СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ, ОБЛАДАЮЩЕЙ БАКТЕРИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 1997 года по МПК C08B37/08 A61K31/725 

Изобретение относится к химии природных соединений, конкретно, к способу получения гиалуроновой кислоты (ГК), обладающей бактерицидной активностью, которая может быть использована в медицине для лечения заболеваний, вызываемых различными грамположительными и грамотрицательными микроорганизмами.

Известно несколько способов выделения гиалуроновой кислоты из животного и бактериального сырья. Эти способы позволяют получить препараты гиалуроновой кислоты с высокими вязкоэластичными свойствами, используемые в качестве вископротекторов в офтальмологии, а также для удерживания влаги на коже при введении в состав различных лечебных и косметических композиций.

Недостатки известных способов заключаются в том, что препараты ГК не оказывают бактерицидного действия и поэтому являются неэффективными при лечении инфекционных заболеваний.

Наиболее близким к заявляемому по технической сущности является выбранный в качестве прототипа способ получения гиалуроновой кислоты, в соответствии с которым сырье петушиные гребни экстрагируют водой с последующим выделением целевого продукта. К недостаткам этого способа можно отнести то обстоятельство, что получаемый по нему препарат не оказывает бактерицидного действия, что сужает область его лечебного применения.

Изобретение решает задачу получения гиалуроновой кислоты, обладающей выраженной бактерицидной активностью.

Указанный результат достигается тем, что в способе получения гиалуроновой кислоты, включающем измельчение и экстракцию водой петушиных гребней и последующее выделение целевого продукта, экстракцию петушиных гребней водой проводят в три стадии при соотношении сырья и воды, равном 1:(4-6), в течение 2-4 ч, экстракты объединяют и обрабатывают трихлоруксусной кислотой в количестве 1-2% от объема экстрактов, образующийся осадок обезжиривают и обезвоживают ацетоном и эфиром, растворяют в воде из расчета 2-4 объема к массе сырья, к 1 об. части раствора прибавляют 0,2-0,4 об. части экстракта чая, полученного настаиванием 1 мас. ч. высушенного чайного листа с 80-100 об. частями воды при 95-100^oC в течение 5-10 мин, с последующим выдерживанием смеси при 40-60^oC в течение 1-2 ч, после чего смесь фильтруют и фильтрат высушивают.

Добавление к раствору гиалуроновой кислоты, являющейся, с химической точки зрения, полисахаридом молекулярной массы 2-4 млн Дальтон, экстракта чая, содержащего полифенолы, не вызывает каких-либо органолептических изменений, но приводит к образованию соединения гиалуроновой кислоты с указанными полифенолами, о чем свидетельствует изменение спектральных и хроматографических характеристик продукта по сравнению с исходными компонентами.

Важно подчеркнуть, что получаемый целевой продукт обладает выраженной бактерицидной активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. При этом лучшие результаты достигаются при смешивании 1 об. ч. раствора ГК с 0,2-0,4 об. ч. экстракта чая, с последующим выдерживанием смеси при 40-60^oC в течение 1-2 ч и отделением образующегося незначительного осадка балластных веществ фильтрацией. При добавлении к 1 об. ч. раствора ГК менее 0,2 об. ч. экстракта чая, выдерживании смеси при температуре ниже 40^oC в течение менее 1 ч комплексное соединение не образуется и незначительный бактерицидный эффект целевого продукта в этом случае проявляется только лишь за счет полифенолов чая. При добавлении к 1 об. ч. раствора ГК более 0,4 об. ч. экстракта чая полифенолы чая присутствуют в избыточном количестве и полностью не связываются с молекулой гиалуроновой кислоты. Ни выдерживание смеси более 2 ч, ни повышение температуры более чем до 60^oC не приводит к дополнительному связыванию полифенолов чая с молекулой ГК.

Вместе с тем, предлагаемое объемное соотношение раствора ГК и экстракта чая (1: 0,2-0,4) обеспечивает образование продукта с синергическим бактерицидным действием, значительно превышающим эффект самих полифенолов чая (см. табл.).

Что касается приготовления экстракта чая, то использованные параметры экстракции (1 мас. ч. высушенного чайного листа и 80-100 об. ч. воды при 95-100^oC в течение 5-10 мин) заимствованы нами из общепринятой технологии чайного производства (см. В. В. Похлебкин. "Чай, его типы, свойства, употребление". М. 1981. 120 стр.) и являются оптимальными с точки зрения извлечения полифенольных компонентов чая.

Изобретение поясняется следующими примерами его осуществления.

Пример 1. 1 кг отпрепарированных и измельченных на мясорубке петушиных гребней заливают 4 л воды (соотношение сырья и воды 1: 4) и экстрагируют при 20^oC в течение 2 ч. Смесь фильтруют через марлю, остаток сырья экстрагируют еще дважды по 4 л воды в течение 2 ч, полученные экстракты соединяют и к 10 л объединенных экстрактов добавляют 100 г трихлоруксусной кислоты (1% к объему экстракта), смесь выдерживают при 20^oC в течение 1 ч, поднявшийся на поверхность водного слоя осадок отделяют на марле от выпавшего осадка белков, затем промывают (3х2 л) ацетоном и (3х2 л) эфиром для обезвоживания и обезжиривания и растворяют в 2 л воды (2 объема к массе сырья), после чего раствор фильтруют.

