СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СТЕПЕНИ ВЫРАЖЕННОСТИ ДИСБАКТЕРИОЗА КИШЕЧНИКА Российский патент 2008 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, а именно к дифференциальной диагностике степени выраженности дисбактериоза кишечника у людей.

Диагностика дисбактериозов кишечника, которые, по данным РАМН, регистрируются у 85-90% россиян трудоспособного возраста, является актуальной проблемой последних десятилетий.

Классический бактериологический качественно-количественный метод диагностики дисбиозов кишечника требует значительных материальных и трудовых затрат, продолжителен по времени и регистрирует изменения со стороны собственной микрофлоры кишечника человека. При этом даже комплексное изучение состава микрофлоры и ее свойств дает лишь косвенные свидетельства изменения иммунного статуса в целом и не отражает иммунного ответа организма на местном уровне.

Существует способ диагностики дисбактериоза кишечника, заключающийся в том, что определяют бета-литическую активность копрофильтрата, приготовленного из фекалий, и по полученным значениям диагностируют дисбактериоз первой, второй, третьей или четвертой степеней (RU 2069001, опубл. 10.111.1996). Указанный способ, выбранный в качестве прототипа, отражает общую воспалительную реакцию организма в кишечнике, сопровождающую дисбактериоз, но не дает оценки местному иммунитету, что важно для проведения адекватной индивидуальной коррекции этого состояния (Бондаренко В.М., Грачева Н.М., Мацулевич Т.В. «Дисбактериозы кишечника у взрослых», М., 2003, с.105).

Целью изобретения является ускорение диагностики степеней выраженности дисбактериозов кишечника у людей и проведение оценки местного антиэндотоксического иммунитета с использованием определения содержания антител к ЛПС грамотрицательных энтеробактерий в копрофильтратах, которое коррелирует с количественно-качественными изменениями состава микрофлоры кишечника, в частности, с увеличением содержания условно-патогенных энтеробактерий.

Цель достигается путем использования диагностической иммуно-ферментной тест-системы, предназначенной для определения антител к ЛПС K.pneumoniae 211 в сывороточном сырье. В основу работы ИФА-тест-системы положен неконкурентный гетерогенный метод иммуноферментного анализа. К иммобилизованному ЛПС добавляли исследуемые копрофильтраты и после инкубации и удаления несвязавшихся компонентов проводили выявление специфических иммунокомплексов с помощью меченных ферментом пероксидазой хрена антивидовых Ат (против IgA, IgG, IgM, IgE человека производства НИИ ЭМ им. Н.Ф.Габричевского). Индикаторная система в ИФА антител к ЛПС грамотрицательных энтеробактерий состояла из Н₂О₂ и ортофенилендиамина. Результаты регистрировали на приборе "Multiskan" (Labsystem) λ= 492. Для постановки ИФА использовали полистироловые микропланшеты «Linbro»(США). По титрам антиэндотоксических антител в копрофильтратах, относящихся к IgA и IgG, находящихся в пределах 1:100-1:150, диагностировали дисбактериоз I степени, по титрам IgA, IgG и IgE - 1:200-1:400 диагностировали дисбактериоз II степени, а по титрам IgA, IgG, IgE и IgM - свыше 1:400 диагностировали дисбактериоз III степени.

Паралелльно проводили исследование фекалий людей для определения степени выраженности дисбиозов кишечника с использованием метода качественно-количественного изучения состава микрофлоры с использованием дифференциально-диагностических питательных сред. Степени дисбиотических изменений определяли согласно ОСТ 91500.11.0004-2003 (приложение) «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» (М., 2003. Приказ от 9 июня 2003 г., №231):

I степень дисбактериоза: снижение количества бифидобактерий, лактобактерий или тех и других вместе на 1-2 порядка. Возможно снижение (менее 10⁶ КОЕ/г фекалий) или повышение содержания кишечных палочек (более 10⁸ КОЕ/г) с появлением небольших титров измененных их форм (не более 15%);

II степень дисбактериоза: наличие одного вида условнопатогенных микроорганизмов в концентрации не выше 10⁴ КОЕ/г или обнаружении ассоциаций условнопатогенных бактерий в небольших титрах (10³-10⁴ КОЕ/г). Лактозоотрицательные кишечные палочки или кишечные палочки с измененными ферментативными свойствами (снижение лактазной активности) обнаруживаются в титрах более 10⁴ КОЕ/г;

III степень дисбактериоза: выявление условнопатогенных микроорганизмов в высоких титрах как одного вида, так и в ассоциациях.

