СПОСОБ ОЧИСТКИ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ ОТ НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 1996 года по МПК C02F3/34 E02B15/04 

Изобретение относится к биотехнологии и охране окружающей среды и касается новых штаммов бактерий, способных расти при повышенных температурах на средах, содержащих парафины широкой фракции, дизельное топливо, мазут, различные технические и пищевые масла.

Штаммы могут быть использованы для очистки от нефтяных загрязнений почвы, воды, емкостей, хранилищ, а также сточных вод нефтеперерабатывающей, машиностроительной, металлургической, пищевой, химико-фармацевтической отраслей промышленности.

Нефть и нефтепродукты являются одним из основных источников загрязнения окружающей среды. Естественное самоочищение почв и водоемов происходит крайне медленно, в то время как загрязненные емкости, хранилища, детали машин и др. могут быть очищены только с использованием специальных приемов. Вот почему в последние годы проводятся широкие исследования по выделению чистых культур микроорганизмов и их ассоциаций деструкторов нефтяных загрязнений и получению на их основе биопрепаратов для практического использования.

Нами проведен патентный поиск по проблеме получения и использования биопрепаратов для ликвидации нефтяных загрязнений.

Известны следующие способы борьбы с нефтезагрязнениями:
Способ очистки от углеводородов, н-алканов бактериями, дрожжами, грибами с целью снижения загрязнения в очистных сооружениях (авт. св. СССР N 944335, N 1156354, кл. С 02 F 3/34).

Штамм бактерий Pseudomonas putida 36 ЦМПМ-В-2443, предназначенный для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов (авт. св. СССР N 1076446, кл. С 02 F 3/34, 1984).

Состав и способ очистки от нефти (Япония 1993).

Способ очистки воды от этилированного бензина с помощью штамма бактерий Pseudomonas putida-36 (СССР, 1992).

Известен штамм бактерий Acinetobacter oleovorum, предназначенный для очистки от нефтепродуктов (авт. св. СССР N 1723817, кл. С 12 N 1/20, 1991).

Способ очистки подсланцевых сточных вод, содержащих нефтепродукты, путем окисления активным илом с использованием специально селекционированных штаммов бактерий Rhodococcus erythropolis-ВКПМ-В-3078, Rhodococcus luteus ВКПМ-В-3077 и Micrococcus flavus ВКПМ-В-3079 (авт. св. СССР N 1493666, кл. С 12 N 1/20, 1989).

Способ очистки сточных вод, содержащих углеводороды, с помощью дрожжей (ЕР, 1992).

Способ очистки сточных вод, загрязненных маслами и жирами, с помощью бактерий, пекарских дрожжей, бактерий и энзимов (ДЕ, 1992).

Способ очистки сточных вод от ароматических соединений (фенолов, трихлорэтилена) с помощью Bacillus sp. и нитрифицирующих бактерий (SU, 1992, международная заявка N 90/10601, кл. С 02 F 3/34, 1991).

Способ очистки металлических поверхностей от нефтепродуктов при помощи моющих композиций (авт. св. СССР N 1824431, кл. С 11 D 1/34, 1993 и N 1781290, кл. С 11 D 1/83, 1993), в качестве моющих средств в данном способе используют ПАВ, применение которых наносит вред окружающей среде.

Способ очистки почвы и воды от нефтяных загрязнений, который основан на применении консорциума микроорганизмов. Однако данный способ очистки применим при 34-36^оС для дрожжей и 40-42^оС для бактерий; рН 5,0-7,0, глубина очистки 93-99% достигается в периодических условиях лишь при увеличении времени ферментации (72 ч) и комбинаций вносимых культур. Способ апробирован в лабораторных условиях.

Наиболее близким по сущности и достигаемому техническому результату является способ микробиологической очистки объектов от нефтяных загрязнений [1] который основан на применении природных сапрофитных бактерий Acinetobacter sp. (bicoccum) B-6445, Rhodococcus maris S-1213, Arthrobacter sp. S-1212.

Способ очистки, основанный на применении данных культур, ориентирован на применение в реальных условиях для очистки от нефтяных загрязнений почв, водоемов, емкостей и других объектов; применение данного способа для очистки промышленных стоков не предусматривалось. Температурный диапазон достигает 10-45^о; рН 3,0-9,0; скорость протока D=0,2 ч^-1. Однако часто требуется расширить данный диапазон, что достигается применением описываемого нами способа. Кроме того, штаммы относятся к различным таксономическим группам, что затрудняет их совместное выращивание для получения комбинированного препарата.

Эти недостатки преодолены в предлагаемом нами способе.

