СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ДИСБАКТЕРИОЗА КИШЕЧНИКА Российский патент 1996 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к области медицины и может найти применение в медицинской практике для ускоренной диагностики дисбактериоза кишечника.

Известен ряд способов диагностики дисбактериоза кишечника. Бактериологический количественно-качественный метод Хенеля, применяющийся в различных модификациях, широко распространен и дает хорошие результаты, однако он трудоемкий и длительный по времени, что заставляет разрабатывать косвенные методики, упрощающие исследование материала.

Известен косвенный метод выявления дисбактериоза кишечника при помощи определения антагонистической активности микрофлоры путем нанесения перпендикулярных штрихов индикаторных микроорганизмов. Этот метод хотя и сокращает в 2 раза время получения результата, но дает ответ только на четвертые сутки после посева материала.

Известен косвенный метод определения дисбактериоза кишечника по повышению уровня кишечных ферментов энтерокиназы и щелочной фосфатазы, определяемых на фотоэлектроколориметре. Метод прост, доступен для практических лабораторий, но не дает представления о степени выраженности дисбактериоза и не может быть использован для диагностики дисбактериоза у детей первого года жизни вследствие незрелости у них ферментных систем. Кроме того, совпадение результатов определения указанных ферментов при дисбактериозе отмечается для энтерокиназы в 60% случаев, а для щелочной фосфатазы только в 35%
Предложен экспериментальный способ косвенной (биохимической) диагностики дисбактериоза путем определения летучих фенолов мочи при помощи газожидкостной хроматографии, также не дающий представления о степени выраженности изменений микрофлоры.

Наиболее точным является косвенный способ экспресс-диагностики дисбактериоза путем обнаружения циклических дипептидов бета-аспартил-глицина, лактозолизина и фруктозо-лизина (БАГ, ЛЛ, ФЛ) в фекалиях методом высоковольтного электрофореза на бумаге. Однако для выполнения указанного метода необходима сложная, дорогостоящая аппаратура и импортные реактивы, приобретаемые за валюту, и, кроме того, метод разработан для гнотобионтных мышей, тогда как данные по определению БАГ, ЛЛ и ФЛ у людей, в том числе у детей раннего возраста, отсутствуют.

Наиболее широко распространен бактериологический количественно-качественный метод Хенеля путем дозированного посева десятикратных разведений фекалий на различные питательные среды, применяемый в различных модификациях. Давая наиболее точную характеристику состояния микрофлоры кишечника, этот способ является наиболее трудоемким, требует много питательных сред и посуды и довольно продолжителен по времени ответ выдается на седьмые сутки.

Целью изобретения является упрощение методики и сокращение сроков диагностики дисбактериоза кишечника.

Это достигается тем, что определяют бета-литическую активность копрофильтратов фотонефелометрическим методом и по уровню с 5,1 до 10,0% диагностируют первую степень, с 10,1 до 17,0% вторую степень, с 17,1 до 30,0% третью и свыше 30,0% четвертую степень дисбактериоза кишечника.

Способ осуществляется следующим образом: 1 г фекалий растирают в ступке с небольшим количеством кварцевого песка и 9,0 мл стерильного физиологического раствора. Затем экстрагируют на холоде в течение 1 часа, надсадочную жидкость центрифугируют при 8 тыс. об/мин 30 мин.

C целью полного выявления бета-литической активности оптимальное время экстракции и центрифугирования подобрано экспериментально Дальнейшее исследование проводят ускоренным фотонефелометрическим методом.

Для этого из 18 20-часовой агаровой культуры сенной палочки (штамм 83 ГКИ им. Тарасевича) готовят микробную взвесь в 0,75 М растворе сахарозы с pН 6,2. Густота взвеси должна соответствовать оптической плоскости 0,500 (зеленый светофильтр, кювета 3 мм) на ФЭК-М.

Затем смешивают 0,4 мл взвеси сенной палочки и 0,2 мл копрофильтрата, инкубируют при 37^oC в течение двух часов, добавляют 0,6 мл 0,75 М сахарозы и определяют оптическую плотность на ФЭК-М (0).

Исходную оптическую плотность замеряют в следующей смеси:
0,4 мл взвеси сенной палочки,
0,2 мл копрофильтрата,
0,6 мл раствора сахарозы
без инкубирования в термостате.

