СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 1997 года по МПК C08B37/08 

Изобретение относится к химии природных соединений, конкретно к способу получения гиалуроновой кислоты (ГК) высокомолекулярного природного мукополисахарида, используемого в медицине и косметике в качестве стимулятора обменных процессов, пролонгатора действия различных лекарственных средств, а также в качестве субстрата при количественном определении фрагмента гиалуронидазного действия (1).

Известны способы получения ГК из животного сырья, основанные на экстракции, ферментативном гидролизе, фракционировании различными растворителями, очистке на сорбентах и т. п. (2 6).

Недостатками известных способов являются низкий выход ГК и присутствие в ней белков и других примесей, которые могут вызывать аллергические реакции у больных при парентеральном введении, а также при использовании в офтальмологии. Поэтому такие препараты ГК не находят применения в медицине и используются лишь как химические реактивы.

Наиболее близким к заявленному является способ получения ГК (7), принятый за прототип, согласно которому сырье гребни петухов и кур обескровливают, измельчают многократно отмывают этанолом, содержащим хлороформом, дважды экстрагируют водой, экстракты подвергают депротеинизации путем многократной обработки хлороформом, ГК осаждают этанолом, переосаждают из этанола и ацетона и сушат (фиг. 1). Получаемый препарат под названием "Нyalon" используется в медицине, преимущественно в офтальмологии в качестве вископротектора.

Недостатки известного способа заключаются в том, что этот препарат ГК (выход около 0,08% к массе сырья) не является ультрачистым и содержит до 0,5% белковых веществ, в том числе до 0,2% овальбумина, обладающего антигенными свойствами и представляющего реальную угрозу сенсибилизации больных, поскольку этот белок может проникать через кожу и слизистые оболочки, минуя иммунный надзор (8).

Изобретение решает задачу получения ультрачистой ГК, практически не содержащей примесей белка, в том числе, овальбумина.

Указанный результат достигается тем, что в способе получения ультрачистой гиалуроновой кислоты, включающем обескровливание и измельчение сырья гребней петухов и кур, многократную промывку измельченного сырья 96%-ным спиртом, содержащим 1 мас. хлороформа, экстракцию промытого и измельченного сырья водой, депротеинизацию профильтрованного экстракта, фильтрацию и сушку целевого продукта, экстракцию промытого и измельченного сырья проводят 3 3,5 объемами воды, подкисленной до рН 3 4 при 90 100^oC в течение 40 60 мин, депротеинизацию отфильтрованного экстракта осуществляют обработкой при 60 80^oC в течение 1 2 ч, сначала активированным углем, а затем диэтиламиноэтилцеллюлозой, используемыми в количестве 1,0 1,5% от объема экстракта, а фильтрацию осуществляют последовательно пропусканием депротеинизированного экстракта при 30 40^oС через бумажные фильтры, фильтры из боросиликатного стекла, стерильные ацетилцеллюлозные и поливинилхлоридные мембраны (фиг. 2).

При этом содержание белков в ГК (выход 0,09 0,12%) составляют менее 0,1% в том числе, овальбумина менее 0,001% (содержание общего белка в препарате ГК определяли классическим методом Кьельдаля, а содержание овальбумина с помощью твердофазной иммуноферментной тест-системы, имеющей чувствительность 0,5 нг/мл(9)), а величина относительной вязкости 0,1%-ного водного раствора ГК при 20^oC составляет 12 14, что свидетельствует о ее высокой молекулярной массе.

Предлагаемые стадии и параметры технологического процесса получения ГК являются логически обоснованными.

Сохранив используемые в прототипе условия обескровливания и измельчения гребней птиц, а также многократную промывку сырья этанолом, содержащим в качестве консерванта 1% хлороформа, поскольку это приводит к максимально высокому удалению остатков крови и ферментов, расщепляющих молекулу ГК, нами были изменены условия экстракции и последующей очистки ГК. Использование 3 - 3,5 объемов воды, подкисленной до рН 3 4 и проведение процесса экстракции при 90 100^oC в течение 40 60 мин позволяет добиваться максимального извлечения ГК из сырья. Уменьшение количества экстрагента (менее 3 объемов), изменение рН среды (ниже 3,0 или выше 4,0), снижение температуры (ниже 90^oC) или длительности экстракции (менее 40 мин) приводит к снижению содержания ГК в экстракте, а увеличение количества экстрагента (более 3,5 объемов) и длительности экстракции (более 60 мин) не приводит к дополнительному извлечению ГК и потому является технологически не обоснованным.

