СПОСОБ ВЫЗЫВАНИЯ СИНХРОНИЗИРОВАННОЙ СУПЕРОВУЛЯЦИИ У ПОЛОВОЗРЕЛЫХ СВИНЕЙ Российский патент 1997 года по МПК A61K38/24 

Изобретение относится к области животноводства, в частности к биотехнологии животных, к способам регулирования воспроизводительной функции свиней, и может быть использовано при получении трансгенных свиней путем введения генно-инженерных конструкций в пронуклеусы зигот в научно-исследовательских учреждениях и селекционных центрах.

В настоящее время получение трансгенных животных осуществляется главным образом путем микроинъекции генно-инженерных конструкций в эмбрионы ранних стадий развития. Основным условием, необходимым для передачи трансгена от первичного трансгенного животного его потомкам, является интеграция его в клетки зародышевого пути (гоноциты), из которых в дальнейшем развиваются органы воспроизводительной системы, продуцирующие яйцеклетки или сперматозоиды. Но это условие может быть достигнуто только в том случае, если эмбрионы, предназначенные для введения в них чужеродных генов, будут находиться на стадии зиготы, т.е. на стадии двух пронуклеусов до момента их слияния. Только в этом случае при введении генно-инженерных конструкций в один из пронуклеусов зиготы наиболее высока вероятность того, что чужеродный ген попадает во все клетки будущего организма и в том числе в гоноциты. При введении генных конструкций в ядра 2- или 4-клеточных эмбрионов значительно снижается вероятность попадания чужеродного гена во все клетки будущего организма, в том числе и в гоноциты. В результате этого чаще всего получаются первичные трансгенные животные с мозаичной интеграцией трансгена, который не передается по наследству. В связи с этим для получения трансгенных животных требуется большое количество эмбрионов на стадии зиготы.

Известно два основных способа вызывания суперовуляции для получения эмбрионов свиней на стадии зиготы.

Первый способ вызывания суперовуляции основан на использовании для этой цели неполовозрелых самок с живой массой 80-85 кг и заключается в следующем. Неполовозрелым свинкам, не проявившим ни разу признаков половой охоты, подкожно или внутримышечно вводят один из препаратов, обладающих фолликулостимулирующей активностью, гонадотропин сыворотки жеребых кобыл (ГСЖК) или нативную СЖК в дозе 1200-1500 И.Е. на голову (однократно) и через 70-72 час после введения ГСЖК однократно внутримышечно или подкожно вводят 750 И.Е. хронического гонадотропина человека (ХГ) для вызывания овуляции. Через 24 час после введения ХГ проводят первое искусственное осеменение свиней, а через 12 час после первого осеменения второе. Через 24-25 час после второго осеменения производят извлечение эмбрионов. (Springmann K. Brem G. Embryotransfer beim Schwrinim Rahmen von gentrasferprogrammen. Tierartl. Prax. (Suppl) V.4. 1989. P.21-25.)
Основным условием успешного применения данного способа является то, что свинки, предназначенные для получения эмбрионов, не должны до момента гормональной обработки проявлять признаков половой охоты и в их яичниках не должно происходить овуляции фолликулов и образования желтых тел. Однако выдержать это условие на крупных свиноводческих фермах очень сложно, т.к. чаще всего из-за неудовлетворительного кормления молодых свинок проявление охоты у них начинается в более позднем возрасте, но при живой массе 60-65 кг, а уловить момент начала циклического проявления охоты у таких свиней практически невозможно. Кроме того, даже в наиболее удачных случаях вызывания суперовуляции у неполовозрелых свинок выход эмбрионов на стадии зиготы составляет в среднем 46-48% от числа полученных эмбрионов. (Springmann K. Brem G. Emdryotransfer beim Schweinim Rahmen von Gentransferprogrammen. - Teirartl/ Prax. (Suppl) V.4. 1989. P.21-25.)
В связи с этим чаще всего при получении трансгенных свиней в качестве доноров эмбрионов вынуждены использовать половозрелых свиней с выявленным половым циклом.

