ШТАММ БАКТЕРИЙ ACINETOBACTER SPECIES (BICOCCUM), ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВЫ И ВОДЫ ОТ НЕФТЕПРОДУКТОВ, ШТАММ БАКТЕРИЙ ARTHROBACTER SPECIES, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВЫ И ВОДЫ ОТ НЕФТЕПРОДУКТОВ, ШТАММ БАКТЕРИЙ RHODOCOCCUS SPECIES, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВЫ И ВОДЫ ОТ НЕФТЕПРОДУКТОВ, СПОСОБ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ОЧИСТКИ ОТ НЕФТЯНЫХ ЗАГРЯЗНЕНИЙ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 B09C1/10 C12N1/20 C12R1/06 B09C101/00 

Изобретение относится к микробиологии, а точнее к новым штаммам Acinetobacter species (bicoccum), Arthrobacter species и Rhodococcum species и способу биологической очистки от нефтяных загрязнений с использованием этих штаммов.

Названные штаммы могут найти широкое применение при восстановлении экологии окружающей среды, в регионах добычи и использования нефти и нефтепродуктов, а также для рекультивации земли, очистки водоемов.

Экологические нарушения природной среды, вызванные разливами нефти в местах ее добычи, хранения, транспортировки, переработки и использования, приобретают все большее распространение. По данным мировой литературы только лишь за счет аварий танкеров ежегодно в моря и океаны выбрасывается до 10 млн. т нефти. При аварийных выбросах нефти происходит гибель живых организмов, составляющих экосистему, и для восстановления ее целостности необходимо инициирование процесса деструкции углеводородов. В районах ее добычи из-под сельскохозяйственного использования выводятся тысячи гектаров плодородных земель, пастбищ, загрязняются рыбохозяйственные водоемы и источники питьевой воды. Большой проблемой является также очистка емкостей, танкеров из-под нефтепродуктов.

В природных условиях присутствуют многочисленные и разнообразные группы микроорганизмов, потребляющие углеводороды нефти. Однако способность этих микроорганизмов по времени и степени очистки совершенно неудовлетворительна, особенно при интенсивном загрязнении почв и водоемов.

Существуют различные способы очистки нефтяных загрязнений. Особое место занимают биологические способы очистки. Такие способы предусматривают применение микроорганизмов, бактерий, дрожжей, грибов.

Известно использование природного штамма Pseudomonas putida-36 в способе очистки почвы от нефтяных загрязнений (SU, A, 1428809). По этому способу очистку осуществляют путем введения биомассы бактериальной культуры указанного штамма в нефтяное загрязнение. Бактериальную культуру вводят совместно с минеральным удобрением, содержащим азот в нитратной форме. Количество вносимой культуры составляет не ниже 10⁴ клеток в 1 мг на 1 л при расходе водной смеси 0,5 1 л на 1 м².

Способ позволяет очищать почву от нефтяных загрязнений. Однако, используемую бактериальную культуру выращивают на дефицитном пищевом углеводном субстрате. Выбранный субстрат не является оптимальным, так как в его окислении принимают участие ферменты, отличные от ферментов деструкции нефти. Это приводит к снижению интенсивности очистки из-за адаптации культуры к новому субстрату. Кроме того, указанный штамм Pseudomonas putida-36 обладает гемолитической и желатиназной активностью, что препятствует развитию процесса самоочищения с помощью микроорганизмов.

При осуществлении этого способа достигаемая степень очистки недостаточно высока. Способ имеет ограниченное применение. Он практически пригоден лишь для очистки почвы. Более того, применение нитратных форм азота при осуществлении этого способа приводит к дополнительному загрязнению среды токсическими нитрат-ионами.

В основу изобретения положена задача путем селекции и использования новых штаммов создать такой биологический способ очистки от нефтяных загрязнений, который позволил бы очищать загрязненные различные объекты с большой интенсивностью и высокой степенью чистоты, не нарушая экологию окружающей среды.

Эта задача решена тем, что, согласно изобретению, заявляются новые штаммы Acinetobacter species (bicoccum) B-6445, Arthrobacter species S-1212 и Rhodococcum species S-1213, депонированные 19.01.93 во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов, Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции микроорганизмов.