Ход исследования с использованием ИФА тест-системы по определению антител (различных классов иммуноглобулинов) к липополи-сахариду грамотрицательных энтеробактерий в копрофильтратах.

1. Сенсибилизация микропланшетов (подготовительный этап). Сенсибилизирующую дозу антигена (ЛПС) 3-5мкг/мл, подобранную шахматным титрованием, растворяли в 0,05 М карбонат-бикарбонатном буферном растворе (КББР рН 9,4-9,6)-40,0 мл. При помощи пипеточного дозатора вносили по 0,2 мл раствора Аг в каждую лунку планшета. Проводили отмывку несвязавшихся компонентов, как описано выше.

2. Внесение проб копрофильтратов.

А. Подготовка проб копрофильтратов. Отвешивали 1г фекалий и помещали в гомогенизатор Потера, гомогенизацию проводили на холоде в физиологическом растворе в течение 5-10 минут. Полученный гомогенат сливали в колбочки и центрифугировали при 6000 об/мин, в течение 20 минут. Супернатант собирали и хранили в холодильной камере при -20°С. Б. Копрофильтрат в количестве 0,2 мл пробы вносили в каждую лунку планшета при помощи пипеточного дозатора. Инкубацию осуществляли при +37°С-1 ч. Отмывали несвязавшиеся компоненты, как описано выше.

3. Внесение конъюгата. Содержимое 1 ампулы коммерческого конъюгата, представляющего антивидовые антитела (против антител человека), меченные пероксидазой хрена, растворяли согласно инструкции, приложенной к данной серии, в 20,0 мл ФСБР и вносили по 0,2 мл в каждую лунку микропланшета. Инкубацию осуществляли при +37°С - 1 ч. Отмывали несвязавшийся конъюгат по общей схеме.

4. Внесение субстрата. К цитратному буферному раствору (ЦБР) в объеме 50мл добавляли ex temporae 0,15 мл 33% H₂O₂ - ЦБР представляет собой раствор 14,8 г Na₂HPO₄×12H₂О и 4,1 г лимонной кислоты на 1 л дистиллированной воды (рН 6,0). 10 мг ортофенилендиамина (ОФД) растворяли в 20,0 мл субстратного буфера. Субстрат вносили по 0,2 мл в каждую лунку. Проявление реакции длилось в течение 30 мин при + 20° С. Реакцию останавливали внесением 50 мкл H₂SO₄ (1 моль/л).

5. Учет реакции. Анализ результатов проводили визуально и при помощи "Multiskan" (Labsystem) - фотометрически. Результаты исследования представляли в виде графика, по ординате которого отложен регистрируемый в ИФА сигнал, а по абсциссе - титр исследуемого образца. С помощью ИФА возможно исследование в 1-2 разведениях. Параллельно проводили измерения контрольных образцов биологических проб (заведомо положительного и отрицательного). Затем на графике, построенном по выше описанной схеме, против точки на калибровочной кривой положительного контроля находили титр соответствующего образца биологической пробы на оси абсцисс. Согласно рекомендациям, исследуемый образец биологической пробы считали положительным при отношении параметров роста измерения для него (Р) и отрицательному контролю (N) больше или равному 2 - (P:N=2). Относительный уровень содержания Ат оценивали по приближению P:N к соответствующей величине контроля.

Использование ИФА тест-системы для определения анти-ЛПС антител разных классов иммуноглобулинов позволяет провести анализ местного антитоксического иммунитета в копрофильтратах людей с разными степенями дисбактериозов кишечника. Исследование проводится в течение рабочего дня и позволяет проводить своевременную индивидуальную коррекцию.

