ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ПЕРВИЧНЫХ И ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОК Российский патент 1995 года по МПК C12N5/02 A01N1/00 

Изобретение относится к биотехнологии и касается новых составов питательных сред (ПС) для выращивания in vitro культуры первичных и перевиваемых клеток. ПС может быть использована для вирусологических исследований с вирусами, медленно проявляющими цитопатическое действие в культуре клеток (например, микствирусы).

Известна ПС для выращивания растений in vitro способом тканевых культур или из мерисистем (авт. св. СССР N 1558984, 1988), в которой мазоинозит, обычно используемый при добавлении в ПС для последующего синтеза из него в растения карбоновых кислот, заменен введенными непосредственно в среду солями яблочной лимонной и изо-лимонной кислот. Кроме того, в ПС дополнительно вводят соли итаконовой и α -кето-глутаровой кислот.

Известна ПС для культивирования клеток животных и человека, необходимых для производства вирусных вакцин, моноклональных антител, биологически активных веществ (БАВ) и проведения диагностических исследований (авт. св. СССР N 1520095, 1987), содержащая в качестве стимулятора роста 1-5% экстракта цветочной пыльцы, а также 0,5-10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (КРС) и 85-90% синтетической ПС РРМ1-1640.

Известно использование в качестве ростового фактора концентрата сывороточных белков молочной сыворотки, полученных ультрафиксацией, или смесь концентрата сывороточных белков молочной сыворотки с сывороткой крови КРС в соотношении (5-20): 1 (авт. св. СССР N 1507790, 1986). Изобретение может быть использовано в вирусологии и биотехнологии для получения клеток в большом количестве.

Известна ПС для культивирования растительных клеток и протопластов (авт. св. СССР N 1331892, 1986), которую готовят путем растворения в бидистиллированной воде 28 компонентов, в том числе в качестве стимуляторов роста аммоний хлористый, калий фосфорнокислый, натрий ЭДТА, глютамин, гидролизат казеина, α -нафтилуксусную кислоту, ксилозу и глюкозу.

Известен способ определения пролиферативной активности клеток (их способности к размножению) (авт. св. СССР N 1331891, 1985), предусматривающий инкубирование клеток в изотоническом растворе.

Известен способ культивирования клеток человека и животных путем засева клеточной суспензии на синтетическую ПС, дополнительно содержащую сыворотку крови млекопитающих и сыворотку крови овцематок 130-135 дн суягности (авт. св. СССР N 1257086, 1985). Способ может быть использован для культивирования клеток для производства вирусных вакцин, моноклональных антител, БАВ, диагностических исследований. Способ повышает пролиферативную активность клеток за счет улучшения ростовых и адгезивных свойств среды.

Известен способ культивирования островковых клеток поджелудочной железы (авт. св. СССР N 1063830, 1982), в котором суспензию клеток обрабатывают средой 199, содержащей 50% бычьей сыворотки, и инкубируют в питательной смеси, содержащей среду 199, 0,5%-ный раствор гидролизата лактальбумина, бычью сыворотку в соотношении 1:1:0,5 и 300-500 мг. глюкозы.

Известна ПС для выращивания культур клеток животных (авт. св. СССР N 1025722, 1981), включающая гидролизат белка, cолевой раствор и сыворотку крови.

Известна культуральная среда, применяемая в бактериологии для культивирования in vitro (заявка Франции N 2630456, кл. С 12 N 5/02, 1989) состоящая из твердого геля, содержащего 70-80% воды, возможно с питательными добавками.

Известен способ культивирования микроорганизмов (эк. патент ГДР N 270320, кл. С 12 N 1/00, 1989), при биотехнических процессах превращения веществ, которые проводят при помощи растущих клеток. Микроорганизмы культивируют по способу турбидостата при оптимальной для роста температуре.

Известна питательная среда (эк. патент ГДР N 257644, кл. С 12 N 1/00, 1988), которую применяют, в частности в медицине и ветеринарии, фармацевтической промышленности и пищевой промышленности, для выращивания бактерий типа Campylo, Bordetella и Legionella. При добавлении гуминовой кислоты получают ПС, которая является достаточной без добавок (таких как кровь и/или активированный уголь), связывает или нейтрализует все токсины, прозрачна и дает возможность поставить точный диагноз.

