СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 1995 года по МПК A61K31/305 

Изобретение относится к медицине, в частности технологии лекарственных средств, и может быть использовано для получения ртутьсодержащих препаратов, предназначенных для лечения различных заболеваний в качестве противоопухолевого и иммуномодулирующего средства.

Известны различные препараты, обладающие противоопухолевым действием, и способы их получения.

Известны способы получения композиций, содержащих в своем составе дихлорид ртути (сулему) [1.2] Их можно рассматривать как аналоги способа получения заявляемого препарата.

В патент Индии описан процесс получения композиции для лечения рака мягких тканей человека [1] Способ включает: смешение равных количеств хорошо измельченных, просеянных порошкообразных ртутьсодержащих соединений: ртути дихлорида (сулемы, Hg₂Cl₂), ртути хлорида (каломели, Hg₂Cl₂), ртути сульфида (HgS), ртути оксида (HgO), ртути сульфата (HgSO₄). Приготовленную смесь подвергают сублимации (возгонке). Собирают белый кристаллический десублимат. 1,0 г полученного десублимата растирают (тритурируют) с 10,0 г лактозы. Этот процесс повторяют 10 раз. После 10-й операции берут 1,0 г полученного продукта и прибавляют к нему 10,0 г абсолютного спирта, энергично встряхивают. Процесс смешения и встряхивания исходных компонентов повторяют 100 раз. Образовавшийся в результате 100-ой операции продукт смешивают с лактозой в соотношении 1:5. Готовый препарат фасуют по 200 кг.

Лекарственное средство, полученное по данному методу, предназначено для внутреннего применения.

Метод имеет следующие недостатки:
Использован сложный компонентный состав, включающий 5 ртутьсодержащих соединений. Из них, сублимации (возгонка) при нагревании могут подвергаться лишь два соединения, а именно дихлорид ртути (сулема, т.пл. 280^оС, т.кип. 301,8^оС) и сульфид ртути (температура его возгонки 580^оС). Оксид и хлорид ртути при температуре нагревания выше 400^оС разлагаются. Сульфат ртути претерпевает процесс разложения при температуре выше 500^оС. Эти процессы протекают по следующим уравнениям:
2HgO __→ 2Hg +O₂
Hg₂Cl₂___→ HgCl₂+Hg
HgSO₄__→ Hg + SO₂+O₂
Таким образом, для трех ртутьсодержащих соединений указанный выше процесс протекает с разложением до металлической ртути (Hg, т.пл. -39^оС, т.кип. 357^оС). Последняя легкоплавка и летуча.

Не ясен компонентный состав препарата на конечном этапе его приготовления. В патенте отсутствует его аналитическая характеристика.

В технологическом исполнении метод является чрезвычайно сложным и достаточным кропотливым.

В патент США описан способ приготовления композиции, которая, в основном, предназначена для наружного применения при лечении таких кожных заболеваний, как псориаз, экзема, ихтиоз и др. [2]
Способ получения композиции заключается в том, что в этиловом спирте в определенных соотношениях растворяют камфору, масло горьких миндалей, масло можжевеловых ягод и др. компоненты. Далее по порядку прибавляют карболовую кислоту, дихлорид ртути и раствор ментола. К смеси прибавляют оливковое масло, но можно это масло в состав препарата не включать или его количество уменьшить.

Для получения готового продукта смесь выдерживают от одного дня до недели для того, чтобы в ней прошли химические превращения.

Следует отметить, что этиловый спирт, который применяется как растворитель при приготовлении данной композиции не защищает ионы ртути от их токсичности на организм человека, так как же не может образовать с ртутью соединений по ее координационным связям.

Ближайшим аналогом предложения является способ получения противоракового средства на основе дихлорида ртути (сулемы), используемого в народной медицине.

Способ заключается в растворении 1,0 г дихлорида ртути (сулемы) в 3,0 л дистиллированной или кипяченой (родниковой, колодезной) воды с последующим выдерживанием смеси в течение 6 ч. Затем 30,0 г этого раствора смешивают с 3,0 л воды и полученный раствор выдерживают в течение 12 ч.