На фиг. 1 изображена схема технологического процесса получения гиалуроновой кислоты по известному способу; на фиг. 2 схема технологического процесса получения ГК по предлагаемому способу.

Процесс депротеинизации ГК в известном способе осуществляется многократным промыванием водного экстракта хлороформом. Однако этот процесс является длительным, экологически опасным и не приводит к полному удалению боковых веществ. В заявляемом способе с этой целью предусматривается обработка экстракта двумя сорбентами сначала активированным углем (препарат СССР), а затем ДОАЭ-Ц (фирма "Сигма", США с емкостью 0,9 мэкв/г), оптимальные количества которых составляют 1 1,5% от объема экстракта, время сорбции составляет 1 2 ч. При этом максимальное количество белков сорбируется при условии нагревания экстракта на 60 80^oC.

Можно отметить, что сорбция носит избирательный характер и касается только белковых веществ, а ГК остается в экстракте, что было подтверждено ранее проводимыми исследованиями (10).

Вместе с тем, после депротеинизации экстракта, в нем сохраняется еще достаточно высокое содержание белков (0,8 1,4%). Поэтому в заявленном способе предусматривается дополнительная очистка ГК путем последовательной фильтрации экстракта сначала через бумагу, а затем через фильтры из боросиликатного стекла, ацетилцеллюлозные и поливинилхлоридные мембраны под давлением 0,5 0,7 атм, которое создается при помощи перистальтического насоса "Мастерфлекс". При этом процесс экстракции осуществляют при температуре экстракта 30 40^oC, поскольку при более низких температурах растворы быстро загустевают и не проходят через мембраны, а более высокие температуры приводят к необоснованному увеличению затрат на электроэнергию.

Выбор указанных мембран основан на результатах проведенного экспериментального изучения и жесткого скрининга, при котором были исключены как малоэффективные отечественные полисульфонамидные мембраны, импортные мембраны на основе полисульфида, фильтрокартон и др.

Для достижения стерильности выбранных мембран их обрабатывали 5%-ным раствором формальдегида в течение 24 48 ч и затем отмывали стерильной дистиллированной водой до отрицательной пробы на формальдегид по реакции с фуксин сернистой кислотой.

Полученные растворы ультрачистой ГК, представляющие собой прозрачную бесцветную жидкость со слабым специфическим запахом сушили лиофилизацией в асептических условиях. Выход порошка составлял 0,09 0,12% к массе сырья.

Изобретение поясняется следующими примерами его осуществления
Пример 1.

Петухов и кур в возрасте от 6 месяцев до 1 года с крупными мясистыми гребнями полностью обескровливают путем вскрытия сонной артерии, гребни срезают у основания черепа, промывают холодной, а затем горячей водой, концы гребней, пропитанные кровью, срезают и отбрасывают. 1 кг отпрепарированных гребней измельчают дважды на мясорубке, фарш промывают 3 4 раза 2 объемами 96% -ного этанола, содержащего 1% хлороформа, до получения бесцветного спиртового раствора, затем фарш экстрагируют 3 л (3 объема) воды, подкисленной 1 М уксусной кислотой до рН 3,0. при 90^oC в течение 40 мин, экстракт отделяют от сырья фильтрацией через вату, в 2,5 л фильтрата добавляют 25 г активированного угля (1% от объема экстракта), смесь нагревают при 60^oC 1 ч, затем фильтруют через бумажные фильтры, к фильтрату добавляют 25 г ДЭАЭ-Ц (1% от объема экстракта), нагревают при 60^oC 1 ч, фильтруют через бумажные фильтры, раствор последовательно пропускают при 30^oC через фильтр из боросиликатного стекла фирмы "Millipore" (США), стерильные ацетилцеллюлозные мембраны фирмы "Сарториус" (ФРГ) с диаметром 1,2 мкм и поливинилхлоридные мембраны (ТУ 6-06-И-142-86) с рабочей площадью 0,2 м² под давлением на выходе мембран 0,5 0,7 атм. Полученный раствор сушат сублимацией в асептических условиях и получают 0,9 г (выход 0,09%) порошка гиалуроновой кислоты, легко растворимого в воде, имеющего относительную вязкость 0,1%-ного раствора при 20^oC 12,0 и содержание белка менее 0,05% в том числе, овальбумина менее 0,001%
Пример 2.

