СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ПРИЖИВЛЯЕМОСТИ ЗИГОТ, МИКРОИНЪЕЦИРОВАННЫХ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОЙ КОНСТРУКЦИЕЙ У СВИНЕЙ-РЕЦИПИЕНТОВ Российский патент 2003 года по МПК A61D19/04 A01K67/02 

Изобретение относится к области биологии, в частности к биотехнологии получения трансгенных животных, и может быть применено для повышения эффективности технологии получения трансгенных свиней.

Большое внимание к свинье, как объекту для работ по трансгенозу, объясняется тем, что свинья является многоплодным животным, имеющим сравнительно короткий воспроизводительный цикл. От нее можно получать большое число оплодотворенных яйцеклеток, необходимых для введения в них чужеродных генов, и получать от одного реципиента несколько потомков, развившихся из зигот, микроинъецированных этими генами, что является важнейшим условием для успешной работы по трансгенозу.

В связи с тем, что свиноводство является одной из ведущих отраслей сельскохозяйственного производства, улучшение генотипа свиней и ускорение селекционного процесса в направлении повышения продуктивности, устойчивости к болезням и улучшения качества продукции с помощью трансгеноза имеет большое народнохозяйственное значение. Кроме того, расчеты показывают, что из-за своей многоплодности и скороплодности свинья может быть удобным объектом для получения трансгенных животных-суперпродуцентов человеческих биологически активных веществ фармакологического назначения.

В последние годы интенсивно ведутся исследования, направленные на выяснение возможности трансплантации органов и тканей животных человеку (ксенотрансплантация). Принимая во внимание анатомо-физиологические сходства и соразмерность некоторых органов свиньи (сердце, почки, и др.) с органами человека, а также отсутствие общих с человеком инфекционных заболеваний, исследователи склонны считать, что при определенном генетическом вмешательстве в иммунные процессы органы трансгенных свиней могут быть использованы для ксенотрансплантации их человеку. Таким образом, благодаря многоплодности и скороплодности свинья становится одним из основных объектов технологии трансгеноза.

До настоящего времени основным способом введения чужеродных генов в геном животных является метод микроинъекции генно-инженерных конструкций в пронуклеусы зигот, включающий различные микроманипуляции (центрифугирование, прокол цитоплазматической и ядерной оболочек, введение в пронуклеус чужеродной ДНК в буферном растворе и т.д.), действие которых оказывает определенное отрицательное влияние на развитие микроинъецированных зигот и, соответственно, на их приживляемость при трансплантации свиньям-реципиентам.

Трансплантация зигот, микроинъецированных генно-инженерной конструкцией, свиньям-реципиентам является одним из основных этапов технологии получения трансгенных свиней, от которого в значительной степени зависит приживляемость эмбрионов, выход потомства и, следовательно, общая эффективность технологии.

Известно два способа трансплантации эмбрионов свиней.

Первый способ трансплантации эмбрионов свиньям-реципиентам заключается в том, что эмбрионы поздних стадий развития (морулы и бластоцисты) в количестве 15-18 штук пересаживают в один рог матки хирургическим способом с помощью специальных катетеров.

Трансплантация эмбрионов свиней в один рог матки основывается на установленном в 60-х годах факте, свидетельствующем о том, что эмбрионы свиней обладают способностью мигрировать из одного рога матки в другой (Dziuk P.J., Polge С., Rowson L. E. A. - Intra-uterine migration and mixing of embryos in swine following egg transfer.- J. Anim. Sci. 1964, v. 23: 37-42). Это свойство свиных эмбрионов позднее стали использовать при трансплантации эмбрионов предимплантационных стадий развития животным-реципиентам. Общепринято свиньям-реципиентам пересаживать эмбрионы в один рог матки, полагая, что эмбрионы сами равномерно распределятся в рогах матки за счет эффекта миграции. Трансплантация эмбрионов в один рог матки менее трудоемка и требует меньших затрат времени. Супоросность свиней-реципиентов при трансплантации эмбрионов поздних стадий развития в один рог матки составляет 50-60%, а приживляемость эмбрионов 20-25% (Hunter R.H.F., Polge С. and Rowson L.E.A. - The recovery, transfer and survival of blastocysts in pigs. - J. Reprod. Fert. 1966, v. 14: 501-502).

