КОНСОРЦИУМ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ ACINETOBACTER CALCOACETICUS, PSEUDOMONAS FLUORESCENS, ALCALIGENES FAECALIS ДЛЯ ДЕСТРУКЦИИ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 1998 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 C12N1/20 C12R1/27 C12R1/01 

Изобретение относится к средствам борьбы с загрязнениями почвы, воды и емкостей нефтью и нефтепродуктами с помощью специально подобранной ассоциации психрофильных культур бактерий.

Процесс самоочищения в естественных условиях Севера, Западной Сибири, районах, где недолгий летний период времени, очень длителен, что связано с бедностью флоры нефтеокисляющих бактерий, дефицитом органики, аэрации, низкой температурой и pH очищаемой среды.

Известна ассоциация нефтеокисляющих культур Rhodococcus erythropolis 367-2, Rhodococcus maris 367-5, Rhodococcus erythropolis 367-6, Pseudomonas stutzeri 367-1, Candida lipolytica 367-3 [1] , входящих в биопрепарат "Деворойл".

Недостатком известной ассоциации является применение дорогостоящей углеводной среды для получения биомассы препарата и более высокая температура культивирования 20-40^oC, при которой длительно адаптированная к нефти ассоциация способна развиваться, что ограничивает область применения в средней и южной полосе России.

Известна другая ассоциация нефтеокисляющих культур: Rhodococcus erythropolis ВКПМ-В-3078 (36а-1), Rhodococcus luteus ВКПМ-В-3079 (25) и Micrococcus flavus ВКПМ-В-3077 (53) [2]. Для данной ассоциации культур оптимальная температура 23-26^oC, pH среды 6,0-8,5, оптимум - pH 7,0.

Недостатком известной ассоциации является низкая концентрация в среде окисляемого нефтепродукта 80-100 мг/л в аэротенке опытно-промышленной установки с коэффициентом разбавления 0,126-0,167 ч^-1, более узкий интервал pH среды 6,0-8,5 при обязательном наличии концентрации активного или 1,5 г ACB/л. Известно, что активный ил обеспечивает окисление многих веществ, поступающих на очистные сооружения, включая и нефтепродукты. Однако даже в этом случае не достигается требование санэпиднадзора к очищенной воде для рыбохозяйственного назначения (ПДК - 0,05 мг/л). Содержание остаточных нефтепродуктов после очистки равно 1,0-1,5 мг/л.

Наиболее близким по техническому решению к изобретению является ассоциация бактерий вида Acinetobacter oleovorum ЦМПМ-В-1878 и ВКПМ У-4091, развивающаяся при более широком диапазоне pH среды 4,5-8,5 и температуре 16-42^oC, высокой скорости протока среды Д-0,33 ч^-1 и концентрации нефтепродукта в среде 1 - 5 мас.%, при этом процент очистки достигается 93-95% [3].

Недостатком прототипа является относительно высокая температура культивирования 16^oC и более.

Техническим результатом изобретения является повышение эффективности очистки при низкой температуре 3-15^oC, что позволяет охватывать северные регионы страны, загрязненные нефтепродуктами при скорости биодеструкции 0,055 г углеводородов нефти/г биомассы x ч - 0,198 г углеводородов нефти/г биомассы x ч.

Для этого предлагается использовать консорциум бактерий: ВКПМ-В-7179 - Acinetobacter calcoaceticus - 279, ВКПМ-В-7152 - Pseudomonas fluorescens - 325, ВКПМ-В-7180 - Alcaligenes faecalis - 404, в водном растворе минеральных компонентов питания.

Психрофильные штаммы деструкторы нефти и нефтепродуктов выделены: Pseeudomonas fluorescens штамм 325 ВКПМ-В-7152 из почв, пропитанных мазутом, около котельной Кировского завода г. Санкт-Петербурга, Alcaligenes faecalis штамм 404 ВКПМ-В-7180 из активного ила очистных сооружений г. Сетуни, Acinetobacter calcoaceticus штамм 279 ВКПМ-В-7179 из воды, покрытой тонким слоем нефтепродуктов в разливах р. Волги близ г. Астрахани; каждый из штаммов получен методом накопительной культуры, в результате многократных пассажей на минеральной среде с нефтью - 1 г/л или мазутом - 500 мг/л, затем на более очищенном сырье - дизельном топливе фракции 240-360^oC - 5 об.%.

Выращивание проводилось в колбах: объем - 100 мл минеральной среды, на качалке при 220 об/мин, pH - 7,0 и температуре культивирования 3-15^oC.

Селекционированные штаммы имеют следующие морфологические, физиолого-биохимические свойства.