1 кг отпрепарированных, измельченных и промытых этанолом, как указано в примере 1, гребней петухов и кур экстрагируют 3,25 л воды (3,25 объема), подкисленной 1 М уксусной кислотой до рН 3,5, при температуре 95^oC в течение 50 мин, экстракт отделяют от сырья фильтрацией через вату, к 3 л раствора добавляют 37,5 г (1,25%) активированного угля, смесь нагревают при 70^oC 1,5 ч, затем фильтруют через бумажные фильтры, к фильтрату добавляют 37,5 г ДЭАЭ-Ц (1,25% ), нагревают при 70^oC 1,5 ч, фильтруют через бумажные фильтры, экстракт последовательно пропускают при 35^oC через фильтр из боросиликатного стекла, стерильные ацетилцеллюлозные и поливинилхлоридные мембраны под давлением 0,5 0,7 атм. Полученный раствор сушат сублимацией в асептических условиях и получают 1,0 г порошка ГК (выход 0,1%), легко растворимого в воде, имеющего относительную вязкость 0,1%-ного раствора при 20^oC 13,0 и содержание белка менее 0,05% в том числе, овальбумина менее 0,001%
Пример 3.

1 кг отпрепаринрованных, измельченных и промытых этанолом, как указано в примере 1, гребней петухов и кур экстрагируют 3,5 л воды (3,5 объема), подкисленной 1 М уксусной кислотой до pH 4, при 100^oC в течение 1 ч, экстракт отфильтровывают через вату, к 3,2 л фильтрата добавляют 49,7 г (1,5%) активированного угля, смесь нагревают при 80^oC 2 ч, затем фильтруют через бумажные фильтры, к фильтрату добавляют 49,7 г ДЭАЭ-Ц (1,5%), нагревают при 80^oC 2 ч фильтруют через бумажные фильтры, фильтрат последовательно пропускают при 35^oC через фильтр из боросиликатного стекла, стерильные ацетилцеллюлозные и поливинилхлоридные мембраны под давлением 0,5-0,7 атм. Полученный раствор сушат сублимацией в асептических условиях и получают 1,2 г порошка ГК (выход 0,12%), легко растворимого в воде, имеющего относительную вязкость 0,1%-ного раствора при 20^oC 14 и содержание белка менее 0,05% в том числе, овальбумина менее 0,001%
Сопоставительный анализ технико-экономических показателей заявляемого объекта и известного способа приведен в таблице.

Т. е. заявляемый способ позволят получать ультрачистую ГК, практически свободную от белковых веществ.

Использование: получение ультрачистой гиалуроновой кислоты. Сущность изобретения: обескровливание и измельчение сырья - гребней петухов и кур, многократная промывка измельченного сырья этанолом, содержащим 1 мас.% хлороформа, экстракцию промытого и измельченного сырья 3 - 3,5 объемами воды, подкисленной рН 3 - 4 при 90 - 100^oC в течение 40 - 60 мин, депротеинизацию профилированного экстракта обработкой при 60 - 80^oC в течение 1 - 2 ч, сначала активированным углем, а затем диэтиламино-этилцеллюлозой, используемыми в количестве 1,0 - 1,5% от объема экстракта, с последующей фильтрацией последовательным пропусканием депротеинизированного экстракта при 30 - 40^oC через бумажные фильтры из боросиликатного стекла, стерильные ацетилцеллюлозные и поливинилхлоридные мембраны. 2 ил., 1 табл.

Способ получения гиалуроновой кислоты, включающий обескровливание и измельчение сырья гребней петухов и кур, многократную промывку измельченного сырья этанолом, содержащим 1 мас. хлороформа, экстракцию промытого и измельченного сырья водой, депротеинизацию профильтрованного экстракта, фильтрацию и сушку целевого продукта, отличающийся тем, что экстракцию промытого и измельченного сырья проводят 3 3,5 объемами воды, подкисленной до pH 3 4, при 90 100^oC в течение 40 50 мин, депротеинизацию профильтрованного экстракта осуществляют обработкой при 60 80^oC в течение 1 2 ч сначала активированным углем, а затем диэтиламиноэтилцеллюлозой, используемыми в количестве 1,0 1,5% от объема экстракта, а фильтрацию осуществляют последовательно пропусканием депротеинизированного экстракта при 30 40^oC через бумажные фильтры, фильтры из боросиликатного стекла, стерильные ацетилцеллюлозные и поливинилхлоридные мембраны.