СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ ДИСБАКТЕРИОЗА КИШЕЧНИКА У ДЕТЕЙ Российский патент 1995 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к медицине, оно может найти применение в медицинской практике для экспресс-диагностики дисбактериоза кишечника.

Известен ряд способов диагностики дисбактериоза кишечника. Наиболее широко распространен бактериологический количественно-качественный метод Хенеля путем дозированного посева десятикратных разведений фекалий на различные питательные среды, применяемый в различных модификациях, Этот способ дает наиболее точную характеристику состояния микрофлоры кишечника, однако он наиболее трудоемкий, требует много сред и посуды и довольно продолжителен по времени - ответ выдается на седьмые сутки. В связи с этим рядом авторов предложены косвенные методы диагностики дисбактериоза кишечника.

Известен косвенный метод выявления дисбактериоза кишечника при помощи определения антагонистической активности микрофлоры (Врачебное дело, 1981, N 6, с. 113-115) методом нанесения перпендикулярных штрихов индикаторных микроорганизмов. Этот метод, хотя и сокращает в 2 раза время получения результата, но дает ответ только на четвертые сутки после посева материала.

Известен косвенный метод определения дисбактериоза кишечника по повышению уровня кишечных ферментов - энтерокиназы и щелочной фосфатазы (Врачебное дело, 1978, N 6, с.90-92), определяемых на фотоэлектроколориметре. Метод прост, доступен для практических лабораторий, но не дает представления о степени дисбактериоза и не может быть использован для диагностики дисбактериоза у новорожденных вследствие незрелости у них ферментных систем. Кроме того, совпадение результатов определения указанных ферментов при дисбактериозе отмечается для энтерокиназы в 60% случаев, а для щелочной фосфатазы - только в 35%.

Более точен косвенный способ экспрессной диагностики дисбактериоза путем обнаружения β -аспаргилглицина (БАГ) в фекалиях методом высоковольтного электрофореза на бумаге (ж.Микробиология (М), 1985, N 8, с.15-18). Однако для выполнения указанного метода необходима сложная дорогостоящая аппаратура и импортные реактивы, приобретаемые за валюту, и, кроме того, метод разработан для группы гнотобионтных мышей, тогда как данные по определению БАГ у людей, в том числе у детей раннего возраста, отсутствуют.

Цель изобретения - упрощение и сокращение сроков диагностики дисбактериоза кишечника.

Это достигается тем, что определяют β -литическую активность копрофильтратов фотонефелометрическим методом.

Способ осуществляют следующим образом. 1 г фекалий растирают в ступке с небольшим количеством кварцевого песка и 9,0 мл стерильного физиологического раствора. Затем экстрагируют на холоду в течение 1 ч, надосадочную жидкость центрифугируют при 8 тыс. оборотов 30 мин.

С целью полного выявления β -литической активности оптимальное время экстракции и центрифугирования подобрано экспериментально (см.табл.1 и 2). Дальнейшее исследование проводят ускоренным фотонефелометрическим методом.

Для этого из 18-20-часовой агаровой культуры сенной палочки (штамм 83 ГКИ им.Тарасевича) готовят микробную взвесь в 0,75 М растворе сахарозы с рН 6,2. Густота взвеси должна соответствовать оптической плотности 0,500 (правый барабан, кювета 3 мм, зеленый светофильтр) на ФЭК-М. Затем смешивают 0,4 мл взвеси сенной палочки и 0,2 мм копрофильтрата, инкубируют при 37^оС в течение 2 ч, добавляют 0,6 мл 0,75 М сахарозы и определяют оптическую плотность на ФЭК-М (D₂).

Исходную оптическую плотность (D₁) замеряют в следующей смеси (мл): 0,4 сенной палочки, 0,2 копрофильтрата, 0,6 сахарозы без инкубирования в термостате.

Расчет β -литической активности проводят по формуле
% лизиса = × 100 где D₁ - исходная оптическая плотность;
D₂ - оптическая плотность опытных проб после инкубации.

Пример расчета β -литической активности.

Пpи нефелометрии опытного образца получен результат 0,200 (D₂), тогда как исходная оптическая плотность составляет 0,220 (D₁),
% лизиса = × 100 = 9,09
При сопоставлении уровня β -литической активности и состояния микрофлоры кишечника установлено, что нормоценозу соответствует процент лизиса от 0 до 5 при I степени дисбактериоза % лизиса составляет от 5,1 до 10%, при II степени - от 11 до 17%, при значении 17,1-30% диагностируют III степень дисбактериоза кишечника и свыше 30% - IV степень бактериоза.

Изучение качественного и количественного состава микрофлоры кишечника проводилось модифицированным методом, в основу которого положены методы Ф. Л. Вильшанской (1977), Н.Н.Лизько (1979), используемые в настоящее время в лаборатории бифидобактерий НИИЭМ им. Габричевского МЗ РСФСР, а также в ИМБЦ МЗ СССР; метод L.Bendig и H.Haenel в модификации С.К.Канарейкиной и Н.Н. Лизько, состоящий в использовании среды Симмонса и др. для выделения УПЭ (клебсиелла и др.); метод H.Haenel (1993), предлагающий использование фосфатно-тиогликолевого буфера для сохранения анаэробов в условиях их капельного посева. Сущность метода заключается в дозированном посеве десятикратных разведений точно отвешенного материала на плотные (чашечные) и полужидкие (пробирочные) среды.