Пример 1. Использование ИФА тест-системы для определения иммуноглобулинов разных классов в копрофильтратах практически здоровых людей.

ИФА тест-система для определения анти-ЛПС антител была использована для обнаружения иммуноглобулинов разных классов в копрофильтратах практически здоровых людей. Данные представлены в таблице 1. Как показано в таблице 1, общее содержание иммуноглобулинов разных классов у практически здоровых людей колебалось в пределах 12-23,5% положительных проб. Положительные пробы с анти-ЛПС антителами в копрофильтратах не превышали 3,5% (IgG). Положительные пробы, содержащие анти-ЛПС антитела, относящиеся к другим классам иммуноглобулинов, составляли 0,6-1,2%. Данные таблицы 1 свидетельствуют о низком антиэндотоксиновом иммунитете на местном уровне у практически здоровых людей.

Пример 2. Использование ИФА тест-системы для определения иммуноглобулинов разных классов в копрофильтратах людей с дисбактериозами кишечника.

ИФА тест-система для определения анти-ЛПС антител была использована для обнаружения иммуноглобулинов разных классов в копрофильтратах людей с дисбактериозами кишечника. Данные представлены в таблице 2. Как показано в таблице 2, у людей с дисбактериозами кишечника в копрофильтратах отмечено увеличение общего содержания иммуноглобулинов разных классов, особенно IgA и IgE (96% и 98,7% соответственно). Процент положительных проб копрофильтратов, содержащих анти-ЛПС антитела, также увеличился: преобладали пробы с повышенным содержанием IgA и IgE (84,2% и 60,5% соответственно). Данные таблицы 2 свидетельствуют о значительном и достоверном повышении антиэндотоксинового иммунитета на местном уровне у людей с дисбактериозами кишечника.

Пример 3. Обнаружение иммуноглобулинов класса А, специфичных ЛПС грамотрицательных энтеробактерий, у людей с дисбактериозами кишечника разных степеней выраженности процесса.

Наличие анти-ЛПС антител, относящихся к иммуноглобулинам класса А в копрофильтратах людей с разными степенями выраженности дисбактериозов кишечника показано в таблице 3. Отмечено достоверное повышение содержания в копрофильтратах людей иммуноглобулинов класса А, специфичных ЛПС грамотрицательных энтеробактерий, в прямой корреляционной зависимости от степени выраженности дисбактериозов кишечника.

Пример 4. Обнаружение иммуноглобулинов класса G, специфичных ЛПС грамотрицательных энтеробактерий, у людей с дисбактериозами кишечника разных степеней выраженности процесса.

Наличие анти-ЛПС антител, относящихся к иммуноглобулинам класса G в копрофильтратах людей с разными степенями выраженности дисбактериозов кишечника показано в таблице 4. Отмечено достоверное повышение содержания в копрофильтратах людей иммуноглобулинов класса G, специфичных ЛПС грамотрицательных энтеробактерий, в прямой корреляционной зависимости от степени выраженности дисбактериозов кишечника.

Пример 5. Обнаружение иммуноглобулинов класса М, специфичных ЛПС грамотрицательных энтеробактерий, у людей с дисбактериозами кишечника разных степеней выраженности процесса.

Наличие анти-ЛПС антител, относящихся к иммуноглобулинам класса М, в копрофильтратах людей с разными степенями выраженности дисбактериозов кишечника показано в таблице 5. Отмечено достоверное повышение содержания в копрофильтратах людей иммуноглобулинов класса М, специфичных ЛПС грамотрицательных энтеробактерий, в прямой корреляционной зависимости от степени выраженности дисбактериозов кишечника.

Пример 6. Обнаружение иммуноглобулинов класса Е, специфичных ЛПС грамотрицательных энтеробактерий, у людей с дисбактериозами кишечника разных степеней выраженности процесса.

Наличие анти-ЛПС антител, относящихся к иммуноглобулинам класса Е, в копрофильтратах людей с разными степенями выраженности дисбактериозов кишечника показано в таблице 6. Отмечено достоверное повышение содержания в копрофильтратах людей иммуноглобулинов класса Е, специфичных ЛПС грамотрицательных энтеробактерий, в прямой корреляционной зависимости от степени выраженности дисбактериозов кишечника.

