ПРЕПАРАТ ДЛЯ СТИМУЛИРОВАНИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ И РЕПАРАТИВНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ "СТИМБОН-1" Российский патент 1995 года по МПК A61K35/32 A61K35/32 A61K38/00 

Изобретение относится к препаратам, содержащим белковые вещества, выделенные из костной ткани, и используемым в экспериментальной медицине для стимуляции репаративного остеогенеза, кроветворения и постнатального роста лабораторных животных. Изобретение может быть также использовано в ветеринарии.

Известен препарат оссопан ("Робафарм АГ", Базель), представляющий собой комплекс коллагена, неколлагеновых белков костной ткани и гидроксилапатита.

Недостатком известного препарата является невозможность его парэнтерального введения, а при энтеральном использовании разрушаются белки, входящие в его состав, не оказывающие поэтому стимулирующего воздействия на физиологическую и репаративную регенерацию. Кроме того, известный препарат не стимулирует красное кроветворение и не ускоряет прирост массы тела экспериментальных животных.

Задачей данного изобретения является создание препарата, стимулирующего физиологическую и репаративную регенерацию, стимбон-1, выделенного из зрелой костной ткани, содержащего комплекс неколлагеновых белков, характеризующегося растворимостью в воде и солевых растворах физиологической концентрации, высаливаемостью при 45-50%-ном насыщении раствора сульфатом аммония, относительной молекулярной массой в пределах от 20 до 30 кДа, отсутствием сродства к анионообменникам.

Решение указанной задачи достигается тем, что препарат, стимулирующий физиологическую и репаративную регенерацию, стимбон-1, характеризуется последовательными признаками способа получения декальцинированием зрелой костной ткани, диссоциативным экстрагированием, освобождением от водонерастворимых белков, фракционированием по высаливаемости, молекулярной массе и сродству к ионообменнику. Указанная совокупность физико-химических свойств и признаков способа получения является новой.

Анализ известных препаратов, используемых для стимуляции физиологической и репаративной регенерации, показывает, что предложенная совокупность физико-химических свойств и признаков способа получения не является очевидной и явным образом не следует из уровня техники, что позволяет сделать вывод о том, что заявляемый препарат стимбон-1 соответствует критерию изобретательский уровень.

Изобретение является промышленно применимым, так как оно используется в экспериментальной клинике ВКНЦ "ВТО".

На фиг. 1 изображены рентгенограммы берцовых костей кроликов, а в день операции, б контроль через 4 недели после операции, в опыт через 4 недели после операции.

На фиг. 2 изображены кривые влияния препарата, стимулирующего физиологическую и репаративную регенерацию, стимбон-1 на прирост массы тела мышат, где кривая А (сплошная) опыт, В (пунктир) контроль.

Заявляемый препарат, стимулирующий физиологическую и репаративную регенерацию, стимбон-1 может быть получен в лабораторных условиях.

Вариант конкретного получения препарата в лабораторных условиях. Трубчатые кости животных очищают от мягких тканей, измельчают; декальцинируют в растворе соляной кислоты, в раствор, полученный после декальцинации, содержащий частицы нерастворившегося костного матрикса, добавляют мочевину до концентрации 6-8 моль/л и проводят диссоциативное экстрагирование; экстракт, освобожденный от нерастворившихся частиц, например, центрифугированием, подвергают равновесному диализу против дистиллированной воды, после чего освобождают от выпавшего осадка нерастворимых в воде белков; фракционируют по высаливаемости, добавляя насыщенный раствор сульфата аммония до соотношения 1: 2, удаляют выпавший при этой концентрации сульфата аммония белок и добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до соотношения 1:1, собирают выпавший при этой концентрации сульфата аммония белок, растворяют его и фракционируют посредством, например, гель-проникающей хроматографии; фракции, соответствующие относительной мол. м. от 20 до 30 кДа, объединяют и освобождают от белков кислой природы, например, пропуская через колонку с ДЭАЭ-сефадексом; фракцию, не сорбирующуюся на анионите, стерилизуют, например, путем ультрафильтрации через нейлоновый фильтр 0,2 мкм.

Получение заявляемого препарата в промышленных условиях достигается путем простого масштабирования вышеописанного варианта получения в лабораторных условиях, а также применения других приемов, фракционирование по молекулярной массе может быть достигнуто применением мембранной технологии; освобождение от кислых белков применением препаративной хроматографии высокого давления и так далее.