Заявляемые штаммы являются сапрофитными природными штаммами. Они обладают высокой окислительной способностью по отношению к широкому спектру углеводородов различного химического строения и характеризуются свойством быстрой приживаемости в природных ценозах.

Штаммы в качестве единственного источника углерода усваивают широкий спектр углеводородов, входящих в состав нефти: н-алканы С₂-C₃₈, циклоалканы, ароматические углеводороды, асфальтены, неочищенные жидкие смеси парафинов, смолистые вещества, нефтемасла, дизельные фракции, мазут и сырую нефть (всего более 25 компонентов сырой нефти).

В процессе жизнедеятельности микроорганизмов углеводороды, утилизируемые этими штаммами, превращаются в клеточные вещества (белки, липиды, нуклеиновые кислоты, углеводы) и углекислый газ, которые затем включаются в общий цикл круговорота веществ в биосфере. После завершения очистки от нефтепродуктов образовавшаяся биомасса под воздействием регуляторных трофических механизмов включается в цикл естественных микробиоценозов, а избыточное ее количество отмирает, превращаясь под воздействием сапрофитной микрофлоры в гумусовые вещества почвы или в полноценную белково-витаминную массу, потребляемую водной фауной.

Штаммы непатогенны, нетоксичны и не обладают гемолитической активностью.

Заявляемый штамм Acinetobacter species (bicoccum) B-6445 селекционирован из активного ила на протоке, грамотрицательный и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Клетки на мясо-пептонном агаре неподвижные. В молодой культуре представляют собой короткие и толстые палочки размером 1,2 1,8•1,5 3,4 мкм, в 3-х суточной культуре кокковую форму размером 1,5 мкм. Культура спор не образует. Колонии на мясо-пептонном агаре (3-х суточная культура) округлые с ровным краем, беловатые, блестящие, консистенция сметанообразная.

Физиолого-биохимические признаки.

Облигатный аэроб. Хемоорганотроф. Каталазоположительный. Оксидазоотрицательный. Потребность в витаминах и дополнительных факторах роста отсутствует. Растет в широком диапазоне рН среды 3,0 9,0 и температур 10 - 45^oC. Оптимальная температура роста 35 40^oC. Использует минеральный азот.

Заявляемый штамм Arthorobacter species S-1212 селекционирован из активного ила на протоке, грамвариабельный и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Клетки на мясо-пептонном агаре неподвижные и представляют собой грамположительные клетки и грамотрицательные палочки. Клетки 3-х суточной культуры палочковидной неправильной формы варьируют по величине и форме, часто расположены под углом друг к другу, образуя V-образные формы. Колонии на мясо-пептонном агаре (3-х суточная культура) округлые с ровным краем, беловатые с блеском, равномерно выпуклые. Культура спор не образует.

Физиолого-биохимические признаки.

Облигатный аэроб. Хемоорганотроф. Каталазоположительный. Оксидазоотрицательный. Потребность в витаминах и дополнительных факторах роста отсутствует. Растет в широком диапазоне рН среды 3,0 8,5 и температур 10 - 35^oC. Использует минеральный азот. Фиксирует атмосферный азот.

Заявляемый штамм Rhodococcus species S-1213 селекционирован из активного ила на протоке, грамположительный и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Клетки на мясо-пептонном агаре неподвижные, одиночные короткоовальной формы и палочки, варьирующие по форме и величине. Клетки в молодой культуре могут образовывать цепочки, в старой культуре кокки. Размер палочек 1,0•1,7 мкм. Культура спор не образует.

Колонии на мясо-пептонном агаре (3-х суточная культура) округлые с ровным краем, светло-кремоватые с блеском, равномерно возвышенные.

Физиолого-биохимические признаки.

Облигатный аэроб. Хемоорганотроф. Каталазоположительный, оксидазоотрицательный. Потребность в витаминах и дополнительных факторах роста отсутствует. Растет в широком диапазоне рН среды 3,0 8,5 и температур 10 43^oC. Оптимальная температура 25 30^oC. Использует минеральный азот.

