт растительный конденсированный (Эраконд) представляет собой препарат, полученный из люцерны (сена люцерны) при обработке экстрагентом, содержащим в своем составе растворимые соли металлов в мг на 1 кг растительной массы, например, в следующем соотношении: Мо 8,0, Ва 10,0, Рв 20,0, Со 1,05, V 1,0, Сz 0,5, Zn 200,0, Fe 300,0, Sn 40,0.

Смоловидную форму Эраконда растворяли в бидистиллированной воде в течение 1 сут при 20-22^оС для получения 10%-ного раствора. Флаконы с раствором центрифугировали в течение 15 мин при 3000 об/мин. Недостаточную жидкость фильтровали через систему фильтрующих (0,45 мк) и стерилизующих (0,22 мк) фильтров фирмы "Миклипор" и ампулировали.

В качестве объекта исследования использовали культуру перевиваемых клеток Л-41, в среду культивирования которой (среда 199) вносили стерильный раствор Эраконда до получения конечной концентрации 0,5; 1,0; 3,0; 5,0. Среда роста содержала до 5% нативной бычьей сыворотки.

При определении оптимальной концентрации Эраконда в среде культивирования Л-41 установлено.

В контрольной культуре клеток (без Эраконда) через 24 ч обнаруживались крупные клетки полигональной формы со светлой цитоплазмой и четкими границами. Плотность монослоя была неполной.

Через 72 ч инкубации клетки формировали плотный монослой с мелкой зернистостью в цитоплазме. На 4 сут роста контрольная культура содержала около 10% дегенерирвоанных клеток в монослое. При дальнейшем инкубировании деструктивные процессы усиливались и на 7сут основная часть монослоя представляла собой дегенерированные клеточные элементы.

Культура Л-41₅ (среда роста с 5%-ным содержанием Эраконда) на 2 сут инкубирования формировала монослой, представленный мелкими клетками округлой формы со светлой прозрачной цитоплазмой и выраженными границами. Ровный и плотный монослой сохранялся до 23 дн. В контрольной культуре в процессе старения в монослое появлялись участки наслоения в виде трехмерных клеточных структур.

Культура Л-41₃ (среда роста с 3%-ным содержанием Эраконда) через 24 ч инкубирования представляла собой неплотный монослой. Клетки имели мелкие размеры с отчетливо конструированными ядром и 3-5 ядрышками. Имелись дегенерированные клетки. Через 96 ч монослой был разряженным, отслоившиеся клетки находились в среде роста. Отмечалась выраженная цитоархитектоника клеток монослоя. На 7 сут наблюдалось усиление деструктивных процессов и на стекле сохранялись лишь отдельные клеточные элементы.

Культура клеток Л-41₁ (среда роста с 1%-ным содержанием Эраконда) через 24 ч инкубирования формировала такой же монослой, как в контроле, но клетки имели более мелкие размеры, много клеток находилось в среде роста. На 4 сут роста в монослое образовывались окна из-за массового отслоения клеток от стекла. Клетки имели мелкие размеры, округлую форму. Часть клеток дегенерировали. На 7 сут роста образовывались симпласты, на 9 сут наблюдалась полная дегенерация клеток культуры.

Культура клеток Л-41_0,5 (среда роста с 0,5%-ным содержанием Эраконда) не формировала монослоя.

Таким образом, культивирование клеток Л-41 в среде роста, содержащей 5% -ный раствор Эраконда, может быть использована в качестве консерванта в условиях длительного хранения и транспортирования клеточной культуры.

Использование: биотехнология, микробиология. Сущность: консервант для хранения культуры перевиваемых клеток содержит питательную среду 199, нативную бычью сыворотку, а также в качестве стабилизатора клеток - экстракт люцерны конденсированный в концентрации 4,5 - 5,0%.

КОНСЕРВАНТ ДЛЯ ХРАНЕНИЯ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОК, содержащий питательную среду, нативную бычью сыворотку, стабилизатор клеток, отличающийся тем, что в качестве стабилизатора он содержит экстракт люцерны конденсированный, а в качестве питательной среды среду роста 199 при следующем соотношении компонентов, мас.

Нативная бычья сыворотка 4,5 5,0
Экстракт люцерны конденсированный 4,5 5,0
Среда роста 199 Остальное