Второй способ. Наиболее близким по технологической сущности к предлагаемому изобретению является способ трансплантации зигот, микроинъецированных генно-инженерной конструкцией (прототип). При этом способе у свиней-доноров вызывают суперовуляцию и производят извлечение из яйцеводов эмбрионов, находящихся на стадии зиготы, затем в пронуклеусы зигот микроинъецируют генно-инженерную конструкцию и после этого микроинъецированные зиготы трансплантируют в один из яйцеводов свиней реципиентов, половой цикл которых синхронизирован с половым циклом свиней доноров эмбрионов с помощью гормональной обработки. В связи с тем, что при данном способе трансплантации эмбрионов животным-реципиентам пересаживают не бластоцисты, а зиготы, в которые введена генно-инженерная конструкция, то их вводят не в матку, а в яйцевод, и в количестве, значительно превышающем число бластоцист, пересаживаемых в рог матки при обычной трансплантации эмбрионов (30-40 против 15-18 соответственно), так как принимается во внимание снижение жизнеспособности у определенной части зигот, которое происходит в процессе манипуляций, связанных с микроинъекцией в них генно-инженерной конструкции. Как и при трансплантации обычных бластоцист, зиготы, микроинъецированные генно-инженерной конструкцией, вводят в один яйцевод свиней-реципиентов полагая, что развивающиеся эмбрионы смогут мигрировать во второй рог матки и равномерно распределиться в рогах матки. Однако супоросность свиней-реципиентов и приживляемость эмбрионов при таком способе пересадки остается очень низкой (30-40% и 5-7% соответственно) (К. Spinsmann, G. Brem - Embryotransfer beim Schwein im Rahmen von Gentransferprosrammen - Tierarztl. Prax. Suppl. 4, 21-25, 1989).

В этом исследовании одной группе (I гр.) свиней-реципиентов трансплантировали менее 40 микроинъецированных эмбрионов, а второй группе - более 40. Супоросными стали 25% реципиентов I группы и 46% -II группы. Однако приживляемость эмбрионов была выше у супоросных реципиентов I группы, чем у второй. Результаты наших исследований по выяснению зависимости приживляемости эмбрионов от числа зигот, трансплантированных свиньям-реципиентам, показал, что с увеличением числа трансплантированных эмбрионов с 10 до 40 увеличивалось число супоросных реципиентов с 20 до 43%. Но приживляемость эмбрионов у них при этом снижалась с 33,3% при пересадке 10 эмбрионов до 13,3% при пересадке 31-40 эмбрионов. Аналогичное снижение приживляемости эмбрионов наблюдалось и при пересчете на всех использованных реципиентов с 8,9 до 5,7% при пересадке 11-20 и 31-40 микроинъецированных зигот соответственно. Более низкий процент приживляемости эмбрионов при трансплантации большого числа микроинъецированных зигот (свыше 30) по-видимому обусловлен повышенной смертностью эмбрионов на стадии элонгации, когда на небольшом участке рога матки скапливается большое число элонгированных эмбрионов длиной до 1 метра. И поэтому наиболее высокий процент приживляемости эмбрионов наблюдается при трансплантации не очень большого числа микроинъецированных зигот. В этом случае после гибели определенной части эмбрионов на ранних стадиях развития, вызванной различными манипуляциями, связанными с микроинъекцией в них генно-инженерных конструкций, стадии элонгации достигает меньшее число эмбрионов, для которых сохраняются лучшие условия для имплантации.

Целью настоящего изобретения является разработка способа повышения приживляемости зигот, микроинъецированных генно-инженерной конструкцией, у свиней-реципиентов для повышения общей эффективности технологии получения трансгенных свиней.

Поставленная цель достигается тем, что в предлагаемом способе трансплантацию зигот, микроинъецированных генно-инженерной конструкцией, проводят в два яйцевода по 9-12 штук в каждый свиньям-реципиентам, половой цикл которых синхронизирован с половым циклом свиней доноров эмбрионов. В известном способе трансплантацию микроинъецированных зигот производят в один яйцевод в количестве 30-40 штук.

Пример. Для получения большого числа зигот у свиней-доноров вызывали суперовуляцию. Группе свиней, находившихся на 12-15-ом дне полового цикла (считая первый день предыдущей охоты нулевым днем), в один и тот же день дважды с интервалом 8-10 часов подкожно вводили один из препаратов простагландина F₂α в дозе, рекомендованной для свиней согласно инструкции. Через 24-36 часов после введения простагландина свиньям однократно внутримышечно вводили один из препаратов сыворотки крови жеребых кобыл (СЖК) в дозе 1200-1500 И. Е. на голову, а через 72-80 часов после введения гонадотропина СЖК животным однократно внутримышечно вводили хорионический гонадотропин человека (ХГ) в дозе 750-1000 И.Е. Через 40-42 часа после введения свиньям ХГ их осеменяли однократно и через 16-18 часов после этого проводили извлечение эмбрионов на стадии зиготы. Для синхронизации половых циклов свиней-реципиентов обрабатывали гормональными препаратами по той же схеме, что и свиней-доноров, за исключением того, что доза СЖК была снижена до 600-700 И.Е.