Известна твердая ПС (заявка Японии N 62-186784, кл. С 12 N 1/00, 1987) содержащая воду для выращивания растительных и животных клеток или микроорганизмов, которая в качестве коллоидообразователя содержит ксантан и смолу рожкового дерева в соотношении 1:1.

Известен способ получения in vitro инфекционных бактериальных спор (международная заявка (РСТ) N 87/05928, кл. С 12 N 3/00, 1987) в жидких средах, содержащих крахмал, трегалозу, дрожжевые экстракты дикалийфосфат, карбонат кальция и ионообменную смолу.

Известна недорогая ПС (заявка Японии N 62-166883 кл. С 12 N 5/00, 1987), для культивирования животных клеток. Основой среды являются питательные вещества, например, сахариды, сыворотка крови (например, теленка).

Известен способ культивирования клеток (международная заявка (РСТ) N 88/08448, кл. С 12 N 5/00, 1988) предусматривающий рост клеток в присутствии водной среды на поверхности слоя синтетического полимерного геля. Указанным способом культивируют, например, фибробласты и/или эпителиальные клетки. Среда содержит факторы роста, например фактор роста фибробластов. Продукт применяют в качестве повязок на раны, в частности в качестве заменителя кожи, например, при лечении ожогов.

Известен способ культивирования растительной ткани (заявка ЕР N 0282164, кл. С 12 N 5/00, 1988) в жидкой среде, в которую периодически подают фитогормон.

Недостатками рассмотренных питательных сред являются либо относительная дороговизна используемых добавок, либо недостаточная эффективность воздействия таких добавок на ростовую активность.

Целью изобретения является повышение эффективности ПС путем стимулирующего действия на пролиферативную активность клеток и выживаемость клеточной культуры.

Для этого в известную ПС, содержащую питательную основу, введены новые компоненты, а именно: в качестве стимулятора роста использован экстракт растительный конденсированный (Эраконд).

Существенность отличий предлагаемого изобретения заключается в следующем:
предлагаемое техническое решение соответствует критерию изобретения "новизна", так как содержит новую совокупность существенных признаков.

Дополнительный (сверхсуммарный) эффект заключается в обеспечении нового положительного эффекта повышении эффективности ПС.

ПС изготавливается следующим образом.

Смоловидная форма Эраконда с активностью 46 ед. растворяется в бидистиллированной воде в течение 1 сут при 20-22^оС для получения 5%-ного раствора, разливается в емкости (например, флаконы) и центрифугируется в течение 15 мин при 3000 об/мин. Надосадочная жидкость пропускается через фильтрующие (0,45 мк) и стерилизующие (0,22 мк) фильтры (например, фильтры фирмы "Миллипор") и ампулируется.

В качестве объекта исследования используется культура перевиваемых клеток Л-41, в среду культивирования которой (среда 199) вносится стерильный раствор Эраконда до получения конечной концентрации 0,01-0,25% (для определения влияния на ростовую линию Л-41) и до получения конечной концентрации 0,01-0,1% (для изучения пролиферативной активности клеток перевиваемой линии Л-41). Клетки Л-41, обработанные Эракондом, выращиваются с добавлением 5% НБС. Стандартная методика выращивания клеток Л-41 предполагает использование НБС в конечной концентрации 10%
Определено (см. чертеж), что через 24 ч инкубации в среде роста с 0,05% -ным содержанием Эраконда монослой клеток был полностью сформирован. Клетки имели крупные размеры, отчетливо выраженную архитектонику, светлую цитоплазму. Монослой был ровным. На вторые сутки роста клетки линий Л-41_0,1, Л-41_0,25, Л-41_0,05, Л-41_0,01 образовывали ровный плотный монослой из молодых прозрачных клеток. Отмечено большое количество делящихся клеток. Нарастание пролиферативной активности наблюдалось на 3 и 4 сут инкубирования. В культуре линии Л-41_0,25 наблюдалось небольшое отслоение клеток от стекла. На 7 сут отмечено появление дегенерировавших клеток в монослое всех культур, обработанных Эракондом, кроме клеток линии Л-41_0,01, где клетки сохраняли сплошной монослой, границы клеток были отчетливы, цитоплазма прозрачной, наблюдались клетки в состоянии деления. Такой монослой культура линии Л-41_0,01 сохраняла 10 сут. Инкубация клеток в термостате при 37^оС была возможна до 22 сут, после чего клетки были пересажены в отношении 1:2.