Однако получаемый известным образом препарат является токсичным, поскольку при приготовлении композиции в раствор не вводится каких-либо компонентов, защищающих ионы ртути от их токсического воздействия на организм. Вода, которая применяется в качестве растворителя не имеет в своем составе комплексообразующих соединений, реактивных групп (например, сульфгидрильных и др. групп), которые бы реагировали с ртутью и тем самым уменьшали ее токсические свойства. Кроме того, при хранении в водном растворе и в контакте с воздухом дихлорид ртути постепенно разлагается и препарат теряет свои фармакологические свойства.

Задачей данного изобретения является создание оригинального способа, который бы позволил получить высокоактивный нетоксичный препарат широкого спектра действия.

Поставленная задача по созданию высокоэффективного и нетоксичного препарата на основе дихлорида ртути (сулемы) решается с помощью предлагаемого способа, позволяющего при получении препарата, содержащего дихлорид ртути (сулему) и растворитель, исключить токсическое действие ртути.

Согласно изобретению могут быть получены различные сулемусодержащие препараты в жидкой лекарственной форме. При этом в качестве растворителя в технологии используют натуральные белые сухие или полусухие виноградные вина.

Способ в зависимости от используемого растворителя может быть осуществлен следующими путями:
1. При использовании в качестве растворителя белого сухого виноградного вина способ проводят следующим образом: вначале готовят раствор сахарозы в сухом белом виноградном вине. Далее к полученному раствору прибавляют дихлорид ртути и смесь перемешивают до его растворения. Для проведения процесса ферментации (брожения) приготовленный раствор дихлорида ртути в растворе сахарозы в сухом белом виноградном вине нагревают на водяной бане (без доступа прямого огня) до 55±5^оС в течение 15-20 мин и затем выдерживают раствор в сухом, защищенном от света месте в течение 7 сут. (±1 сут.).

Приготовленный раствор препарата после получения положительных результатов анализа в соответствии с требованиями проекта ВФС фасуют в емкости из темного стекла.

2. При использовании полусухих белых виноградных вин стадию растворения сахара-рафинада или сахара-песка в белом полусухом виноградном вине исключают. Это объясняется тем, что полусухие виноградные вина содержат остаточные количества сахаристых веществ (ГОСТ Р 50208-92 Е).

Процесс приготовления препарата осуществляют путем растворения дихлорида ртути (сулемы) в выбранном в качестве растворителя белом, полусухом виноградном вине. Последующие процессы: нагревание (при 55±5^оС) 15-20 мин и выдержки (при 5-10^оС) в течение 7 сут. (±1 сут.) проводят как указано в способе 1.

В предлагаемой по изобретению технологии могут быть использованы следующие сорта виноградных вин: Алиготе, Рислинг, Мцване, Эрети, Ркацители, Саперави и др.

Выбор в пользу сухих или полусухих белых виноградных вин был сделан потому, что виноградные вина содержат большой комплекс веществ как органической, так и неорганической природы органические кислоты (пантотеновая, фолиевая и др.), минеральные соли (в основном калия), сахара, азотистые пектиновые и дубильные вещества, флавонолы (квертицин), гликозиды, фосфор, микроэлементы Mn, Cu, Zn, Fe, Mg, F, Br и др. витамины группы В: B₁, B_2,. B₆, B₁₂, группы Р, РР и С. В виноградном вине присутствуют ферменты: дифенол- и полифенолоксидазы, наличие которых вызывает постоянное изменение вина (особенно молодых вин). Виноградные вина по своему составу близки к соку исходного сырья. Основное отличие вина от виноградного сока заключается в том, что в вине в процессе брожения (ферментации) образуются: этиловый спирт, глицерин, молочная, янтарная кислоты, а во время выдержки альдегиды, ацетали и эфиры. По содержанию спирта и сахара виноградные вина подразделяются на: натуральные сухие, сухие особые, полусухие и полусладкие. Объемная доля этилового спирта для сухих, полусухих вин 9-13% Массовая концентрация сахаров, г/л: для сухих вин не более 3, для полусухих не более 5-25. Массовая концентрация в 1 л: титруемых кислот 3-8 г, железа 3-20 мг и меди не должна превышать 5 мг. Ферментация особых бродильных грибков дрожжей (из рода Saccharamyces cerevisiae, называемых сахаромицетами) в спирт и углекислоту. Виноделие основано на использовании диких дрожжей, находящихся на кожуре ягод. Другим преимуществом виноградного вина при использовании его в качестве растворителя перед другими известными растворителями (например, спиртом, водой и др.) является его кислотность (рН 3-3,5). Кислая среда обуславливает его бактерицидные свойства (холерные и тифозные микроорганизмы погибают в нем в течение 5-30 мин). Виноградные вина легко проникают через неповрежденную кожу и слизистые оболочки, что, в свою очередь, облегчает проникновение в организм основного действующего вещества препарата дихлорида ртути (сулемы, HgCl₂).