Расчет бета-литической активности проводят по формуле:

где К (контроль) исходная оптическая плотность образца,
О (опыт) оптическая плотность опытной пробы после инкубации в термостате.

Пример расчета бета-литической активности:
При нефелометрии опытного образца получен результат 0,200 (О), тогда как исходная оптическая плотность составляет 0,200 (К).

При сопоставлении уровня бета-литической активности и состояния микрофлоры кишечника у детей старше 3 месяцев и взрослых установлено, что нормоценозу соответствует лизиса от 0 до 5,0, при первой степени дисбактериоза лизиса составляет от 5,1 до 10,0, при второй степени от 10,1 до 17,0% при третьей от 17,1 до 30,0% и свыше 30,0% диагностируется четвертая степень дисбактериоза кишечника.

Учитывая, что у детей первых 3 месяцев жизни эти показатели не коррелируют с показателями состояния микрофлоры кишечника, нами проведено дополнительное параллельное исследование двумя методами (бактериологическим и ускоренным биохимическим) 235 проб фекалий от детей первых 3 месяцев жизни, в результате которого установлено, что в данной возрастной группе уровень бета-литической активности составляет при дисбактериозе первой степени 17,1 - 30,0% при дисбактериозе второй степени 30,1 44,0% при дисбактериозе третьей степени 44,1 60,0% и при дисбактериозе четвертой степени свыше 60,0%
Примеры
Пример 1. Ребенок Л. 3 г. Взят в группу контроля. Педиатром определен как здоровый. Жалоб со стороны желудочно-кишечного тракта не предъявляет.

Анализ 807.

Уровень бета-литической активности 5,12%
Состояние микрофлоры кишечника, определенное количественно-качественным методом, дисбактериоз первой степени. Дисбактериоз компенсированный, клинических проявлений нет.

Ребенок С. 9 мес. За два месяца до обследования перенес кишечную инфекцию неясной этиологии. К моменту обследования никаких жалоб не предъявляет. Педиатром определен как здоровый.

Анализ 762. Уровень бета-литической активности 9,8%
Состояние микрофлоры кишечника дисбактериоз первой степени. Дисбактериоз компенсированный, клинических проявлений нет.

Ребенок Ч. 1 мес. Взят в группу контроля. Педиатром определен как здоровый. Клинических проявлений и жалоб со стороны желудочно-кишечного тракта не отмечается.

Анализ 395.

Уровень бета-литической активности 17,2%
Состояние микрофлоры кишечника дисбактериоз первой степени.

Пример 2.

Ребенок К. 4,5 мес. Находится на раннем смешанном вскармливании. Стул неустойчивый, склонность к поносам. Анализы на патогенную микрофлору отрицательные. Предположительный диагноз педиатра дисбактериоз кишечника.

Анализ 893.

Уровень бета-литической активности 10,25%
Состояние микрофлоры кишечника дисбактериоз второй степени.

Ребенок Ч. 5 лет. Перенес ОРЗ, лечился антибиотиками. Жалобы на неустойчивый стул в течение двух месяцев. Предположительный диагноз педиатра - дисбактериоз кишечника.

Анализ 1163.

Уровень бета-литической активности 16,98%
Состояние микрофлоры кишечника дисбактериоз второй степени.

Ребенок С. 2,5 мес. На искусственном вскармливании с двух недель. Жалобы на неустойчивый стул.

Анализ 396.

Уровень бета-литической активности 30,9%
Состояние микрофлоры кишечника дисбактериоз второй степени.

Ребенок Б. 1 мес. У мамы токсикоз второй половины беременности, осложненные роды. Девочка на грудном вскармливании, стул неустойчив с рождения.

Анализ 14.

Уровень бета-литической активности 44,0%
Состояние микрофлоры кишечника дисбактериоз второй степени.

Пример 3.

Ребенок М. 6,5 лет. В течение нескольких лет наблюдается по поводу дисбактериоза кишечника. Жалобы на постоянно неустойчивый стул, метеоризм, урчание в животе, плохой аппетит, сниженный вес.

Анализ 1359.

Уровень бета-литической активности 17,11%
Состояние микрофлоры кишечника дисбактериоз третьей степени.

