СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КРАСИТЕЛЯ ДЛЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Российский патент 1996 года по МПК C09B61/00 

Изобретение относится к естественным органическим красителям, а также к способу получения красителя из растительного сырья, который может быть использован для гистологических целей.

Известен способ получения красителя для гистологических целей путем экстрагирования выжимок из плодов тутового дерева в течение 48-50 ч со смесью кислоты и метанола с последующим выпариванием экстракта под вакуумом [1]
Однако в этом способе в качестве сырья используют продукты, находящие применение в пищевой промышленности, а сам способ отличается высокой энергоемкостью.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения красителя для гистологических целей, согласно которому растительное сырье плоды воронца заостренного (Actata acuminote Wall) настаивают в 70%-том этиловом спирте в течение 24-48 ч, экстракт фильтруют, а фильтрат обрабатывают 8-10 мл ледяной уксусной кислоты, 1-1,6 г алюмокалиевых квасцов и 1,6-2,4 г мочевины на 10 мл фильтрата [2]
Получаемый краситель фиолетового цвета окрашивает ядерные структуры животных клеток после фиксации материала по Максимову и уплотнения в парафине.

Недостатки этого способа заключаются в длительности экстракции (24-48 ч) и выдерживания срезов в красителе (8-10 ч), необходимости введения в состав красителя алюмокалиевых квасцов и мочевины, а также нестойкости красителя при хранении и быстром обесцвечивании срезов.

Изобретение решает задачу интенсификации и упрощения способа получения красителя для гистологических целей и повышения устойчивости этого красителя.

Это достигается тем, что в способе получения красителя для гистологических целей, включающем экстракцию растительного сырья 70%-ным этиловым спиртом, отделение экстракта и обработку его ледяной уксусной кислотой из расчета 8-10 мл на 100 мл экстракта, в качестве растительного сырья используют измельченные плоды вороньего глаза (Paris quudufolia L.), экстракцию ведут 10-12 объемами 70% -ного этанола в течение 3-4 ч при интенсивном перемешивании, а к экстракту после подкисления добавляют 0,05%-ный раствор гиалуроновой кислоты из расчета 1-2 мл на 100 мл экстракта.

Предлагаемый способ предусматривает значительную интенсификацию процесса экстракции (3-4 ч) за счет осуществления его в динамических условиях. При этом не требуется введения в краситель квасцов и мочевины, а длительная сохранность красителя и обрабатываемых им срезов (не менее 1 г.) достигается за счет введения 0,05%-ного раствора гиалуроновой кислоты (из расчета 1-2 мл на 100 мл экстракта), получаемой из петушиных гребней.

Механизм такого повышения устойчивости красителя окончательно не расшифрован, однако в нашем распоряжении имеются данные, позволяющие считать, что гиалуроновая кислота, являющаяся, как известно, высокомолекулярным полисахаридом, вступает во взаимодействие с реакционноспособными группами красителя, в результате чего образуются укрупненные молекулы, более устойчивые к воздействию различных факторов внешней среды. При этом уменьшение количества гиалуроновой кислоты, по сравнению с предлагаемым, оказывается недостаточным для получения устойчивого красителя, а увеличение ее количества приводит к повышению вязкости раствора красителя и ухудшению его качества.

П р и м е р 1. Плоды вороньего глаза измельчают на мясорубке, 100 г плодов помещают в эмалированную емкость, заливают 1 л 70%-ного этилового спирта (10 объемов), емкость закрывают герметической крышкой, устанавливают на вибровстряхиватель и проводят экстракцию при 10-15 качаниях в минуту в течение 1 ч. По окончании процесса экстракции смесь фильтруют через ватно-марлевый фильтр и к 900 мл полученного фильтрата добавляют 72 мл ледяной уксусной кислоты (8 мл на 100 мл экстракта) и 9 мл 0,05%-ного раствора гиалуроновой кислоты (1 мл на 100 мл экстракта). Получают краситель фиолетового цвета, пригодный для окраски парафиновых срезов после фиксации материала в жидкости Максимова. При выдерживании среза в красителе в течение 0,5-1 ч ядра клеток ацинусов и выводных протоков слюных желез хорошо просматриваются.

П р и м е р 2. 100 г измельченных плодов вороньего глаза экстрагируют 1,1 л 70%-ного этилового спирта (11 объемов) на вибровстряхивателе при 10-15 качаниях в минуту в течение 3 ч, затем фильтруют и к 1 л фильтрата добавляют 90 мл ледяной уксусной кислоты (9 мл на 100 мл экстракта) и 15 мл 0,05%-ного раствора гиалуроновой кислоты (1,5 мл на 100 мл экстракта). Получают краситель фиолетового цвета, пригодный для окраски парафиновых срезов после фиксации материала в жидкости Максимова. Срезы животных клеток выдерживают в красителе в течение 0,5-1 ч.

П р и м е р 3. 100 г измельченных плодов вороньего глаза экстрагируют 1,2 л 70% -ного этилового спирта (12 объемов) на вибровстряхивателе (10-15 качаний/мин) в течение 4 ч, затем фильтруют и к 1 л фильтрата добавляют 100 мл ледяной уксусной кислоты (100 мл на 100 мл экстракта) и 20 мл 0,05%-ного раствора гиалуроновой кислоты (2 мл на 100 мл экстракта). Получают краситель фиолетового цвета для гистологических целей, в котором выдерживают срезы животных клеток в течение 0,5-1 ч.

Сопоставительный анализ технико-экономических показателей известного способа и предлагаемого приведен в таблице.

Таким образом, краситель по предлагаемому способу экстрагируют в 12 раз быстрее, он является значительно более устойчивым при хранении и быстрее окрашивает срезы животных клеток.

Использование: в пищевой промышленности, а именно при производстве красителя из растительного сырья. Сущность изобретения: измельченные плоды вороньего глаза экстрагируют 10 - 12 объемами 70%-ного этилового спирта в течение 2 - 4 ч при интенсивном перемешивании, отделяют экстракт и подкисляют его ледяной уксусной кислотой из расчета 8 - 10 мл на 100 мл экстракта, затем добавляют 0,05%-ный раствор гиалуроновой кислоты из расчета 1 - 2 мл на 100 мл экстракта. 1 табл.

Способ получения красителя для гистологических исследований, предусматривающий экстракцию растительного сырья растворителем 70%-ным этиловым спиртом, отделение экстракта фильтрацией и подкисление полученного экстракта ледяной уксусной кислотой из расчета 8 10 мл на 100 мл экстракта, отличающийся тем, что в качестве растительного сырья используют измельченные плоды вороньего глаза, экстракцию проводят 10 12 объемами растворителя в течение 2 4 ч при интенсивном перемешивании, а после подкисления к полученному экстракту добавляют 0,05%-ный раствор гиалуроновой кислоты из расчета 1 2 мл на 100 мл экстракта.