Получение биомассы бактериальной культуры осуществляют традиционным путем культивирования штаммов Acinetobacter species (bicoccum) B-6445, Arthrobacter species S-1212, Rhodococcus species S-1213 на любой стандартной питательной среде, например на минеральной среде, содержащей источники азота, фосфора и микроэлементы. Такой средой может служить, например среда Хоттинтера, Кинга, где в качестве источника углерода могут служить углеводы, органические кислоты, спирты, углеводороды, парафины или сырая нефть. Условия культивирования бактерий также традиционны.

Изобретением является также способ биологической очистки от нефтяных загрязнений, включающий внесение в загрязнение бактериальной культуры, в котором согласно изобретению в качестве бактериальной культуры используют штамм Acinetobacter species (bicoccum) B-6445, Arthrobacter species S-1212 и/или Rhodococcus species S-1213, при весовом соотношении биомассы бактериальной культуры к нефтяному загрязнению, равном 1 10 10⁵ соответственно.

Как указывалось выше, предлагаемые штаммы характеризуются высокой активностью роста на минеральной среде, где в качестве единственного источника углерода содержатся сырая нефть и нефтепродукты. При внесении биомассы этих бактериальных культур в нефтяное загрязнение происходит потребление субстрата бактериями, что приводит к деструкции нефтепродуктов, что и обеспечивает очистку от нефтяного загрязнения.

Указанное выше весовое соотношение биомассы бактериальной культуры к нефтезагрязнению является оптимальным. Оно обеспечивает очистку с высокой степенью чистоты (90 100% ). При внесении в загрязненный объект биомассы бактериальной культуры в количестве меньше, чем в указанном соотношении, продолжительность очистки значительно увеличивается, а при увеличении расхода биомассы бактериальной культуры выше указанного верхнего предела, эффективность очистки не повышается, а затраты на очистку увеличиваются.

В ряде случаев, когда в очищаемом объекте соли азота и фосфора отсутствуют или находятся в небольшом количестве, рекомендуется биологическую очистку осуществлять в присутствии минеральных солей азота и фосфора.

С целью интенсификации процесса очистки рекомендуется также ее проводить в присутствии микроэлементов, а именно, железа, цинка, марганца и/или магния. Наличие этих элементов способствует деструкции нефти.

Количество минеральных добавок (источников азота, фосфора, калия и магния и так далее) зависит от состава очищаемого объекта (почвы, воды), и расчет его ведется из определения концентрации этих элементов в природном объекте и вычислении недостающего их количества, необходимого для деструкции нефтяного загрязнения.

Предлагаемый способ биологической очистки от нефтяных загрязнений позволяет очищать загрязненные объекты независимо от степени загрязнения с большой эффективностью. Степень очистки при осуществлении предлагаемого способа составляет порядка 100% Способ универсален. Он пригоден для очистки почв, природных и искусственных водоемов, промышленных сточных вод, а также различного технологического оборудования. Способ экологически чист. Вносимая биомасса бактериальной культуры не требует применения каких-либо дополнительных веществ. В случае использования минеральных солей, последние полностью потребляются в процессе метаболизма бактерий. Сама биомасса бактериальной культуры включается в естественный биоценоз почвы, улучшая ее агротехническое состояние, либо служит дополнительным источником планктонного питания в случае очистки водоемов. Исключается также загрязнение грунтовых вод, так как предлагаемые природные штаммы бактерий являются облигатными аэробами, погибающими в отсутствии кислорода. Способ позволяет интенсифицировать процесс рекультивации сельскохозяйственных земель и очистку рыбохозяйственных водоемов, то есть осуществить возврат земель и водоемов в народнохозяйственное использование при одновременном обеспечении "оздоровления" окружающей среды.

Способ биологической очистки нефтяных загрязнений прост в технологическом исполнении и осуществляется следующим образом.

В зависимости от назначения полученную биомассу бактериальной культуры используют в виде водной суспензии, пасты или порошка. Так, например, при очистке водоемов целесообразно использовать биомассу в виде порошка, а при очистке почвы в виде суспензии или пасты.

Суспензию и пасту, как правило, применяют в местах, непосредственно приближенных к предприятиям по ее производству. Срок годности такой биомассы составляет (при температуре менее 15^oC) до 8 месяцев. Биомасса в высушенном состоянии имеет срок годности не менее 2-х лет. Она представляет собой мелкодисперсный слегка комковатый порошок желтовато-серого цвета, хорошо сохраняется в бумажных крафт-мешках в сухом месте при пониженной (но не отрицательной) температуре.