При проведении исследования использовались следующие питательные среды: Эндо (для выявления патогенных энтеробактерий, нормальной и диссоциированной кишечной палочки), Калины (для выделения энтерококков), желточно-солевой агар (для выявления стафилококков), кровяной агар (для определения гемолизирующих форм), среда Симмонса (для выделения условно-патогенных энтеробактерий), среда Сабуро (дрожжи и дрожжеподобные грибы рода Кандида), среда МРС (для выделения лактобацилл), КАБ (кровяной агар бактероидов) с неомицином (для выделения бактериодов), пробирочные среды Вильсон-Блера (для выделения клостридий) и Блаурокка (для выделения бифидобактерий).

Определение видовой принадлежности УПЭ первоначально проводилось по укороченной схеме, включающей определение ацетилметилкарбинола и реакцию с метиловым красным, утилизацию сорбита и рамнозы, изменение аминокислот при помощи БИС, наличие фенилаланиндезаминазы (рац. предложение N 186 от 7.05.84, выдано ХНИИЭМ, см. приложение 2), а в дальнейшем - по тестам, рекомендованным международным Подкомитетом по этенробактериям.

Видовая принадлежность стафилококков определялась по наличию пигмента, лецитовителлазы, плазмокоагулазы, анаэробному сбраживанию маннита и глюкозы.

Определение видовой принадлежности лактобацилл проводилось по модифицированной нами (рац. предложение N 233 от 2.12.87, НИИЭМ) схеме, включающей изучение роста при 15 и 45^оС в присутствии 0,4% типоля и(или) 16% желчи, утилизацию сорбита, маннозы, целлобиозы, сахарозы и образование газа из глюкозы.

Видовая принадлежность бифидобактерий определялась на сконструированной нами среде (авт.св. N 1332810, 1987) и параллельно на среде, разработанной в МНИИЭМ им.Габричевского (авт.св. N 630921, 1978).

Для выделения бактероидов использовался модифицированный метод Фортнера (1980) с применением 4-часовой культуры Серрации марцесценс. Учитывалось только количество бактероидов, видовая принадлежность их нами не определялась.

Трактовка результатов и определение степени проведено в соответствии с действующим приказом МЗ СССР N 1307 от 22.12.1981, регламентирующим 4 степени дисбактериоза кишечника.

П р и м е р 1. Ребенок Х., 2 года, анализ N 256.

В 1 г фекалий 90 млн Е.coli, 5 млн энтерококка, 70 млн лактобацилл, 10^-10 бифидобактерий.

Заключение: Данных за дисбактериоз нет.

П р и м е р 2. Ребенок Д., 11 мес., анализ N 807.

В 1 г фекалий 10 млн E.coli, 100 тыс.грибов рода Кандида, 70 млн лактобацилл, 10^-9 бифидобактерий.

Заключение: Дисбактериоз I степени.

П р и м е р 3. Ребенок М., 4 года и 3 мес., анализ N 1359.

В 1 г фекалий 20 млн E.coli, 40 млн диссоциированной E.coli, 40 млн бактерий рода Клебсиелла, 60 млн лактобацилл, 10^-8 бифидобактерий.

Заключение: Дисбактериоз II степени.

П р и м е р 4. Ребенок Е., 1,5 года, анализ N 1173.

В 1 г фекалий 50 млн E.coli, 100 тыс.энтерококка, 600 тыс. лактобацилл, 10^-6 бифидобактерий.

Заключение: Дисбактериоз III степени.

П р и м е р 5. Ребенок И., 3 года, анализ N 1146.

В 1 г фекалий 300 млн E.coli, 200 млн бактерий рода энтеробактер, 600 млн энтерококка, 100 млн грибов рода Кандида, 80 млн лактобацилл. Бифидобактерии в разведенных 10^-7-10^-12 не обнаружены.

Заключение: Дисбактериоз IV степени.

Приведенные нами исследования (к настоящему времени проведено сравнительное изучение 229 образцов фекалий модифицированным количественно-качественным методом и косвенным биохимическим экспресс-методом) позволяют с высокой точностью диагностировать степень выраженности дисбактериоза кишечника (норма от 0 до 5% лизиса, I степень 5,1-10,0%, II - 10,1-17,0%, III степень 17,1-30- и IV степень 30,1% и выше.

Преимущества предложенного способа проиллюстрированы в табл.3.

Изобретение относится к медицине и может найти применение в медицинской практике для определения степени бактериоза кишечника у детей. Цель изобретения упрощение и ускорение способа. Способ осуществляют следующим образом. В пробе, копрофильтрата определяют β -литическую активность фотонефелометрическим методом и при значении этого показателя 5,1 - 10% определяют 1 степень, при 10,1 - 17% - II степень, 17,1 - 30% - III степень, выше 30% - IV степень дисбактериоза кишечника у детей. 3 табл.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ ДИСБАКТЕРИОЗА КИШЕЧНИКА У ДЕТЕЙ, включающий лабораторный анализ фекалий, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения способа, из пробы фекалий получают копрофильтрат, определяют в нем β - литическую активность и при значениях этого показателя 5,1 - 10, 10,1 - 17, 17,1 - 30, 30,1% и выше определяют соответственно первую, вторую, третью и четвертую степень бактериоза кишечника.