При экспериментальных исследованиях полученный, как описано, препарат обладает следующими свойствами:
ускоряет замещение дефекта малоберцовой кости кролика рентгенплотной тканью при однократном подкожном введении препарата на 3 сутки после создания дефекта, на фиг. 1 приведены рентгенограммы костей голени кроликов с исходным состоянием стандартного дефекта малоберцовой кости (а) и через 4 недели после операции на фоне введения 2 мл 0,15 М раствора натрия хлорида (б) и 2 мл раствора, содержащего 0,8 мг/мл препарата стимбон-1 (в);
усиливает минерализацию дистракционного регенерата собаки при однократном введении внутривенно в 1-3 сут. периода фиксации после трехнедельной дистракции большеберцовой кости, остеотомированной в средней трети; в табл. 1 представлены основные показатели, характеризующие количественный и качественный состав минеральной фазы дистракционных регенератов собак, которым осуществлено удлинение голени на 10% методом чрескостного дистракционного остеосинтеза по Илизарову и после прекращения дистракции внутривенно введено по 5 мл 0,15 М натрия хлорида (контроль) либо по 5 мл раствора, содержащего 8 мг/мл препарата стимбон-1; собаки эвтаназированы после 48 сут. фиксации, дистракционные регенераты освобождены от параоссальных тканей, обезжирены, измельчены и подвергнуты анализу на содержание кальция и фосфора; результаты сопоставлены с аналогичным участком диафиза большеберцовой кости интактных собак;
в зависимости от дозы при подкожном введении интактным мышам стимулирует красное кроветворение; в табл. 2 приведен ряд гематологических показателей периферической крови, селезенки и костного мозга белых мышей через 48 ч после введения в указанной в таблице дозе препарата стимбон-1 или 0,2 мл 0,15 М раствора натрия хлорида; анализ линейной корреляции выявил следующие коэффициенты корреляции между дозой и величиной показателя: для содержания ретикулоцитов в периферической крови +0,224 (р>0,05); эритроцитов в периферической крови +0,905 (р<0,001); индекса массы селезенки +0,715 (р<0,01); клеточности селезенки +0,872 (р<0,001); содержания эритроидных клеток в селезенке +0,955 (р<0,001); лейкоцитарно-эритробластического соотношения костного мозга -0,762 (р<0,01);
снижает анемизирующее влияние дробной кровопотери при подкожном введении мышам в дозе 1,0-1,2 мг/кг массы тела; в табл. 3 представлены данные, характеризующие влияние введения препарата стимбон-1 (группа "кровопотеря+препарат") или равного объема 0,15 М раствора натрия хлорида (группы "кровопотеря" и "интактные"); мышам первых двух групп сразу после введения препарата или раствора натрия хлорида и 4 раза с интервалом через 6 ч брали кровь из хвостовой вены по 0,2 мл; мышей забивали через 48 ч после первого взятия крови и анализировали периферическую кровь и кроветворные органы;
ускоряет прирост массы тела при подкожном введении мышатам с массой тела 7-10 г; на фиг. 2 отражен прирост массы тела мышат в процентах от исходной перед введением 0,06 мл 0,15 М раствора натрия хлорида (контроль) или 0,06 мл раствора препарата стимбон-1 0,1 мг/мл; различия в приросте массы тела имели достоверный характер, начиная с 10 сут от начала эксперимента (р<0,01).

В каждую из описанных контрольных и опытных групп отбирали число животных, достаточное для получения репрезентативных выборок.

Во всем диапазоне применявшихся доз, в сроки наблюдения от 48 ч до 20 сут. у мышей, до 5 недель у кроликов, 7 недель у собак не наблюдалось признаков острой или хронической интоксикации, что подтверждалось отсутствием макроскопических патологических изменений внутренних органов.

Воздействие препарата, стимулирующего физиологическую и репаративную регенерацию, стимбон-1, на репаративный остеогенез, кроветворение и увеличение массы тела растущих животных обусловлено наличием в его составе биологически активных веществ полипептидной природы, относящихся к группе факторов роста. Однако сравнение его влияния на показатели кроветворения с действием отдельных белковых факторов, входящих в его состав, показывает большую эффективность, проявляющуюся при использовании меньшей дозы вводимых парэнтерально белковых веществ. Вместе с тем получение композиции факторов, составляющих препарат, технологически менее трудоемко, чем получение отдельных, более гомогенных фракций. Увеличение эффективности композиционного препарата превышает суммирование активностей отдельных фракций. Таким образом, увеличение эффективности обеспечивается кооперативностью действия отдельных компонентов препарата и является существенным качественным отличием препарата.

Выход препарата при получении в лабораторных условиях составляет 40-96 мг из 1 кг освобожденной от мягких тканей свиной компактной кости.

Препарат может быть использован в экспериментальных разработках новых методов лечения травматологических, ортопедических, стоматологических, гематологических больных и после фармакологических испытаний перспективен как новое лечебное средство. Он может быть использован также в ветеринарии и животноводстве для лечения гипопластических анемий и ускорения консолидации переломов костей у животных, стимулирования роста молодняка.

Использование: препараты, содержащие белковые вещества, выделение из костной ткани и применяемые для стимуляции репаративного остеогенеза, кроветворения и постнатального роста лабораторных животных. Сущность изобретения: препарат, стимулирующий физиологическую и репаративную регенерацию, стимбон-1 получают из зрелой костной ткани животных путем денальцинации очищенной от мягких тканей измельченной кости соляной кислотой, экстрагирования неколлагеновых белков раствором мочевины, освобождения от водонерастворимых белков путем диализа против воды, фракционирования по высаливаемости сульфатом аммония, молекулярной массе и сродству к ионообменникам. Препарат представляет собой комплекс неколлагеновых белков зрелой костной ткани, имеющих следующие общие свойства: мол.м. в пределах от 20 до 30 кДа, растворимость в воде и солевых растворах физиологической концентрации, высаливаемость при 45 50%-ном насыщении сульфатом аммония, отсутствие сродства к анионообменнику. 2 ил. 3 табл.

Препарат для стимулирования физиологической и репаративной регенерации, выделенный из костной ткани, отличающийся тем, что он получен путем декальцинации зрелой костной ткани, диссоциативного экстрагирования, освобождения от водонерастворимых белков, фракционирования по высаливаемости, молекулярной массе и сродству к анионообменнику и содержит комплекс водорастворимых неколлагеновых белков, обладающих высаливаемостью при 40 - 50%-ном насыщении раствора сульфата аммония, с относительной мол. м. 20 30 кДа.