В случае применения минеральных добавок их вводят либо в смеси с биомассой бактериальной культуры, либо отдельно в виде водных растворов.

Обработка загрязненных участков почвы, воды, емкостей и других объектов осуществляется с помощью различных технологических машин, агрегатов, пожарных поездов, вертолетов или самолетов, а также вручную.

Предлагаемый способ предусматривает обработку почвы без снятия слоев почвы, хотя в некоторых случаях необходимо проводить ее рыхление (загрязненный песок, гравий, почва, пропитанная нефтью).

Очистка водоемов предполагает нанесение биомассы бактериальной культуры на загрязненную поверхность, например путем распыления.

Очистка емкостей осуществляется внесением в них суспензии, приготовленной заранее, с последующим ее перемешиванием.

Для лучшего понимания настоящего изобретения приводятся следующие конкретные примеры.

Пример 1. Резервуар высотой 150 см и диаметром 50 см заполняют 200 л воды, содержащей 4 вес. морской соли и на поверхности которой находится 1 кг сырой нефти с толщиной слоя 5 мм. В резервуар добавляют 20 г биомассы бактериальной культуры штамма Rhodococcum species S-1213 в виде порошка (весовое соотношение биомассы к нефти 1 10²). Содержимое резервуара перемешивают с помощью барботажа воздухом. Через 2 суток содержание н-алканов уменьшилось на 92,4% ароматических углеводородов на 90,1% Процесс полной очистки (100%) завершен в течение 7 суток.

Пример 2. 200-литровая емкость загрязнена на днище и стенках 3 кг нефтепродуктов (мазут). Проводят механическую мойку емкости водой (100 л), в которую добавлен штамм Acinetobacter species (bicoccum) B-6445 в виде суспензии с концентрацией 0,1 г абсолютно сухой биомассы/л (весовое соотношение биомассы к мазуту 1 10³). В емкость добавляют также следующие минеральные соли (г/л): NH₄H₂PO₄ 10; KH₂HPO₄ 10; MgSO₄•7H₂O 0,7. Через 2 суток содержание н-алканов уменьшилось на 93,7% ароматических углеводородов на 89,6% Полная очистка (100%) была завершена через 8 суток.

Пример 3. Участок почвы площадью 1 га загрязнен сырой нефтью в количестве 12,5 кг/см² (12,5 т). После однократной обработки биомассой бактериальной культуры в виде водной суспензии штамма Arthrobacter species S-1212 в количестве 12 кг абсолютно сухой биомассы (весовое соотношение биомассы к нефти 1 10³) через 7 суток на поверхности почвы визуально наблюдаются следующие изменения: маслянистая поверхность становится матовой, пронизывается мелкими порами за счет выделения углекислого газа, цвет меняется от черного до серого и затем темно-желтого. Агрегатный состав почвы из вязкой илообразной консистенции становится комковатым с характерным гнилостным запахом. Через 14 суток комочки почвы не горючи, через 21 суток нефтепродукты при химическом анализе не обнаруживаются, состав микрофлоры восстанавливается. Степень очистки составляет практически 100%
Пример 4. Водоем нефтебазы площадью 1 га содержит 183 т сырой нефти. После однократной обработки водоема суспензией биомассы бактериальной культуры штамма Arthrobacter species S-1212, содержащей 12 кг абсолютно сухой биомассы (весовое соотношение биомассы к нефти 1 10⁵), через 7 суток на поверхности появляются вздутия, обусловленные выделением углекислого газа. Нефтяная пленка становится последовательно бурой, темно-красной, светло-оранжевой и распадается на быстро исчезающие фрагменты, пронизанные белесыми скоплениями микробной массы. Через 20 суток пленка исчезает (100% очистка), прозрачность воды полностью восстановлена через 30 суток.