Целью изобретения является повышение эффективности очистки различных объектов от нефтепродуктов за счет интенсификации процесса деструкции на основе использования природных штаммов Acinetobacter valentis subsp. paraffinicum -ВКПМ-В-6727 Н-1; Acinetobacter valentis subsp. paraffinicum ВКПМ-В-6728 G-1; Acinetobacter valentis subsp. paraffinicum ВКПМ-В-6726 С-2. Все культуры депонированы в Коллекции промышленных микроорганизмов. Штаммы бактерий выделены из пропитанных нефтепродуктами почв Краснодарского края, Волгоградской обл. и Иркутской обл. и селекционированы в процессе культивирования на минеральной среде. В качестве источника углерода использовали карбамидные парафины.

Культуры Acinetobacter valentis Н-1, G-1 и С-2 утилизируют парафины широкой фракции С₈-С₃₃, сырую нефть, дизельное топливо, различные машинные масла и эмульсии, ароматические соединения, растительные масла и другие вещества, содержащие углеводороды.

Все штаммы облигатные аэробы, температура для роста 10-50^оС при рН среды 5,5-8,5.

Штаммы непатогенны, нетоксичны.

Штамм Acinetobacter valentis C-1 выделен из почв Волгоградской обл. пропитанных нефтепродуктами и селекционирован на карбамидных парафинах, растет при температуре до 50^оС.

Штамм утилизирует широкие фракции парафинов С₈-С₃₃, дизельное топливо, сырую нефть, ароматические соединения, масла.

Штамм имеет следующие характеристики.

Культурально-морфологические признаки.

В логарифмической стационарной фазе в виде кокков, диплококков. Спор не образует, жгутиков нет. Окраска по Граму отрицательная. размножается бинарным делением.

В односуточной культуре клетки на МПА в виде кокков, диплококков, диплопалочек. Размер клеток (0,7-0,8)х(0,7-2,1) мкм. На МПА образуют округлые, гладкие, кремоватые колонии с блестящей поверхностью, с гладким краем диаметром 1-5 мм. При росте в МПБ пленки нет. Муть умеренная, однородная. Осадок тягучий при встряхивании.

Физиологические признаки.

Ассимилирует глюкозу, рамнозу, мальтозу, сахарозу, лактозу, маннозу, маннит, арабинозу, адонит. Не ассимилирует дульцит и слабо ассимилирует салицин. Глюкозу не ферментирует Нитраты до нитритов не восстанавливает. Штамм оксидазоотрицательный, каталазоположительный, индол и сероводород не образует. Аэроб.

Растет активно в интервале рН среды от 5,5 до 8,5. Температурный диапазон роста широк: от 10 до 50^оС. Содержание сырого протеина в биомассе составило 68-73%
Штамм Acinetobacter valentis Н-1 выделен из почв Иркутской обл. пропитанных нефтепродуктами и селекционирован в условиях длительного непрерывного культивирования на карбамидных парафинах, растет при температуре до 50^оС. Штамм утилизирует широкие фракции парафинов С₈-С₃₃, дизельное топливо, сырую нефть, ароматические соединения, масла.

Штамм имеет следующие характеристики.

Культурально-морфологические признаки:
В логарифмической и стационарной фазе в виде кокков, диплококков. Спор не образует, жгутиков нет. Размножаются бинарным делением. В односуточной культуре клетки на МПА в виде кокков, диплококков, диплопалочек, в парах. Размер клеток (0,7-0,8)х(0,7-2,8) мкм. На МПА образует округлые, гладкие, кремоватые колонии с блестящей поверхностью, с гладким краем диаметром 2-4 мм колонии. При росте в МПБ пленки нет. Муть умеренная, однородная. Осадок тягучий при встряхивании. Окраска по Граму отрицательная.

Физиологические признаки:
Ассимилирует глюкозу, лактозу, рамнозу, мальтозу, маннозу, маннит, арабинозу. Не ассимилирует сахарозу, салицин, адонит, дульцит. Глюкозу не ферментирует. Нитраты до нитритов не восстанавливает. Штамм оксидазоотрицательный, каталазоположительный, индол и сероводород не образует. Аэроб.

Растет активно в интервале рН среды от 5,5 до 8,5. Температурный диапазон роста широк от 10 до 50^оС. Содержание сырого протеина в биомассе составило 70-74%
Штамм Acinetobacter valentis C-2 выделен из почв Краснодарского края, пропитанных нефтепродуктами и селекционирован на карбамидных парафинах, растет при температуре до 50^оС.

Штамм утилизирует широкие фракции парафинов С₈-С₃₃, дизельное топливо, сырую нефть, ароматические соединения, масла.