Процесс приготовления препарата на основе дихлорида ртути (сулемы)
В белом сухом виноградном вине (сорт вина указан выше) при комнатной температуре (18-20^оС) растворяют сахар, используя сахар-рафинад или сахар-песок в такой концентрации, чтобы массовая доля сахарозы в составе препарата на конечном этапе составила 27-33 г/л. Введение сахарозы ex tempore в сухое белое виноградное вино в качестве дополнительного компонента имеет целью усилить протекторные свойства виноградного вина по отношению к основному компоненту препарата дихлориду ртути (сулемы) за счет гидроксильных групп в молекуле сахарозы.

Для приготовления препарата к 2,7-3,3% раствору сахарозы в белом сухом виноградном вине прибавляют дихлорид ртути, перемешивают до получения раствора. Полученный раствор нагревают при температуре 55±5^оС в течение 15-20 мин. По истечении указанного времени раствор дихлорида ртути в растворе сахарозы в белом сухом виноградном вине оставляют на выдержку в течение 7 сут. (±1 сутки) при 5-10^оС.

Процесс нагревания раствора дихлорида ртути в растворе сахарозы в белом сухом виноградном вине проводят с той целью, чтобы активизировать реакцию взаимодействия лигандных компонентов вина, а именно ферментов, дубильных веществ, пектинов, органических кислот, сахаров и др. с ионом ртути (Hg²⁺).

Ион ртути (Hg²⁺) обладает сильной комплексообразующей способностью со многими лигандами, имеющими единственный донорный атом, особенно атом азота (N) или атом серы (S). Химическая реакция проходит за счет сульфгидрильных (SH), гидроксильных (ОН), аминогрупп (NH₂) и ряда других групп, содержащихся в молекулах перечисленных компонентов по координационным связям иона ртути. В результате реакции образуются устойчивые ртутьсодержащие молекулярные комплексы; высокая кислотность препарата способствует образованию комплексных соединений ртуть за счет карбоксильных C анионов органических кислот, содержащихся в виноградном вине. Сила связывания ртутного катиона (Hg²⁺⁾ с лигандами и устойчивость образующихся ртутьсодержащих комплексов в препарате зависят от рН среды. В кислой среде ионы ртути (Hg²⁺) способны образовывать гидрокомплексы, последние могут образовывать полиядерные комплексы и осадки.

Получаемый по этому способу препарат за счет того, что все свободные связи иона ртути (Hg²⁺) координационно заняты не обладает токсичностью.

Важной особенностью получаемого препарата является то, что основной действующий компонент его дихлорид ртути содержит ион (Hg²⁺), являющийся одним из наиболее сильно связывающихся ионов металлов подвергается также и быстрому лигандному обмену, что является важной характерной чертой ртутной токсикологии.