Acinetobacter calcoaceticus штамм 279 ВКПМ-В-7179 - грамотрицательные неподвижные, толстые, короткие палочки, встречаются кокковидные одиночные или сдвоенные, редко цепочки, часто клетки расположены под углом размером 0,7х1,4, 0,7х2,8, 1,0х1,1 мкм, размножаются делением: перетяжка и перегородка, каталазоположительные, оксидазоотрицательные, индол, сероводород не образуют; желатину не разжижает; молоко не изменяет, подщелачивает; нитраты не восстанавливает. Из источников углерода ассимилирует: глюкозу, сахарозу, галактозу, миннозу, раффинозу, крахмал, сорбит, глицерин. На МПА образует белые гладкие блестящие колонии, профиль равномерно возвышающийся, край ровный, диаметр 2,0-2,5 мм. Из нефтепродуктов хорошо растет на нефти, мазуте, дизельном топливе, рафинате, масле, парафинах широкой фракции. Содержание Г+Ц в ДНК 40 - 47 мол.%. Растет в пределах температур 6-20^oC, при pH среды 6,8-7,6. Штамм непатогенен, нетоксичен и не вирулентен. Хранится на косяках МПА и в лиофилизированном состоянии на защитной среде Файбич при температуре +4^oC.

Pseudomonas fluorescens штамм 325 ВКПМ-В-7152 - грамотрицательные слабоподвижные короткие и длинные палочки, одиночные, реже сдвоенные или слегка изогнутые размером 0,7х5,0, 1,05х2,1, 0,7х3,5 мкм, размножаются делением - перетяжка, каталазоположительные, желатину не разжижает; молоко не свертывает; нитраты не восстанавливает, резко антагонистичен к плесневым грибам из рода Fusarium. Из источников углерода использует: 1-арабинозу, глюкозу, сахарозу, галактозу, маннит, сорбит, этиловый спирт. На МПА образует серовато-белые гладкие блестящие колонии с зеленоватым оттенком с диаметром 2-4 мм, профиль колоний выпуклый, край ровный. Из нефтепродуктов хорошо растет на нефти, мазуте, дизельном топливе, рафинате, масле и парафинах. Не нуждается в факторах роста. Содержание Г+Ц в ДНК 58 - 70 мол.%. Растет в пределах температур 3-15^oC, при pH среды 6,8-8,5. Штамм непотогенен, нетоксичен. Хранится на косяках МПА и в лиофилизированном состоянии на защитной среде Файбич при температуре +4^oC.

Alcaligenes faecalis штамм 404 ВКПМ-В-7180 - грамотрицательные, толстые, короткие слабоподвижные палочки размером 1,0х1,05, 1,05х1,4, 0,7х1,05, 1,5х1,4, 0,7х0,7 мкм, размножаются делением - каталазо- и оксидазоположительные, желатину не разжижает, молоко не изменяет, подщелачивает, нитраты слабо восстанавливает до нитритов. Из источников углерода использует: глюкозу, сахарозу, лактозу, мальтозу, арабинозу, маннозу, маннит, сорбит, дульцит. На МПА образует серовато-бежевые гладкие блестящие колонии, профиль колоний выпуклый, хорошо растет на сырой нефти, мазуте, дизельном топливе, рафинате, масле и парафинах. Не нуждается в факторах роста. Содержание Г+Ц в ДНК 57,9 - 70 мол. %. Растет в пределах температур 6-20^oC, при pH среды 7,0-8,5. Штамм непатогенен, нетоксичен, невирулентен. Хранится на косяках МПА и в лиофилизированном состоянии на защитной среде Файбич при температуре +4^oC.

Чувствительность к антибиотикам изучена с использованием бумажных дисков, содержащих стандартные концентрации: ампициллина, канамицина, карбеницилина, левомицетина, оксацилина, рифампицина, тетрациклина, фузидина, стрептомицина, эритромицина. Данные представлены в табл. 1.

Предлагаемый консорциум культур бактерий в длительном непрерывном процессе устойчив и не вытесняется посторонней микрофлорой, и их можно отличить друг от друга высевом на МПА из одного разведения с различными антибиотиками. Штаммы отличаются по отношению к стрептомицину, левомицетину, фузидину, оксалину (см. табл. 1). Селекционированные природные психрофильные штаммы бактерий стабильны в непрерывном процессе и легко переключаются с одного вида субстрата к другому, время адаптации не более одного часа.

Введение консорциума психрофильных штаммов бактерий ВКПМ-В-7179 штамм 279, ВКПМ-В-7152 штамм 325, ВКПМ-В-7180 штамм 404 в загрязненную почву позволяет повысить скорость биодеструкции при температурах культивирования 3-15^oC, при соотношении культур, % (35:40:25)-(30:50:20). Штаммы ВКПМ-В-7179 и ВКПМ-В-7162 более быстрорастущие и выделяют в среду витамины и аминокислоты, что способствует росту штамма ВКПМ-В-7180.

В предлагаемом способе очистки от нефти и нефтепродуктов с помощью консорциума указанных психрофильных штаммов бактерий количество и состав водного раствора минеральных компонентов питания подбирается в зависимости от условий применения по концентрациям основных питательных веществ, определяющих развитие предлагаемых штаммов бактерий, а также с учетом имеющихся их в среде очищаемого объекта.

Пример 1. Использование консорциума психрофильных бактерий для очистки от нефтепродуктов.