Штамм имеет следующие характеристики.

Культурально-морфологические признаки:
В логарифмической и стационарной фазе в виде кокков, диплококков. Спор не образует, жгутиков нет. Размножается бинарным делением. В односуточной культуре клетки на МПА в виде кокков, диплококков, диплопалочек, в парах. Размер клеток 0,8 (0,8-2,8) мкм. Окраска по Граму отрицательная. На МПА образует округлые, гладкие, серовато-кремовые колонии с блестящей поверхностью с гладким ровным краем, диаметр колонии от 1-5 мм. При росте в МПБ пленки нет. Муть умеренная, однородная. Осадок скудный.

Физиологические признаки:
Ассимилирует глюкозу, рамнозу, мальтозу, лактозу, маннозу, арабинозу, адонит. Не ассимилирует сахарозу, маннит, дульцит, адонит. Слабо утилизирует салицин. Глюкозу не ферментирует. Нитраты до нитритов не восстанавливает. Штамм оксидазоотрицательный, каталазоположительный, индол и сероводород не образует. Растет активно в интервале рН среды от 5,5 до 8,5. Температурный диапазон роста широк: от 10 до 50^оС. Содержание сырого протеина 68-72%
Все штаммы Н-1, С-1, С-2 непатогенны. Штаммы хранят путем периодических пересевов 2 раза в год на МПА. После пересева культуры выращивают при температуре 37-39^оС в течение суток, а затем хранение осуществляется при комнатной температуре.

Для получения активной биомассы штаммы бактерий выращивали на улучшенной минеральной среде следующего состава, г/л: (NH₄)₂SO₄ 3,0; KH₂PO₄ 6,5; MgSO₄ x7H₂O 0,7; ZnSO₄ · 7H₂O 0,0125; FeSO₄ · 7H₂O 0,0125; MnSO₄ · 7H₂O 0,0125; CuSO₄ · 5H₂O 0,003. Сырая нефть или парафины 0,5-2 об. Активность роста штаммов определяли по накоплению биомассы (г/л). Наработку бактериальной биомассы осуществляют в промышленных ферментерах в соответствие с регламентными показателями. Препараты могут применяться в виде суспензий, сгущенной пасты или в порошкообразном виде. Ниже приводятся примеры, подтверждающие высокую эффективность созданных биопрепаратов.

П р и м е р 1.

Речной песок содержит 0,5% сырой нефти. 100 г загрязненного песка помещали в колбу объемом 750 мл, содержащую 100 мл среды следующего состава, г/л: (NH₄)₂SO₄ 3,0; КН₂РО₄ 6,5; MgSO₄ · 7H₂O 0,7; CuSO₄ · 5H₂O 0,003; и микроэлементов по 12,5 мг (сернокислых солей железа, цинка и марганца), вода водопроводная. К содержимому колбы добавляли 25 мг сухого препарата, изготовленного на основе штамма Acinetobacter valentis G-1. Температура культивирования 48-50^оС, рН 7,0-7,5. Через 24 ч отмечалось эмульгирование нефти в водную фазу за счет ее десорбции из песка. Через 48 ч степень очистки составила 98,0% Это свойство штамма Acinetobacter valentis G-1 позволяет рекомендовать его для очистки нефтешламов, почв, воды, емкостей и других объектов от сырой нефти.

П р и м е р 2.

Штамм Acinetobacter valentis C-2 выращивают в той же среде (см. пример 1). В качестве источника углерода используют мазут флотский в концентрации 1 об. Температура ферментации 46-48^оС, рН среды 8,0-8,5. Выращивание проводили 48 ч. В конце испытания сумма общих углеводородов составила 0,8% ароматических 0,2% Таким образом степень очистки составила 96-98% Это свойство штамма Acinetobacter valentis C-2 позволяет рекомендовать его для очистки почвы, воды, хранилищ, емкостей и других объектов, загрязненных нефтепродуктами, в частности мазутом.

П р и м е р 3.

Штамм бактерий Acinetobacter valentis Н-1 выращивают в типовом ферментере интенсивного массообмена рабочим объемом 15 л при температуре 42^оС и рН среды 7,5-7,8 в среде следующего состава, г/л: Н₃РО₄ (75%) 2,5; К₂SO₄ 1,14; MgSO₄ · 7Н₂О 0,55; FeSO₄ · 7Н₂О 0,04; ZnSO₄ · 7Н₂О 0,033; MnSO₄ · 7Н₂О 0,032; CuSO₄ · 5Н₂О 0,013. Аммиак в виде аммиачной воды в количестве 2,45 г/л. В качестве источника углерода используют сточные воды нефтеперерабатывающего завода в концентрации 10 об. Скорость протока среды D=0,25-0,33 ч^-1. Концентрация абсолютно сухой биомассы составила 15 г/л. Степень очистки составила 96-100% в зависимости от скорости протока. Это свойство штамма Acinetobacter valentis Н-1 позволяет рекомендовать его для использования при очистке сточных вод нефтеперерабатывающих заводов и утилизации водно-нефтяных эмульсий, образующихся при отстаивании сырой нефти.