Пример 5. Амбар-отстойник площадью 300 м² загрязнен нефтепродуктами (смолистые вещества, асфальтены, сырая нефть) с толщиной слоя 1,0 1,5 см (загрязнение нефтепродуктами составляет 558 кг). Проведена однократная обработка пастой биомассы бактериальной культуры штамма Acibetobacter species (bicoccum) B-6445. Паста содержит 2,5 кг абсолютно сухой биомассы (весовое соотношение биомассы к нефтепродуктам 1 10³), 5 кг суперфосфата и 3 кг сульфата аммония. Через 21 сутки происходит полная (на 100%) очистка хранилища.

Примеры 6-11. Проводят очистку 600 мл воды, загрязненной сырой нефтью. Воду разливают в 6 колб по 100 мл в каждую и добавляют по 1 мл сырой нефти. Очистку осуществляют в колбах на качалке. Для этого в каждую колбу вводят минеральные соли, содержащие азот и фосфор. Затем в первую колбу вводят водную суспензию штамма Acinetobacter species (bicoccum) B-6445 (I), во вторую водную суспензию биомассы бактериальной культуры штамма Rhodococcus species S-1213 (II), в третью водную суспензию биомассы бактериальной культуры штамма Arthrobacter species S-1212 (III), в четвертую водную суспензию смеси биомассы бактериальной культуры штаммов I и II, в пятую водную суспензию биомассы бактериальной культуры смеси штаммов I и III, в шестую водную суспензию биомассы бактериальной культуры смеси штаммов I, II и III. Весовое соотношение вносимой засевной биомассы к нефти составляет во всех примерах соответственно 1 10.

Через 10 часов перемешивания степень очистки в 1-ой колбе составляет 15% во 2-ой колбе 13% в 3-ей колбе 12% в 4-ой колбе 70% в 5-ой колбе 65% в 6-ой колбе 60% и в 7-ой колбе 100%
Через 24 часа перемешивания степень очистки во всех колбах составляет 100%
Заявляемые штаммы характеризуются углеводородокисляющей активностью и могут быть использованы для восстановления экологии окружающей среды в нефтедобывающей и нефтеперерабатывающей и других отраслях промышленности. Предлагаемый способ может найти широкое применение в сельском хозяйстве при рекультивации почв, в восстановлении чистоты водоемов, а также в различных отраслях народного хозяйства, связанных с добычей, переработкой, транспортировкой и применением нефти и нефтепродуктов.

Использование: изобретение относится к микробиологии, а точнее к способу очистки от нефтяных загрязнений с использованием новых штаммов. Сущность изобретения: предложены новые штаммы бактерий Acinetobacter species (bicoccum) Arthrobacter species, Rhodococcus sp., а также способ биологической очистки от нефтяных загрязнений, который включает внесение бактериальной культуры в загрязнение, где в качестве культур используют указанные штаммы, взятые индивидуально или в любом сочетании друг с другом при массовом соотношении бактериальной культуры к нефтяному загрязнению, равном 1:10 - 10⁵ соответственно. 5 с.п. ф-лы.

1. Штамм бактерий Acinetobakcter species (bicoccum) ВКПМ В-6445, используемый для очистки почвы и воды от нефтепродуктов. 2. Штамм бактерий Rhodococcus species ВКПМ S-1213, используемый для очистки почвы и воды от нефтепродуктов. 3. Штамм бактерий Arthrobacter species ВКПМ S-1212, используемый для очистки почвы и воды от нефтепродуктов. 4. Способ биологической очистки от нефтяных загрязнений, включающий внесение в загрязнение бактериальной культуры, отличающийся тем, что в качестве бактериальной культуры используют штаммы бактерий Acinetobacter species (bicoccum) ВКПМ В-6445, или Arthrobacter species ВКПМ S-1212, или Rhodococcus species ВКПМ S-1213, при этом массовое соотношение биомассы бактериальной культуры и нефтяного загрязнения составляет 1:10 10⁵. 5. Способ биологической очистки от нефтяных загрязнений, включающий внесение в загрязнение бактериальной культуры, отличающийся тем, что в качестве бактериальной культуры используют смесь штаммов бактерий Acinetobacter species (bicoccum) ВКПМ В-6445, Arthrobacter species ВКПМ S-1212 и Rhodococcus species ВКПМ S-1213 при массовом соотношении биомассы бактериальной культуры и нефтяного загрязнения 1:10 10⁵.