СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ГЕНОТИПОВ РЫБ Российский патент 1995 года по МПК A01K61/00 

Изобретение относится к геномной (хромосомной) инженерии и, в частности, направлено на решение проблемы сохранения (восстановления) генотипов редких и исчезающих видов рыб. Способ основан на использовании метода индуцированного андрогенеза.

Известен метод получения андрогенетического потомства рыб, т.е. потомства, развитие животных в котором осуществляется только под контролем отцовской наследственности без участия материнской наследственности. Метод включает радиационную инактивацию наследственного аппарата яйцеклеток и восстановление диплоидности эмбрионов с помощью подавления у них тепловым шоком или гидростатическим давлением первого деления дробления. Таким образом, жизнеспособные андрогенетические потомства были получены у карпа, форели, осетра и у других видов (Грунина, 1992; Parsons and Torgaard, 1985; May et al. 1988). У карпа андрогенетическое потомство было получено также и из криоконсервированной спермы (Грунина, 1992). Значение метода индуцированного андрогенеза применительно к проблеме сохранения ценных генотипов определяется тем, что способы криоконсервации спермы рыб уже в основном разработаны, а задача длительного хранения яйцеклеток пока далека от своего решения.

Вместе с тем, сам по себе метод индуцированного андрогенеза не позволяет восстанавливать генотипы исчезнувших видов рыб. Дело в том, что в этом случае для осеменения придется использовать яйцеклетки не своего, а какого-либо другого имеющегося вида рыб, то есть получать андрогенетических ядерно-цитоплазматических гибридов.

Известен способ получения андрогенетических ядерно-цитоплазматических гибридов (Грунина, 1992; May et al. 1988). Он включает осеменение облученной (генетически инактивированной) искры одного вида спермиями другого вида и диплоидизацию полученных эмбрионов с помощью гидростатического давления или теплового шока.

Однако такие гибриды, как это было показано на примере андрогенетических гибридов гольцов (May et al. 1988) и серебряного карася с карпом (Грунина, 1992), как правило, оказываются нежизнеспособными. Причина этого вызвана нарушением процессов взаимодействия чужеродных ядра и цитоплазмы. Между тем получение именно жизнеспособных андрогенетических гибридов позволило бы восстанавливать генотипы исчезнувших видов животных из криоконсервированной спермы.

Заявляемый способ восстановления генотипов рыб направлен на получение жизнеспособных андрогенетических гибридов.

Указанный результат достигается тем, что при получении ядерно-цитоплазматических гибридов по способу, включающему осеменение генетически инактивированных яйцеклеток одного вида спермиями другого вида и диплоидизацию полученных эмбрионов, согласно изобретению используют икру гибридов, предварительно полученных в обычном скрещивании с помощью осеменения спермой восстанавливаемого вида яйцеклеток какого-либо другого вида рыб.

Согласно заявляемому способу сперма восстанавливаемого вида вначале используется для оплодотворения яйцеклеток какого-либо другого вида без применения метода индуцированного андрогенеза. В результате получают обычных (истинных) гибридов. Этих гибридов выращивают до половой зрелости и отбирают самок, способных давать икру. Затем с использованием икры гибридных самок и спермы восстанавливаемого вида по известному методу получают андрогенетическое потомство. Для этого генетически инактивированную (с разрушенным наследственным аппаратом) икру гибридных самок осеменяют спермой восстанавливаемого вида и подвергают эмбрионов тепловому шоку для восстановления диплоидности.

Полученные таким образом андрогенетические ядерно-цитоплазматические гибриды жизнеспособны и развиваются нормально, поскольку половина белков яйцеклетки в этом случае синтезирована на матрицах восстанавливаемого вида, что обеспечивает нормальное взаимодействие ядра и цитоплазмы.

П р и м е р осуществления способа. Способ осуществлен на модели, в которой используются карп, серебряный карась и их гибриды.

У отдаленных межродовых гибридов между карпом (Cyprinus carpio L.) и серебряным карасем (Carassius auratus gibelio Bloch.) самцы стерильны, а самки частично плодовиты, что позволяет воспроизводить их с помощью индуцированного гиногенеза.

От гибридных самок карасекарпов третьего гиногенетического поколения и от обычных самок карпа с помощью гипофизарных инъекций по стандартной рыбоводной методике получили икру. Икру гибридов и карпов подвергли рентгеновскому облучению (аппарат РУП-200) в дозе 25 кР для генетической инактивации хромосом яйцеклеток.