Пример 7. Обнаружение иммуноглобулинов разных классов, специфичных ЛПС грамотрицательных энтеробактерий, у людей с дисбактериозами кишечника разных степеней выраженности процесса.

Наличие комплексов анти-ЛПС антител, принадлежащих к разным классам иммуноглобулинов (IgA, IgG, IgM, IgE), в копрофильтратах людей с разными степенями выраженности процесса представлено в таблице 7.

Согласно данным таблицы, комплекс анти-ЛПС антител, состоящий из 4-х, одновременно выявляемых IgA, IgG, IgM, IgE в титрах свыше 1:400, наблюдался только при дисбактериозах 3 степени (Д III) в 88,4% случаев.

Комплекс анти-ЛПС антител, состоящий из 3-х, одновременно выявляемых IgA, IgG, IgE, в титрах свыше 1:200-1:400, при дисбактериозах 2 степени (Д II) наблюдался в 80,8% случаев и достоверно превышал частоту встречаемости при Д III (11,6%), однако при Д III титры всех выявленных классов иммуноглобулинов были выше 1:400.

Комплекс анти-ЛПС антител, состоящий из 2-х, одновременно выявляемых IgA, IgG, в титрах 1:150-1:200 наблюдался при дисбактериозах 1 степени (Д I) в 100% случаев и достоверно превышал частоту встречаемости при Д II (19,2%), однако при Д II титры всех выявленных классов иммуноглобулинов определялись в пределах 1:200-1:400. При этом комплекс, состоящий одновременно из 4-х или 3-х классов тестируемых иммуноглобулинов, при Д I не встречался вообще.

Таблица 1.
Количество положительных проб копрофильтратов практически здоровых людей на наличие иммуноглобулинов разных классов (171 человек)ПоказателиIgAIgGIgMIgEОбщее содержаниеАбс.40612621%23,5±3,2%35,7±3,6%15±2,7%12±2,4%Анти-ЛПС антителаАбс.2621%1,2±0,6%3,5±1,4%1,2±0,6%0,6±0,1%

Таблица 2.
Количество положительных проб копрофильтратов людей с
дисбактериозами кишечника на наличие иммуноглобулинов разных
классов (187человек)ПоказателиIgAIgGIgMIgEОбщее содержаниеАбс.17932110183%96±1,4%17±2,7%59±3,5%98,7 ±0,8%Анти-ЛПС антителаАбс.1574326112%84,2±2,7%23±3%14±2,5%60,5±3,6%

Таблица 3. Иммуноглобулины класса А, специфичные ЛПС грамотрицательных
энтеробактерий, в копрофильтратах людей с разными степенями
дисбактериозов кишечника Отрицательные пробыПробы с наличием высоких титров IgA%Титр%ТитрДисбактериоз Iстепени (49 чел.)64,2 ±3,50-1:5035,8±3,51:100-1:150Дисбактериоз II степени (120 чел.)32,6±3,40-1:5067,4±3,41:200-1:400Дисбактериоз III степени (18 чел.)16,7±2,70-1:5083,3±2,7Свыше 1:400Коэффициент корреляции степеней
дисбактериоза и отр/полож. проб-0,8±0,2 (обратная тесная корреляционная
зависимость)0,8±0,2 (прямая тесная корреляционная зависимость)

Таблица 4. Иммуноглобулины класса G, специфичные ЛПС грамотрицательных энтеробактерий, в копрофильтратах людей с разными степенями дисбактериозов кишечника Отрицательные пробыПробы с наличием высокихтитров Ig G%Титр%ТитрДисбактериоз Iстепени (49 чел.)60,2±3,60-1:5039,8±3,61:100-1:150Дисбактериоз IIстепени (120чел.)52,0±3,60-1:5048,0±3,61:200-1:400Дисбактериоз III степени (18 чел.)25,8±3,10-1:5074,2±3,1Свыше 1:400Коэффициент корреляциистепеней дисбактериоза иотр./полож. проб-0,8±0,2 (обратная теснаякорреляционнаязависимость)0,8±0,2(прямая теснаякорреляционнаязависимость)

