СПОСОБ УКОРЕНЕНИЯ ПОБЕГОВ ПЛОДОВЫХ КУЛЬТУР, ПОЛУЧЕННЫХ IN VITRO Российский патент 1996 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в процессе массклонального размножения различных культур на этапе ризогенеза.

Известно, что для укоренения побегов, полученных в культуре ткани, применяют питательные среды, содержащие ауксины, или проводят обработку базального конца побегов гормонами с последующей посадкой на среду без них. Наиболее распространенным и простым является способ введения индуктора корнеобразования непосредственно в среду в концентрациях 0,5-2,0 мг/л, однако длительное его воздействие может вызвать нежелательные последствия, т.е. стимулировать образование каллуса и ингибировать рост корней. В связи с этим прибегают к кратковременной обработке оснований микрочеренков ауксинами и посадке их на среду без гормонов. При этом способе укоренение производят в два этапа: вначале микрочеренки замачивают в водном растворе стимулятора ризогенеза в специальных бюксах, затем их переносят на среду без гормонов. При замачивании часто нарушается стерильность, технологически процесс сложен, более трудоемок, укореняемость часто бывает нестабильна из-за трудности погружения черенков в раствор со стимулятором на одинаковую глубину.

Цель изобретения упрощение технологического приема замачивания, ускорение процесса ризогенеза, улучшение качества корневой системы микрочеренков.

Сущность изобретения состоит в том, что замачивание микрочеренков для индукции ризогенеза проводят в течение нескольких дней в водном растворе стимулятора, размещенном над агаризованной средой в сосудах для укоренения.

П р и м е р 1. Для укоренения берутся побеги, полученные при микроклональном размножении клоновых подвоев яблони и груши и достигшие высоты 1,5-3,0 см. Ризогенез проводят на среде Мурасиге-Скуга (1962) следующего состава, мг/л: Аммоний азотнокислый 825 Калий азотнокислый 850 Кальций хлористый двухвод- ный 220 Магний сернокислый семивод- ный 185 Калий фосфорнокислый одно- замещенный 85 Натрий ЭДТА 37,3 Железо сернокислое закис- ное семиводное 27,8 Борная кислота 3,1 Кобальт хлористый шестивод- ный 0,0125 Медь сернокислая пятиводная 0,0125 Марганец сернокислый четырехводный 11,15 Калий йодистый 0,415 Цинк сернокислый семи- водный 4,3 Натрий молибденовокис- лый двухводный 0,125 Тиамин 0,5 Пиридоксин 0,5 Никотиновая кислота 0,5 Аскорбиновая кислота 1,5 Мезоинозит 100 Сахароза 30000 Агар 8000 Вода дистиллированная До 1 л
В качестве индуктора корнеобразования используют стерильный водный раствор ИМК в концентрации 3,0 мг/л, который разливают в стерильных условиях по 1 мл (слой 5-7 мм) в пробирки диаметром 18-20 мм над застывшей после автоклавирования агаризованной средой без гормонов. Таким образом, микрочеренки замачивают непосредственно в пробирке для укоренения. Через 5 дней раствор ИМК сливают, а базальную часть побега, находившуюся в ИМК, погружают в агаризованную среду без гормонов на 3-5 мм.

Контрольные побеги высаживают на агаризованную питательную среду того же минерального состава с ИМК 0,5 мг/л. Дальнейшее культивирование проводят в культуральной комнате при температуре 24 ± 2^оС, освещенности 3-5 тыс.люксов, длине светового периода 18 ч.

Опыты выполняют в 3-кратной повторности.

Результаты приведены в табл.1.

Как видно из табл.1, замачивание микрочеренков в ИМК над средой очень сильно ускоряет и повышает укореняемость побегов у подвоя яблони ММ 106. Через 2 нед. культивирования укореняемость уже превышала на 37,5% контрольный вариант, а через 6 нед. на 40,0% У данного подвоя отмечено также увеличение количества корней в 2 раза. Существенных различий по укореняемости и качеству корневой системы у подвоя груши N 12 не наблюдалось. Преимущество замачивания микрочеренков над средой наглядно показывает индикатор укореняемости, который является совокупным показателем ризогенеза и качества корневой системы.

П р и м е р 2. Тот же опыт был проведен на подвое яблони 54-118 и сорте груши Бессемянка. У обоих подвоев существенных различий по укореняемости микрочеренков нет (F_факт < F_табл.). Однако у подвоя 54-118 замачивание над средой привело к увеличению количества корней в 2,7 раза и их длины в 3,0 раза. У сорта груши Бессемянка, хотя корней на один побег образовалось меньше, но они были гораздо длиннее (в 3,7 раза). В результате снижения количества корней индикатор укореняемости у данного сорта ниже, чем в контроле.

Результаты приведены в табл.2.

В обоих примерах введение ИМК в среду (контрольный вариант) приводило к сильному каллусообразованию, который ингибировал рост корней (см. табл.2). В дальнейшем каллус отрицательно влиял на адаптацию пробирочных растений к условиям in vivo. При замачивании микрочеренков над средой каллус не образовывался.

Таким образом, замачивание микрочеренков в растворе ИМК над агаризованной средой ускоряет их укореняемость, улучшает качество корневой системы, исключает образование каллуса, который препятствует ризогенесу и снижает адаптационные свойства растений-регенерантов.

Использование: в сельском хозяйстве и биотехнологии, в частности, для микроклонального размножения плодовых культур. Сущность изобретения: укоренение осуществляют путем предварительного замачивания микрочеренков в водном растворе ИМК в течение нескольких дней и последующего укоренения в агаризованной питательной среде. При этом весь процесс осуществляют в одном культивационном сосуде, в который помещают агаризованную питательную среду, а на ее поверхность наносят раствор стимулятора ризогенеза слоем 5-7 мм, в который погружают черенок, после выдерживания раствор сливают и основание черенка погружают в питательную среду на глубину 3-5 мм. 1 з. п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ укоренения побегов плодовых культур, полученных in vitro, включающий замачивание микрочеренков в водном растворе ИМК в течение нескольких дней, пересадку их для укоренения на агаризованную разбавленную вдвое по минеральному составу среду Мурасиге-Скуга без гормонов, отличающийся тем, что замачивание и укоренение микропобегов проводят в одном сосуде, при этом замачивание побегов осуществляют путем погружения в водный раствор стимулятора ризогенеза, нанесенный на поверхность агаризованной питательной среды, а укоренение проводят в агаризованной питательной среде после удаления раствора стимулятора и погружения основания черенка в среду на 3 5 мм. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что водный раствор стимулятора ризогенеза наносят на поверхность агаризованной среды слоем 5 7 мм.