Эмбрионы ранних стадий развития извлекали путем промывания яйцеводов у животных доноров средой Дюльбекко, обогащенной 4% фетальной сыворотки крупного рогатого скота.

Морфологическую оценку эмбрионов свиней проводили под инвертированным микроскопом, оснащенным оптикой Номарского, в среде DMEM с HEPES, обогащенной 20% фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Для облегчения визуализации пронуклеусов в зиготах и ядер в 2-4-клеточных эмбрионах проводили их центрифугирование при 10.000-13.000g в течение 5-7 минут, обеспечивающее смещение липидных и пигментных включений к одному из полюсов эмбриона.

Микроинъекцию генно-инженерных конструкций в пронуклеусы зигот осуществляли стеклянной инъекционной иглой с наружным диаметром кончика 1,5-2 мкм на установке, включающей инвертированный микроскоп типа ICM-405 с оптикой дифференциально-интерференционного контраста (DIC) и комплект манипуляторов и инъекторов. Точность введения раствора экзогенной ДНК определяли по увеличению размера пронуклеусов. Для микроинъекции использовали генно-инженерную конструкцию, включающую нуклеотидные последовательности человеческого гена гранулоцит-колониестимулирующего фактора под промотором гена αS1-казеина крупного рогатого скота. Объем чужеродной ДНК, вводимой в пронуклеусы, составлял 1-2 пл с концентрацией 4-6 нг/мкл, что соответствовало 400-600 копиям генно-инженерной конструкции на одну инъекцию.

Трансплантацию микроинъецированных эмбрионов свиньям-реципиентам проводили в ампулярную часть яйцевода со стороны бахромки с помощью специального пластикового катетера. Свиньям-реципиентам контрольной группы зиготы в количестве 20-25 штук пересаживали в один яйцевод, а животным опытной группы - в оба яйцевода по 10-12 зигот в каждый яйцевод.

Анализ результатов эксперимента (см. таблицу) свидетельствует о том, что процент супоросности был достоверно выше у свиней-реципиентов, которым трансплантировали микроинъецированные зиготы в оба яйцевода, т.е. при двусторонней трансплантации (66,6% против 45,4%), при практически одинаковом количестве зигот, трансплантированных одному реципиенту (22,3±2,2 и 21,3±2,4). Аналогичная закономерность наблюдалась и по приживляемости эмбрионов, как в пересчете на всех реципиентов (10,1% против 3,4%), так и на одного супоросного реципиента (15,2% против 7,5%, соответственно).

Это увеличение процента супоросности и приживляемости эмбрионов у свиней-реципиентов достигается за счет того, что при трансплантации микроинъецированных зигот в два яйцевода происходит более равномерное распределение эмбрионов в рогах матки, что создает для них наиболее благоприятные условия для развития, чем при односторонней пересадке.

Таким образом, предлагаемый способ трансплантации зигот, микроинъецированных генно-инженерной конструкцией, позволяет более чем на 20% повысить супоросность у свиней-реципиентов, в 2 раза - приживляемость эмбрионов и выход потомства, а следовательно, и общую эффективность технологии получения трансгенных свиней.

Изобретение относится к биологии, в частности к биотехнологии получения трансгенных животных. Трансплантацию зигот, микроинъекцированных генно-инженерной конструкцией, проводят в два яйцевода по 9-12 штук в каждый свиньям-реципиентам, половой цикл которых синхронизирован с половым циклом свиней доноров эмбрионов. Способ позволяет более чем на 20% повысить супоросность у свиней-реципиентов и почти в 2 раза - приживляемость эмбрионов. 1 табл.

Способ повышения приживляемости зигот, микроинъецированных генно-инженерной конструкцией, у свиней-реципиентов, включающий синхронизацию половых циклов свиней-доноров и реципиентов и трансплантацию этих зигот в один из яйцеводов свиней-реципиентов, отличающийся тем, что трансплантацию зигот свиньям-реципиентам проводят в оба яйцевода, причем в каждый яйцевод пересаживают по 9-12 зигот, микроинъецированных генно-инженерной конструкцией.