Таблица 5. Иммуноглобулины класса М, специфичные ЛПС грамотрицательных энтеробактерий, в копрофильтратах людей с разными степенями дисбактериозов кишечника Отрицательные пробыПробы с наличием
высоких титров IgM%Титр%ТитрДисбактериоз Iстепени (49 чел.)77,5±3,00-1:5022,5±3,01:100-1:150Дисбактериоз IIстепени (120чел.)62,4±3,50-1:5037,6±3,51:200-1:400Дисбактериоз IIIстепени (18 чел.)33,3±3.40-1:5066,7±3,4Свыше1:400Коэффициенткорреляциистепенейдисбактериоза иотр./полож. проб-0,8±0,2 (обратная теснаякорреляционнаязависимость)0,8±О,2 (прямая теснаякорреляционнаязависимость)

Таблица 6. Иммуноглобулины класса Е, специфичные ЛПС грамотрицательных энтеробактерий, в копрофильтратах людей с разными степенями дисбактериозов кишечника Отрицательные пробыПробы с наличием высоких
титров IgE %титр%титрДисбактериоз I степени (49 чел.)76,2±3,10-1:5023,8±3,11:100-1:150Дисбактериоз II степени (120 чел.)46,2±3,60-1:5058,3+3,61:200-1:400Дисбактериоз III степени (18 чел.)26,4±3,20-1:5073,6±3,2Свыше 1:400Коэффициент корреляции степеней дисбактериоза и отр/полож. проб-0,8±0,2 (обратная тесная корреляционная за- висимость)0,8±0,2 (прямая тесная корреляционная зависимость)

Таблица 7. Выявление одновременно комплексов иммуноглобулинов при разных степенях дисбактериозов кишечникаКлассы иммуноглобулинов,
определяемые в копрофильтратах людей одновременноДисбактериоз I степениДисбактериоз II степениДисбактериоз III степениIgA,IgG,IgM,IgE,0088,4±3,4%IgA,IgG,IgE,080,8±4,2%11,6±3,4%IgAJgG,100%19,2±4,4%0

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для диагностики степеней выраженности дисбактериоза кишечника. Для осуществления способа в копрофильтратах людей с дисбактериозами кишечника методом иммуноферментного анализа определяют содержание иммуноглобулинов IgA, IgG, IgE, IgM, специфичных ЛПС грамотрицательных энтеробактерий. По титрам антиэндотоксических антител в копрофильтратах, относящихся к IgA и IgG и находящихся в пределах 1:100-1:150, диагностируют дисбактериоз I степени. По титрам IgA, IgG, IgE - в пределах 1:200-1:400 диагностируют дисбактериоз II степени. А по титрам IgA, IgG, IgE, IgM - свыше 1:400 диагностируют дисбактериоз III степени. Использование способа позволяет провести диагностику степеней выраженности дисбактериоза кишечника у людей в короткие сроки и судить о степени напряженности местного антиэндотоксинового иммунитета, что может быть использовано для проведения своевременной индивидуальной коррекции. 7 табл.

Способ диагностики степени выраженности дисбактериоза кишечника, включающий исследование фекалий людей, по результатам которого судят о наличии изменений качественно-количественного состава микрофлоры кишечника, отличающийся тем, что в копрофильтратах людей с дисбактериозами кишечника определяют содержание иммуноглобулинов IgA, IgG, IgE, IgM, специфичных липополисахаридам грамотрицательных энтеробактерий, с помощью диагностической ИФА тест-системы, предназначенной для титрования сывороток крови, и по титрам антиэндотоксических антител в копрофильтратах, относящихся к IgA и IgG и находящимся в пределах 1:100-1:150 диагностируют дисбактериоз I степени, по титрам IgA, IgG, IgE - в пределах 1:200-1:400 диагностируют дисбактериоз II степени, а по титрам IgA, IgG, IgE, IgM - свыше 1:400 диагностируют дисбактериоз III степени.