П р и м е р 4.

Испытание препарата на основе штамма Acinetobacter valentis С-2 для очистки сточных вод, содержащих смазочные масла, проводили в ферментере интенсивного массообмена "Биостат". Химический анализ показал, что в составе стока содержались неорганические источники азота, фосфора, магния, калия и серы. Температура культивирования составила 42-44^оС, рН 7,2-7,5, скорость протока среды D=0,25-0,33 ч^-1. Испытания показали, что ХПК на входе в ферментер составляет 920 мг О₂/л, а на выходе 80 мг О₂/л. Это обеспечивает снижение ХПК более чем в 10 раз, что достаточно для сброса очищенной воды в городскую канализацию.

П р и м е р 5.

Подземная яма высотой 2 м заполнена 140 м³ воды, содержащей 1 кг дизельного топлива.

В подземную яму было добавлено 50 г сухого бактериального препарата на основе культуры Acinetobacter valentis Н-1 и концентрированных минеральных солей, г/л: ортофосфорная кислота (80%) 650 мл; калий сернокислый 340 г; магний сернокислый 250 г; железо сернокислое 220 г; цинк сернокислый 70 г; марганец сернокислый 15 г.

Содержимое ямы аэрировали. Процесс очистки был завершен на 5 сутки и составил 99-100%
Таким образом, из приведенных примеров видно, что технологический результат достигается за счет внесения природных непатогенных штаммов бактерий деструкторов нефтепродуктов Acinetobacter valentis subsp. paraffinicum Н-1, Acinetobacter valentis subsp. paraffinicum G-1, Acinetobacter valentis subsp. paraffinicum C-2, развивающихся при повышенных оптимальных температурах 42-50^оС, рН среды 7,2-8,5 и способных утилизировать широкий спектр углеводородокисляющей активности.

Способ характеризуется высокой эффективностью очистки на уровне 96-100% с использованием каждого из видов в отдельности;
Штаммы способны развиваться при высокой скорости протока среды D=0,25-0,33 ч^-1, что позволит использовать их в промышленных очистных сооружениях.

Способ характеризуется широкой областью применения для очистки от нефтепродуктов почвы, воды, емкостей, сточных вод, нефтеперерабатывающей, нефтедобывающей, металлургической, машиностроительной промышленности, пищевой промышленности для очистки от масел. Способ апробирован в природных условиях, имеются акты применения в полевых условиях.

Использование: относится к биотехнологии и экологии и касается новых штаммов бактерий - деструкторов нефтепродуктов, способных расти в широком диапазоне температур и pH среды, а также при повышенных температурах на средах, содержащих в качестве источника углерода н-парафины широкой фракции, дизельное топливо, сырую нефть, мазут, масла, ароматические углеводороды, штаммы могут быть использованы для очистки от нефтезагрязнений различных емкостей, водных поверхностей, почв, сточных вод нефтеперерабатываюшей, металлургической, машиностроительной, пищевой промышленности при производстве мыла, красок, парфюмерно-косметических средств. Сущность применения: получение биопрепаратов на основе штаммов Acinetobacter valentis subspecies paraffinicum; ВКПМ-В-6727 Н-1; ВКПМ-В-6728 G-1; ВКПМ-В-6726 С-2, растущих при температуре 10 - 50^oС, в широком диапазоне pH 5,5 - 8,5 при скорости протока среды D = 0,25 - 0,33 ч^- 1. 1 з. п. ф-лы.

1. СПОСОБ ОЧИСТКИ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ ОТ НЕФТЕПРОДУКТОВ, предусматривающий внесение в очищаемую среду микроорганизмов и питательной среды, отличающийся тем, что из микроорганизмов используют Acinetobacter valentis subspecies paraffinicum ВКПМ В-6727, или Acinetobacter valentis subspecies paraffinicum ВКПМ В-6728, или Acinetobacter valentis subspecies paraffinicum ВКПМ В-6726, при этом температура среды составляет 10 - 50^oС, рН 5,5 - 8,5. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что очистке подвергают воду и сточные воды при скорости протока 0,25 - 0,33 ч^- 1.