В организме человека ртутьсодержащие комплексы распадаются, свободные ионы ртути (Hg²⁺), взаимодействуя с сульфигидрильными группами белковых макромолекул (например, известно, что многие формы опухолей сопровождаются нарушением продукции ферментов, белков и гормонов), блокируют их действие, создают желаемый противоопухолевый эффект, и далее выводятся из организма через почки, слюну и кожу при потоотделении.

Преимущество предлагаемого способа получения препарата перед известными заключается в том, что препарат рекомендован к употреблению в дозированной форме и физико-химическая характеристика его регламентируется проектом ВФС.

В производстве данного препарата дорогостоящее оборудование не требуется, технология его приготовления легко воспроизводима в заводских условиях.

П р и м е р 1. К 8,2 л (по объему) или 8,150 кг (в техническом весе) белого сухого виноградного вина "Алиготе" прибавляют 246,0 г сахара рафинада. Смесь тщательно перемешивают палочкой до полного растворения сахара. 0,1 л полученного раствора передают в аналитическую лабораторию для проведения анализа на содержание массовой доли сахарозы.

Получают 8,1 л (по объему) раствора сахарозы в белом сухом виноградном вине "Алиготе". Выход составляет 98,8% считая на исходный сахар-рафинад.

Далее в стеклянный стакан вместимостью 1 л наливают 0,5 л приготовленного раствора сахарозы в белом сухом виноградном вине "Алиготе", прибавляют 2,7 г дихлорида ртути (сулемы) и смесь тщательно перемешивают стеклянной палочкой до растворения компонента.

В 10 л бутыль, снабженную пластмассовой воронкой, с помощью мерного цилиндра наливают 7 л раствора сахарозы в белом сухом виноградном вине "Алиготе". Прибавляют к нему небольшими порциями при перемешивании приготовленный раствор дихлорида ртути (сулемы). Затем объем в бутыли доводят до 8,1 л прибавлением 0,6 л раствора сахарозы в белом сухом виноградном вине "Алиготе". Полученный раствор перемешивают деревянной палочкой в течение 5-10 мин.

Бутыль с приготовленным раствором дихлорида ртути (сулемы) помещают в водяную баню и нагревают при перемешивании деревянной палочкой. Температуру реакционной массы доводят до 55±5^оС, продолжительность процесс 15-20 мин.

Далее в естественных условиях раствор охлаждаются до 19-20^оС. После окончания процесса охлаждения бутыль с раствором оставляют для выдержки в сухом, защищенном от света месте при температуре не ниже 50^оС и не выше 10^оС на 7 сут. По истечении указанного срока берут пробу раствора в количестве 0,3 л и передают на анализ в аналитическую лабораторию на соответствие его качества проекту ВФС на препарат.

Получают 7,8 л (по объему) раствора дихлорида ртути (сулемы) в растворе сахарозы в белом сухом виноградном вине "Алиготе". Выход составляет 96,3% считая на исходный дихлорид ртути, с содержанием основного вещества не ниже 0,30 мг/мл.

Физико-химическая характеристика препарата.

Слегка опалесцирующая жидкость от светло-желтого до интенсивного желтого цвета с запахом вина. При стоянии образуется осадок.

С раствором йодида калия образуется красный осадок, растворимый в избытке йодида калия (ГФ Х, с.746, реакция Б, ртуть окисная).

С раствором нитрата серебра образуется белый творожистый осадок, растворимый в растворе аммиака (ГФ Х, с.747, хлориды).

С раствором нитрата кобальт и раствором натра едкого появляется синее окрашивание (сахароза).

Массовая доля сахарозы в препарате составляет: 27-33 г/л (ГФ Х, с.901).

рН 3,1-3,3 (потенциометрически).

Плотность: 0,992-0,997 г/см³.

П р и м е р 2. Способ осуществляют как описано в примере 1 с тем отличием, что в качестве растворителя дихлорида ртути (сулемы) используют белое полусухое виноградное вино.

Поскольку в полусухом белом виноградном вине присутствуют сахаристые вещества сахар-рафинад при приготовлении препарата не используется. Процесс получения препарата начинают с растворения дихлорида ртути (сулемы) в полусухом белом виноградном вине.