Отдельно заливают 10 г высушенного чайного листа (Использовали черный байховый чай по ГОСТ 1940-92) 800 мл (80 объемов) воды, нагретой до 95^oC, выдерживают при этой температуре в течение 5 мин в закрытой эмалированной емкости и затем фильтруют через ватно-марлевый фильтр. К 2 л раствора гиалуроновой кислоты добавляют 400 мл экстракта чая (соотношение 1: 0,2), смесь выдерживают при 40^oC в течение 1 ч, затем фильтруют, фильтрат сушат сублимацией и получают 51,8 г порошка светло-бежевого цвета со специфическим запахом, обладающего высокой бактерицидной активностью.

Пример 2. 1 кг отпрепарированных и измельченных на мясорубке петушиных гребней заливают 5 л воды (соотношение 1:5) и экстрагируют при 20^oC в течение 3 ч. Смесь фильтруют через марлю, остаток сырья экстрагируют еще дважды по 5 л воды в течение 3 ч, экстракты соединяют и к 12,5 л экстракта добавляют 187,5 г трихлоруксусной кислоты (1,5% к объему экстракта), смесь выдерживают при 20^oC в течение 1,5 ч, поднявшийся на поверхность водного слоя осадок отделяют на марле, промывают ацетоном и эфиром и растворяют в 3 л воды (3 объема к массе сырья), после чего раствор фильтруют.

Отдельно заливают 15 г высушенного чайного листа 1350 мл (90 объемов) воды, нагретой до 97^oC, выдерживают при этой температуре в течение 7,5 мин в закрытой эмалированной емкости и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. К 3 л раствора гиалуроновой кислоты добавляют 900 мл экстракта чая (соотношение 1: 0,3), выдерживают при 50^oC в течение 1,5 ч, затем фильтруют, фильтрат сушат сублимацией и получают 52,1 г порошка светло-бежевого цвета со специфическим запахом и высокой бактерицидной активностью.

Пример 3. 1 кг измельченных петушиных гребней заливают 6 л воды (соотношение 1: 6) и экстрагируют при 20^oC в течение 4 ч, фильтруют через марлю, остаток сырья экстрагируют еще дважды по 6 л в течение 4 ч, экстракты соединяют и к 15 л экстракта добавляют 300 г трихлоруксусной кислоты (2% к объему экстракта), смесь выдерживают при 20^oC в течение 2 ч, поднявшийся на поверхность осадок отделяют на марле, промывают ацетоном и эфиром и растворяют в 4 л воды (4 объема к массе сырья), после чего раствор фильтруют.

Отдельно заливают 20 г чайного листа 2 л воды (100 объемов), нагретой до 100^oC, выдерживают при этой температуре 10 мин, фильтруют. К 4 л раствора гиалуроновой кислоты добавляют 1,6 л экстракта чая (соотношение 1:0,4), выдерживают при 60^oC 2 ч, фильтруют, фильтрат сушат сублимацией и получают 52,3 г порошка светло-бежевого цвета со специфическим запахом и высокой бактерицидной активностью.

Использование: в медицине для лечения заболеваний, вызываемых различными микроорганизмами. Способ получения алуроновой кислоты, обладающей бактерицидной активностью, заключающийся в измельчении и экстракции водой петушиных гребней с последующим выделением целевого продукта, причем экстракцию петушиных гребней водой проводят в три стадии при соотношении сырья и воды 1:(4-6) в течение 2-4 ч, экстракты объединяют и обрабатывают трихлоруксусной кислотой в количестве 1-2% от объема экстракта, обезжиривают и обезвоживают образующийся осадок ацетоном и эфиром, растворяют в воде из расчета 2-4 объема к массе сырья, к 1 об. ч. раствора добавляют 0,2-0,4 об. ч. экстракта чая, получаемого настаиванием 1 мас. ч. высушенного чайного листа с 80-100 об. ч. воды при 95-100^oC в течение 5-10 мин, с последующим выдерживанием смеси при 40-60^oC в течение 1-2 ч и фильтрацией, и высушивают раствор.1 табл.

Способ получения гиалуроновой кислоты, обладающей бактерицидной активностью, заключающийся в измельчении и экстракции водой петушиных гребней с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что экстракцию петушиных гребней водой проводят в три стадии при соотношении сырья и воды 1 4 6 в течение 2-4 ч, экстракты объединяют и обрабатывают трихлоруксусной кислотой в количестве 1 2% от объема экстракта, обезжиривают и обезвоживают образующийся осадок ацетоном и эфиром, растворяют в воде из расчета 2 4 объема к массе сырья, к 1 об.ч. раствора добавляют 0,2 0,4 об.ч. экстракта чая, получаемого настаиванием 1 мас.ч. высушенного чайного листа с 80 100 об.ч. воды при 95 100^oС в течение 5 10 мин с последующим выдерживанием смеси при 40 60 ^oС в течение 1 2 ч и фильтрацией, и высушивают раствор.