Таким образом, определено, что клеточная культура линий Л-41, обработанная 0,01-0,1% -ным раствором Эраконда, в отличие от контрольной линии (без Эраконда) формировала ровный монослой, не содержащий трехмерных структур. Клетки имели выраженную цитоархитектонику, прозрачную цитоплазму, отсутствие зернистости в ядре и цитоплазме. Отмечено удлинение продолжительности жизни клеток в пределах одного пассажа.

При изучении пролиферативной активности клеток перевиваемой линии Л441 с 0,01-0,1% -ным содержанием Эраконда наблюдалось увеличение роста клеток. Кратность прироста изучалась в динамике посуточно. Максимальный индекс пролиферации клеток достигал на 4-5 сут 4,0 в сравнении с контролем (un=2,5). Наибольшая пролиферативная активность клеток наблюдалась в среде роста с 0,1% -ным содержанием Эраконда. На 6-7 сут как в контроле, так и в опыте происходило снижение пролиферативной активности, однако в ПС с Эракондом снижение было значительно меньшим, чем в контроле.

Влияние различных концентраций Эраконда на пролиферативную активность было изучено на моделях клеток фибробластов эмбриона человека (ФЭЧ) и легкого эмбриона человека (ЛЭЧ).

Контрольную культуру клеток выращивали во флаконах на 250 мл в среде Игла с добавлением 10% нативной бычьей сыворотки.

В опытных культурах ФЭЧ и ЛЭЧ было установлено, что при посевной концентрации клеток 200-250 тыс/мл и содержании Эраконда 0,01, 0,5 и 0,1% в присутствии 3% нативной бычьей сыворотки (контроль 10%) адгезивная активность этих клеток увеличивалась на 20% по сравнению с контролем. Клетки прикреплялись к стеклу, распластывались в течение нескольких часов таким образом, что через 24 ч плотность опытной культуры была выше контрольной, а через 48 ч формировался сплошной монослой. Увеличивалась пролиферативная активность клеток на 2 сут роста в 2 раза при содержании 0,01 и 0,05% Эраконда и в 1,5 раза при 0,5% содержании Эраконда.

Без смены ПС при комнатной температуре клетки ФЭЧ и ЛЭЧ, выращенные с 0,01 и 0,05%-ным содержанием Эраконда, сохраняли монослой в течение 24 сут, а с 0,1%-ным содержанием Эраконда до 21 сут.

Экстракт растительный конденсированный (Эраконд) представляет собой препарат, полученный из люцерны (сена люцерны) при обработке экстрагентом, содержащим в своем составе растворимые соли металлов в мг на 1 кг растительной массы, например, в следующем соотношении: Мо 8,0, Ва 10,0, Рb 20,0; Со 1,05; V 1,0; Cz 0,5; Zn 200,0, Fe 300,0; Sn 40.

Таким образом, изучение влияния различных концентраций Эраконда на перевиваемых клетках СПЭВ показало, что при концентрации 0,01; 0,05 и 0,1% клетки сохраняли монослой без смены ПС при 37^оС в течение 28 сут (контроль 20 сут). При этом клетки имели четкие границы и светлую цитоплазму.

Использование: биотехнология, вирусология. В питательную среду 199, содержащую нативную бычью сыворотку, дополнительно введен экстракт люцерны конденсированный (Эраконд) в концентрации 0,01 - 0,05%. Экстракт люцерны увеличивает пролиферативную активность клеток и повышает выживаемость клеточных культур. 1 ил.

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ПЕРВИЧНЫХ И ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОК, содержащая среду роста 199, нативную бычью сыворотку, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит конденсированный экстракт люцерны при следующем соотношении компонентов, мас.

Конденсированный экстракт люцерны 0,01 0,05
Нативная бычья сыворотка 3 5
Среда роста 199 Остальное