Ребенок А. 2 года. Перенес пневмонию, осложненную сепсисом. Неоднократно принимал антибиотики. В течение шести месяцев отмечается склонность к поносам, метеоризм, боли и урчание в животе, плохой аппетит.

Анализ 1136.

Уровень бета-литической активности 29,5%
Состояние микрофлоры кишечника дисбактериоз третьей степени.

Ребенок Ш. 28 дней. Стул неустойчивый, частые срыгивания, девочка очень беспокойная. На грудном вскармливании.

Анализ 1.

Уровень бета-литической активности 44,2%
Состояние микрофлоры кишечника дисбактериоз третьей степени.

Ребенок Н. 2 мес. 20 дней. Плохо набирает вес. Стул со слов мамы нормальный, 4 раза в сутки.

Анализ 2429.

Уровень бета-литической активности 59,8%
Состояние микрофлоры кишечника дисбактериоз третьей степени.

Пример 4.

Ребенок Е. 4 мес. На искусственном вскармливании с первых дней жизни, биопрепараты не получала. Жалобы на низкий вес, частые поносы, беспокойный сон. Предположительный диагноз педиатра дисбактериоз кишечника.

Анализ 1173.

Уровень бета-литической активности 30,9%
Состояние микрофлоры кишечника дисбактериоз четвертой степени.

Ребенок И. 6 лет. Перенес острый нефрит, получил массивную антибиотикотерапию. В течение трех месяцев после лечения отмечает неустойчивый стул, боли и урчание в животе, метеоризм, плохой аппетит. Направлен педиатром на исследование микрофлоры кишечника для подтверждения диагноза "дисбактериоз кишечника".

Анализ 1146.

Уровень бета-литической активности 76,2%
Состояние микрофлоры кишечника дисбактериоз четвертой степени.

Ребенок М. 1,5 мес. С рождения неустойчивый стул, плохо набирает в весе, беспокоен, выраженный диатез.

Анализ 2493.

Уровень бета-литической активности 60,14%
Состояние микрофлоры кишечника дисбактериоз четвертой степени.

Ребенок Г. 3 мес. На искусственном вскармливании с одного месяца. Выраженный диатез. Стул неустойчивый. Биопрепараты не получал.

Анализ 2492.

Уровень бета-литической активности 72,0%
Состояние микрофлоры кишечника дисбактериоз четвертой степени.

Предлагаемым способом было обследовано всего 433 человека, из них 235 детей первых трех месяцев жизни, 136 детей с трех месяцев до 7 лет (95 с дисбактериозом и 41 здоровый ребенок) и 62 взрослых.

Предлагаемый способ по сравнению с известными значительно упрощает методику исследования и сокращает срок выполнения в 2 3 раза по сравнению с косвенным методом определения антагонистической активности и в 10 12 раз по сравнению с методом Хенеля.

Способ диагностики дисбактериоза кишечника. Изобретение относится к области медицины и может найти применение в медицинской практике для ускоренной диагностики дисбактериоза кишечника. Указанная цель достигается тем, что определяют бета-литическую активность в копрофильтратах фотонефелометрическим методом у взрослых и детей старше трех месяцев жизни и по уровню активности с 5,1 до 10,0% диагностируют первую степень, с 10,1 до 17,0% - вторую, с 17,1 до 30,0% - третью и свыше 30,0% - четвертую степень дисбактериоза кишечника, причем у детей первых трех месяцев жизни диагностируют дисбактериоз по уровню бета-литической активности первую степень с 17,1 до 30,0%, вторую степень с 30,1 до 44,0%, третью с 44,1 по 60,0% и четвертую - свыше 60,0%.

Способ диагностики дисбактериоза кишечника, включающий анализ копрофильтрата, отличающийся тем, что определяют беталитическую активность копрофильтрата, приготовленного из фекалиев взрослых людей, детей до и старше трехмесячного возраста и при значениях этого показателя у взрослых и детей старше трехмесячного возраста 5,1 10,0% 10,1 17,0% 17,1 30,0% и выше 30% диагностируют дисбактериоз кишечника первой, второй, третьей и четвертой степеней соответственно, а при значениях этого показателя у детей первых трех месяцев жизни 17,1 30,0% 30,1 44,0% 44,1 60,0% и свыше 60% диагностируют соответственно дисбактериоз первой, второй, третьей и четвертой степеней.