В стеклянный стакан вместимостью 1,0 л наливают 0,5 л белого полусухого виноградного вина "Саперави", к нему прибавляют 2,7 г дихлорида ртути (сулемы) и смесь тщательно перемешивают стеклянной палочкой до получения раствора.

Далее процесс проводят аналогично описанному в примере 1.

Физико-химическая характеристика препарата.

Физико-химические параметры препарата, полученного по примеру 2 те же.

Токсикологическая характеристика препарата.

ED₅₀ 9,9 мкг/мл
Противоопухолевая активность препарата на перевиваемых опухолевых культурах.

Исследование проведено на перевиваемых лейкоцитарных опухолевых культурах линии L-41.

Культивирование культур проводили по общепринятому методу. Плотность посева клеток составляла -1˙10⁵ клеток в 1 мл среды. В качестве питательной среды использовали в равных соотношениях среду 199 среду Игла с добавлением 10% бычьей сыворотки и антибиотиков: 100 ед. пенициллина, 50 ед. стрептомицина на 1 мл. среды. Препарат в отдельно виноградное вино и дихлорид ртути (сулему) разводили на безбелковой питательной среде и вносили их в различных концентрациях в 3-4 культуры для контакта с клеточным монослоем. Так как действующим началом в препарате является дихлорид ртути (сулемы), то мы в предварительном опыте для сравнения установили, что ЕД₅₀ сулемы, тормозящей рост опухолевых культур L-41 составляет менее 10 мкг/мл. На вторые сутки после постановки опыта производили микроско- пическую оценку действия препарата по 4-балльной системе и количественное определение содержания белка культур по методу Лоури в модификации ОЯМА и ИГЛА.

Критерий цитостатической активности препарата процент торможения роста культур по угнетению синтеза белка.

Проведенное исследование показало, что ЕД₅₀ препарата составляет 9,9 мкг/мл, ЕД₅₀ сулемы примерно 8 мкг/мл. Близость значений ЕД₅₀позволяет предположить, что действующим началом в препарате является сулема. Виноградное вино в исследуемых концентрациях оказывает незначительное стимулирующее влияние на культуры до 10%
Согласно существующим стандартным методам отбора противоопухолевых препаратов в СССР и США препарат является активным "in vitro", если его КД₅₀ меньше или равны 100 мкг/мл.

Исследования показали, что ЕД₅₀ препарата составляет 10 мкг/мл, что в 10 раз превышает стандарт и свидетельствует о его выраженном цитостатическом действии на опухолевых культурах.

Проведенные клинические испытания препарата, полученного предлагаемым способом, подтвердили широкий спектр лечебного действия.

Препараты эффективны при лечении различных онкологических заболеваний, кожных заболеваний, а также трофических язв.

Изобретение относится к медицине, в частности к технологии лекарственных средств, и может быть использовано для получения ртутьсодержащих препаратов, обладающих противоопухолевой активностью. Существо предложения заключается в том, что сулему растворяют в полусухом белом натуральном виноградном вине с содержанием сахара 2,7 3,3% или в сухом белом вине, в которое предварительно вносят сахарозу в количестве 27 33 г/л, после чего полученный раствор нагревают без доступа прямого открытого огня при 55 ± 5^°C в течение 15 20 мин и выдерживают смесь при 5 10°С в течение 6 8 сут. Проведенные исследования на перевиваемых лейкоцитарных опухолевых культурах линии L-41 показали цитостатическую активность на опухолевые клетки.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ, включающий растворение сулемы в растворителе и последующее выдерживание смеси, отличающийся тем, что в качестве растворителя используют полусухое белое натуральное виноградное вино с содержанием сахара 2,7 3,3% или сухое белое виноградное вино, в которое предварительно вносят сахарозу в количестве 27 33 г/л, после чего полученный раствор нагревают без доступа прямого открытого огня при температуре 50 60^oС в течение 15 20 мин, а его выдерживание проводят при 5 10^oС в течение 6 8 сут.