Известен второй широкораспространенный способ вызывания суперовуляции у половозрезых нормальноциклирующих свиней, заключающийся в следующем. У циклирующих свиней выявляют охоту на 16-й день следующего полового цикла (считая первый день предыдущей охоты нулевым днем или однократно подкожно или внутримышечно вводят какой-либо из препаратов, обладающих фолликулостимулирующей активностью (СЖК, ГСЖК и др.) в дозе 1200-1500 И.Е. на голову, а через 72-80 час после этого также однократно (подкожно или внутримышечно) свиньям вводят хорионический гонадотpопин (ХГ) в дозе 750-1000 И.Е. на голову для вызывания овуляции. По мере прихода животных в охоту их осеменяют, стараясь провести первое осеменение через 24 час после введения ХГ, а второе через 12 час после первого. Через 18-24 час после второго осеменения производят извлечение эмбрионов. (Hunter R.H.F. Superovulation and fertility in the pig. Anim.Prod. 1964. V.6. P.189-194.)
Однако при данном способе вызывания суперовуляции у свиней выход эмбрионов на стадии зиготы составляет только около 40% от общего числа полученных эмбрионов и обусловлено это тем, что при одинаковой продолжительности фолликулярной фазы, т.е. времени от начала роста фолликулов до их овуляции (в среднем 5 дней), продолжительность половых циклов у каждой отдельной свиньи может колебаться от 17 до 25 дней. В результате этого 16-й день полового цикла, взятый за исходную точку начала обработки свиней гонадотропными препаратами, может приходиться как на конец или середину фолликулярной фазы полового цикла (при коротких 17-18-дневных циклах), так и на середину лютеальной фазы (при продолжительных 23-25-дневных циклах). У свиней с укороченным естественным половым циклом (17-18 дней) введение ГСЖК на 16-й день придется на конец фолликулярной фазы и животные независимо от этого введения через 1-2 дня придут в охоту, т.е. введение ГСЖК окажется бесполезным для фолликулов, которые начали расти под воздействием эндогенного ФСГ за 3-4 дня до введения экзогенного ГСЖК, т.к. для развития фолликула от момента его активного роста до овуляции необходимо 4-5 дней. Кроме того, это введение ГСЖК на 16-й день у свиней с укороченным половым циклом (17-18 дней) может оказать и вредное влияние на оплодотворение и развитие яйцеклеток, овулировавших из фолликулов первой волны, потому что введенный ГСЖК вызовет рост популяции тех антральных фолликулов, которые не пошли в рост под действием эндогенного ФСГ из-за своего малого размера, но под влиянием высоких доз экзогенной фолликулостимулирующей активности ГСЖК начнут расти в виде второй волны, выделяя большое количество половых стероидных гормонов, которые будут отрицательно влиять на оплодотворение и дальнейшее развитие яйцеклеток, овулировавших из первой волны фолликулов. У свиней с удлиненным половым циклом (23-25 дней) введение ГСЖК придется на лютеальную фазу полового цикла, когда рост фолликулов подавлен действием прогестерона, выделяемого желтыми телами, и поэтому животные этой группы придут в охоту позднее ожидаемых сроков, нарушая всякую синхронизацию половых циклов.

В результате этого в обоих вышеприведенных случаях введение экзогенных гонадотропинов приходится на период времени, когда состояние яичников является неблагоприятным для развития многочисленной однородной популяции антральных фолликулов и получения в дальнейшем большого числа эмбрионов на стадии зиготы. И только у свиней с продолжительностью естественного полового цикла в 20-21 день обработка гонадотропинами на 16-й день цикла приходится на начало фолликулярной фазы цикла, т.е. на самый благоприятный период для роста фолликулов. При этом одним из неприятных моментов является и то, что продолжительность половых циклов у одной и той же свинки сильно варьирует, и поэтому невозможно определить продолжительность следующего цикла по продолжительности предыдущего, т.к. чаще всего они не совпадают по продолжительности. Все это не позволяет четко синхронизировать половые циклы свиней с различной продолжительностью, а следовательно, и получить большое число эмбрионов на стадии зиготы при использовании способа вызывания суперовуляции у половозрелых свиней, начинающихся на 16-й день полового цикла.

Целью изобретения является повышение выхода эмбрионов на стадии зиготы при вызывании синхронизированной суперовуляции у половозрелых свиней.