От самцов серебряного карася и карпов-хромистов (оранжевая окраска которых определяется рецессивными генами b1 и b2) по обычной рыбоводной методике получили сперму.

В лабораторных условиях поставили три скрещивания. Скрещивание 1. Облученную икру гибридов карасекарпов осеменяли спермой серебряного карася.

Скрещивание 2. Облученную икру гибридов карасекарпов осеменяли спермой карпов-хромистов.

Скрещивание 3. Облученную икру карпа осеменяли спермой серебряного карася (контроль).

Икру инкубировали в чашках Петри при температуре 20^оС. Через 48 мин после осеменения эмбрионов из всех скрещиваний подвергали тепловому шоку при температуре 40^оС продолжительностью 3 мин. Тепловой шок в этот момент развития подавляет у эмбрионов первое деление дробления, обеспечивая тем самым восстановление диплоидности.

Вылупление личинок наблюдалось на третьи сутки после осеменения. Личинки из скрещивания 2 были лишены пигмента, что доказывает полную генетическую инактивацию икры и указывает на андрогенетический характер их происхождения. Выход личинок во всех скрещиваниях был невысоким и колебался в пределах 3-5% Примерно такая же величина выживаемости андрогенетических эмбрионов наблюдалась и во всех других опытах с различными видами рыб. Все личинки из контрольного скрещивания погибли при переходе на внешнее питание.

Личинки из скрещиваний 1 и 2 оказалась нормально жизнеспособными; после выращивания их в аквариумах были получены сеголетки.

Исследование сеголетков из скрещивания 1 показало, что все они являются серебряными карасями без каких-либо признаков наследственности карпа. Этот вывод был сделан по результатам изучения диагностических морфологических признаков (отсутствие усиков, черная окраска брюшины, формула глоточных зубов 4+4).

Изучение сеголетков из скрещивания 2 показало, что все они являются карпами и не имеют признаков наследственности серебряного карася (белый цвет брюшины, формула глоточных зубов 1.1.3+3.1.1). Окраска тела у сеголетков была оранжевой (генотип b1b1b2b2), что свидетельствует об отсутствии у них доминантных материнских генов окраски.

Таким образом, как видно из результатов скрещиваний 1 и 2, предлагаемый способ позволил получить жизнеспособных андрогенетических гибридов и тем самым "восстановить" генотипы карпа и серебряного карася из спермиев этих видов. Скрещивание 3, которое аналогично известному способу получения андрогенетических ядерно-цитоплазматических гибридов, еще раз подтвердило невозможность восстановления генотипов рыб таким путем. Важно подчеркнуть, что карп и серебряный карась принадлежат к разным родам, а их гибриды относятся к категории отдаленных гибридов. Это обстоятельство указывает на достаточную универсальность предлагаемого способа, поскольку использование более близких в систематическом отношении видов лишь облегчит их гибридизацию.

Изобретение относится к геномной (хромосомной) инженерии и, в частности, направлено на решение проблемы сохранения (восстановления) генотипов редких и исчезающих видов рыб. Способ основан на использовании метода индуцированного андрогенеза, который позволяет получать потомство, развитие которого осуществляется только под контролем отцовской наследственности, без участия материнской наследственности. Таким образом, если имеется сперма изчезнувшего вида (например, сохраненная с помощью криоконсервации), то, получив андрогенетические ядерно-цитоплазматические гибриды, можно было бы восстановить его генотип. Однако такие гибриды нежизнеспособны. Предлагаемый способ направлен на получение жизнеспособных ядерно-цитоплазматических гибридов. Для достижения указанного результата при получении андрогенетического потомства используют икру не чистых видов, а гибридов, предварительно полученных в обычном скрещивании с помощью осеменения спермой восстанавливаемого вида яйцеклеток какого-либо другого вида рыб.

СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ГЕНОТИПОВ РЫБ, включающий получение андрогенетических ядерно-цитоплазматических гибридов путем осеменения генетически инактивированных яйцеклеток спермой восстанавливаемого вида с последующей диплоидизацией эмбрионов, отличающийся тем, что используют яйцеклетки гибридов, предварительно полученных в обычном скрещивании с помощью осеменения спермой восстанавливаемого вида яйцеклеток любого вида рыб.