Для получения биомассы консорциума штаммов бактерий ВКПМ-В-7179 штамм 279, ВКПМ-В-7152 штамм 325, ВКПМ-В-7180 штамм 404 их выращивают на жидкой среде N10 следующего состава: (NH₄)₂SO₄ - 3 г/л, KH₂PO₄ - 6,5 г/л, MgSO₄х7H₂O - 0,7 г/л, FeSO₄x7H₂O - 12,5 мг/л, ZnSO₄x7H₂O - 12,5 мг/л, MnSO₄х5H₂O - 12,5 мг/л.

В качестве единственного источника углерода используют н-парафины Грозненского НПЗ, полученные карбамидной депарафинизацией с высоким содержанием ароматических углеводородов в концентрации 1 мас.%. Засев минеральной среды производился по 0,05 единиц оптической плотности каждого штамма в одну качалочную колбу. В результате культивирования при температуре 3-6^oC на качалке с 140 об/мин, pH среды 6,8-7,0, предлагаемый консорциум бактерий ВКПМ-В-7179 штамм 279, ВКПМ-В-7152 штамм 325, ВКПМ-В-7180 штамм 404 обеспечил за 42 ч утилизацию карбамидного парафина на 87%. Удельная скорость деструкции грозненского парафина составила по сумме углеводородов - 0,052 г УГВ нефти/г ч, по общей сумме экстрагируемых веществ - 0,055 г УГВ нефти/г ч. Соотношение компонентов культур в ассоциации при высевах на твердую питательную среду МПА с различными антибиотиками составило соответственно, % (30: 40:25) - (30:50:20).

Пример 2. Способ очистки с помощью психрофильных культур проводился в типовом ферментере рабочим объемом 25 л, при аэрации ферментера воздухом в количестве 3 л/л/мин, температура культивирования 12-15^oC, pH среды 6,8-7,0 при скорости протока среды Д-0,2 ч^-1. В качестве источника углерода использовали парафин широкой фракции Новокуйбышевского НПЗ 1,5 об.% и 0,5 об.% сырой грозненской нефти. Засев производился всех трех культур по 0,2 единиц оптической плотности. В качестве питательной среды использовали, г/л:
Ортофосфорная кислота (70%) - 2,5
Хлористый калий - 2,09
Сернокислый магний - 0,55
Сернокислое железо - 0,1
Сернокислый цинк - 0,33
Сернокислый марганец - 0,033
Сернокислая медь - 0,012
Азот в виде 6% (NH4)OH - 2,45 г/л
pH среды - 6,8-7,0
Удельная скорость биодеструкции составила 0,198 г УГВ нефти/ г/ч. Выход от заданного сырья - 89,6%, процесс был стабильным и соотношение культур в ассоциации при высевах на твердую питательную среду - МПА с антибиотиками был таким же, как в периодическом культивировании в колбах на качалках, % (30-35):(40-50):(20-25).

Пример 3. Способ очистки от нефтепродуктов проводился в качалочных колбах на морской воде следующего состава:
Ион аммония - следы
Фосфат-ион - следы
Калий - 400 мг/л
Магний - 1500 мг/л
Железо - следы
На 100 мл морской воды добавляли 2 мл грозненской нефти, 60 мг иона аммония (в форме сульфата), 100 мг фосфат-иона (в форме ортофосфорной кислоты), 4 мг железа (в форме сульфата железа семиводного) и 90,0 мг сухой биомассы смеси штаммов бактерий 279, 325 и 404 в соотношении 1:1:1. Культивирование проводилось в течение 120 ч на качалке с 220 об/мин при температуре 12-15^oC. Результаты эксперимента представлены в табл. 2.

Таким образом, предлагаемый консорциум психрофильных микроорганизмов обеспечивает повышение скорости утилизации углеводородов при температуре 3-15^oC, что позволяет использовать их при очистке загрязнений в северных регионах. Бактерии устойчивы в длительном непрерывном процессе, не нуждаются в дополнительных факторах роста и обеспечивают высокую эффективность очистки от нефтепродуктов как в пресной, так и в морской воде и почве.

Консорциум психрофильных бактерий: Acinetobacter calcoaceticus Baumann et al. штамм 279 ВКПМ -В-7179, Psеudomonas fluorescens Stanier et al. штамм 325 ВКПМ-В-7152, Alcaligenes faecalis Castellani et Chalmers штамм 404 ВКПМ-В-7180- предназначен для очистки почвы, воды, емкостей и сточных вод промышленных предприятий от загрязнений нефтепродуктами в северных регионах страны при 3 - 15^oC. Селекционированные психрофильные штаммы бактерий характеризуются высокой окислительной способностью, устойчивостью в длительном непрерывном и периодическом процессе, растут активно в пресной и морской воде при соотношении культур, %: (35 : 40 : 25) - (30 : 50 : 20). 2 табл.

Консорциум штаммов бактерий Acinetobacter calcoaceticus et al. ВКПМ-В-7179, Pseudomonas fluorescens Stanier et.al. ВКПМ-В-7152, Alcaligenes faecalis Castellani et Chaliners ВКПМ-В-7180, предназначенный для деструкции нефти и нефтепродуктов.