Поставленная цель достигается тем, что на 12-14-й день полового цикла свиньям вводят один из препаратов простагландина F_2α или его аналогов для вызывания регрессии желтого тела и приведения яичников к состоянию начала фолликулярной фазы полового цикла. В основу нового подхода к повышению выхода зигот положен факт об ограниченном промежутке времени, в течение которого желтое тело свиней чувствительно к действию простагландина F_2α.. Установлено, что в отличие от других видов животных (крупный рогатый скот, овца, козы), у которых желтое тело чувствительно к действию простагландина F_2α в течение всей лютеальной фазы, начиная с 4-5-го дня полового цикла, у свиней простагландин F_2α может вызывать регрессию желтого тела только в течение очень короткого промежутка времени, начиная с 11-12-го дня и до начала фолликулярной фазы полового цикла (14-16-й день), в зависимости от продолжительности полового цикла. Введение свиньям препарата простагландина F_2α на 12-14-й день полового цикла вызывает у них начало регрессии желтого тела и таким образом приводит яичники всех обработанных свиней независимо от продолжительности их естественных половых циклов к состоянию начала фолликулярной фазы цикла, т.е. к состоянию, наиболее благоприятному для воздействия на них экзогенными гонадотропинами, что приводит к развитию в яичниках многочисленной однородной популяции антральных фолликулов и получению большего числа эмбрионов на стадии зиготы. Другое положительное отличие вновь предлагаемого способа состоит в том, что введение простагландина F_2α в период с 12-го по 14-й день позволяет вызывать суперовуляцию у свиней, находившихся в охоте не один день, а в течение 4-5 дней и, таким образом, подготавливать для работы более крупные группы животных.

Предлагаемый способ синхронизированной суперовуляции у половозрелых свиней выглядит следующим образом:
в период с 12-го по 14-й день полового цикла (считая первый день предыдущей охоты нулевым днем) в один и тот же день группе свиней подкожно дважды с интервалом 8-19 час (утром и вечером) вводят один из препаратов простагландида F_2α в дозах, рекомендуемых для свиней, например экстрофан (синтетический аналог простагландина F_2α) в дозе 250 мкг действующего начала на 1 инъекцию, с целью вызывания регрессии желтого тела;
через 24-36 час после введения экстрофена свиньям однократно (подкожно или внутримышечно) вводят один из препаратов гонадотропина СЖК в дозе 1200-1500 И.Е. на голову;
через 72-80 час после введения ГСЖК животным однократно (подкожно или внутримышечно) вводят ХГ в дозе 750-1000 И.Е. на голову;
через 40-42 час после введения свиньям ХГ их осеменяют однократно;
через 16-18 час после осеменения проводят извлечение эмбрионов.

Таким образом, принципиальное отличие предлагаемого способа вызывания синхронизированной суперовуляции от используемого в настоящее время способа, основанного на принципе введения гонадотропинов начиная с 16-го дня полового цикла, заключается в том, что за счет введения простагландина F_2α в период с 12-го по 14-й день цикла вызывается начало регрессии желтого тела и приведение состояния яичников у всех свиней независимо от продолжительности естественных половых циклов к состоянию, соответствующему началу фолликулярной фазы полового цикла.

Введение экзогенных гонадотропинов в этот период вызывает в яичниках свиней развитие многочисленной однородной популяции антральных фолликулов, что приводит в конечном результате к получению большего числа эмбрионов на стадии зиготы.

Пример 1. Эксперимент проводили в условия вивария ВНИИФБиП на половозрелых циклирующих свиньях пород крупная белая и ландрас. У животных выявляли сроки естественной половой охоты и в предусмотренные экспериментом сроки проводили гормональную обработку с целью вызывания суперовуляции. Свиней контрольной группы (I гр.) обрабатывали согласно известному способу. На 16-й день полового цикла им однократно подкожно или внутримышечно вводили 1200-1500 И. Е./гол. ГСЖК, а через 72-80 час после введения ГСЖК однократно вводили подкожно или внутримышечно 750-1000 И.Е. ХГ на голову. По мере прихода свиней в охоту их дважды покрывали хряком, стараясь провести первое осеменение через 24 час после введения ХГ, а второе через 12 час после первого. Через 18-24 час после второго осеменения проводили извлечение эмбрионов хирургическим способом.

Свиньям опытной группы (II гр.) в период с 12-го по 14-й день полового цикла в один и тот же день дважды с интервалом 8-10 час вводили подкожно эстрофан в дозе 250 мкг действующего начала/гол. Через 24-36 час после введения эстрофана свиньям однократно вводили внутримышечно ГСЖК в дозе 1200-1500 И.Е. на голову. Через 72-80 час после введения ГСЖК животным однократно ввели ХГ в дозе 750-1000 И.Е. на голову. Через 40-42 час после введения ХГ свиней опытной группы однократно покрывали хряком и через 16-18 час после осеменения проводили извлечение эмбрионов.

Сравнительный анализ эффективности вновь предложенного и известного способов показал (таблица 1), что выход эмбрионов на стадии зиготы был выше у свиней второй группы, почти в 2 раза (13,3 против 6,8) по сравнению с I группой и составил 67,2% от общего числа полученных эмбрионов против 42,2% в контрольной группе.

Увеличение выхода зигот у животных опытной группы происходило за счет снижения выхода 2-клеточных (22,2 против 37,9) и 4-клеточных эмбрионов (10,6 против 19,9). При этом общее число эмбрионов, полученных от животных II группы, было несколько выше по сравнению с контрольной группой (19,8 против 16,1).

Таким образом, предлагаемый способ вызывания синхронизированной суперовуляции у половозрелых свиней позволяет увеличить выход эмбрионов на стадии зиготы почти в 2 раза по сравнению с известным способом, а относительно эмбрионов других стадий развития в среднем на 25%
Пример 2. Эксперимент проведен в условиях свиноводческого комплекса на половозрелых свиньях с установленным половым циклом. Свиней контрольной группы (I гр.) обрабатывали известным способом, а свиней опытной группы (II гр. ) по схеме вновь предлагаемого способа. Все гормональные обработки животных проводились также, как описано выше в примере I. Анализ результатов эксперимента свидетельствует (таблица 2), что выход эмбрионов на стадии зиготы был выше у свиней II группы почти в 3 раза (14,0 против 4,7) по сравнению с I группой и составил 87,5% от общего числа полученных эмбрионов против 31,3% в контрольной группе. При этом общее число эмбрионов, полученных на одного донора, в обеих группах было практически одинаковым (15 и 16).

Таким образом, в этом эксперимента предлагаемый способ вызывания синхронизированной суперовуляции у половозрелых свиней позволил увеличить выход эмбрионов на стадии зиготы почти в 3 раза по сравнению с известным способом и довести выход эмбрионов до 87,5% что на 56,2% выше, чем в контроле.

Использование предлагаемого способа вызывания синхронизированной суперовуляции у половозрелых свиней обеспечивает по сравнению с существующими способами следующие преимущества:
а) повышение выхода эмбрионов на стадии зиготы в 2-3 раза у свиней-доноров, что особенно важно для снижения затрат и повышения эффективности работ при получении трансгенных свиней;
б) возможность формировать большие группы свиней-доноров для вызывания суперовуляции за счет отбора животных, пришедших в охоту в течение 1-4 дней, а не в течение только одного-единственного дня, как это делается при известном способе, что позволяет проводить работу по трансгенезу в условиях небольших ферм, повышая ее эффективность;
в) проводить однократное осеменение свиней-доноров за счет высокой синхронности прихода их в охоту.

Использование: животноводство. Сущность изобретения: с целью повышения выхода эмбрионов на стадии зиготы при вызывании синхронизированной суперовуляции у половозрелых свиней в период с 12-го по 14-й день полового цикла в один и тот же день группе свиней дважды с интервалом 8-10 час вводят один из препаратов простагландида F_2α в дозах, рекомендуемых для свиней. Далее последовательно вводят однократно через 24-36 час гонадотропин сыворотки жеребых кобыл (ГСЖК) в дозах 1200-1500 И.Е. на голову и через 72-80 час - хорионический гонадотропин человека (ХГ) в дозе 750-1000 И.Е./гол. Через 40-42 час после введения ХГ проводят однократное осеменение свиней и через 16-18 час после этого проводят извлечение эмбрионов. Способ позволяет повысить выход эмбрионов на стадии зиготы в 2-3 раза по сравнению с известными способами вызывания суперовуляции. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ вызывания синхронизированной суперовуляции у половозрелых свиней, включающий введение им гонадотропных препаратов в фолликулярную фазу полового цикла, отличающийся тем, что перед введением гонадотропных препаратов в период с 12-го по 14-й день полового цикла свиньям дважды с интервалом 8 10 ч вводят один из препаратов простагландина F_2α в дозах, рекомендуемых для свиней, и далее последовательно вводят однократно через 2 36 ч гонадотропин сыворотки жеребых кобыл в дозе 1200 1500 И.Е. на голову и через 72 80 ч хорионический гонадотропин человека в дозе 750 1000 И.Е./гол. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что осеменение свиней-доноров проводят однократно через 40 42 ч после введения хорионического гонадотропина человека.