СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ Российский патент 1997 года по МПК C12P1/00 C12P1/06 

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа выделения биологически активных веществ (БАВ).

Важным этапом в производстве БАВ является выделение их по окончании биосинтеза из нативных растворов фильтрованных культуральных жидкостей. Нативные растворы содержат большое количество балластных примесей, находящихся в растворенном состоянии, в виде коллоидов и взвесей. Эти примеси существенно ухудшают показатели процесса выделения и химической очистки и снижают выход БАВ. В связи с этим почти все производства БАВ включают стадию предварительной обработки культуральной жидкости или нативного раствора.

К наиболее распространенным способам очистки от белковых примесей относятся тепловая и кислотная коагуляции [1] Известны способы очистки от белков путем обработки культуральных жидкостей системой ферментов, содержащих целлюлозу [2] трипсином [3] Эффективным методом коагуляции примесей является метод образования наполнителя непосредственно в жидкости, при добавлении реагентов, образующих в ней нерастворимый осадок [4] Очистку осуществляют осаждением белков растворимыми солями щелочноземельных металлов [5] четвертичными аммониевыми солями детергентов [6] денатурацией белков подкислением и нагревание [7]
Недостатком известных способов является низкий выход БАВ, многостадийность, энергозатраты и расход различных химикатов на стадии обработки культуральной жидкости или нативного раствора. Потери целевого продукта составляют от 4 до 30%
Использование тепловой коагуляции культуральной жидкости или нативного раствора приводит к инактивации (разрушению) БАВ.

Несколько более мягким способом обработки культуральной жидкости или нативного раствора по сравнению с перечисленными является способ обработки при помощи химических коагулянтов особого типа высокомолекулярных полиэлектролитов, флокулянтов [8-11]
Наиболее близким к заявленному способу по технической сущности и достигаемому эффекту является способ извлечения феноксиметилпенициллина, при котором перед проведением экстракции в нативный раствор в качестве деэмульгатора добавляют 0,2% контакта Петрова и подкисляют его перед добавлением бутилацетата [12]
Основным недостатком способа по прототипу [12] является недостаточно эффективная очистка от различного рода примесей, приводящих к снижению выхода и качества целевого продукта. Этот недостаток полностью устраняется в заявляемом способе выделения БАВ.

Целью настоящего изобретения является повышение выхода и качества целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что культуральная жидкость без термо- и химической обработок фильтруют и полученный нативный раствор (либо гидролизат) подвергают ультрафильтрации пропусканием через гетеро- или карбоцепной полимерный материал на основе полисульфонамида или полиакрилонитрила со скоростью от 10 до 50 л/м²ч в зависимости от типа БАВ (см. табл. 1).

Выход БАВ на стадии получения промежуточного продукта (концентрата, элюата, экстракта) по предлагаемому способу составляет от 53 до 97% для различных БАВ, что значительно превосходит этот показатель по известному способу прототипа (см. табл. 2). Снижение количества органических примесей для аминогликозидных антибиотиков, в частности гентамицина составляет примерно 20% Увеличение выхода БАВ в заявляемом способе по сравнению с известным способом по прототипу для различных БАВ изменяется от 7,0 до 34,9% за счет исключения стадии предварительной обработки культуральной жидкости или нативного раствора и использования полимерного материала на различной основе (см. табл. 3).

В таблице 4 представлена эффективность ультрафильтрационной очистки по сравнению с очисткой флоккулянтами по способу прототипа.

Новым в предлагаемом способе является применение фильтрации биологически активных веществ через гетеро- или карбоцепной материал на основе полисульфона, полисульфонамида или полиакрилонитрила со скоростью от 10 до 50 л/м²ч. Пропускание раствора БАВ через гетеро- или карбоцепной материал со скоростью менее 10 л/м²ч. нецелесообразно, поскольку при этом увеличивается время фильтрации, что приводит к частичной инактивации целевого продукта и снижению выхода БАВ. Увеличение скорости пропускания раствора БАВ более 50 л/м²ч. связано с повышением давления, при котором подается раствор на гетеро- или карбоцепной материал. Это в свою очередь приводит к сжатию пор полимерного материала, забиванию их оргпримесями и снижению в конечном итоге скорости пропускания раствора.

Примеры, приведенные ниже, иллюстрируют изобретение.

Пример 1.

3 л культуральной жидкости гиббереллина (5,85 г по массе) фильтруют под вакуумом и получают 6,0 л нативного раствора с промывными водами (5,62 г гиббереллина по массе). Выход на стадии фильтрации культиваторной жидкости составляет 96% Нативный раствор гиббереллина пропускают через карбоцепной полимерный материал на основе полиакрилонитрила (ПАН-20) со скоростью 50 л/м²ч. Получают 7,25 л фильтрата (5,6 г гиббереллина по массе). Выход на стадии получения фильтрата составляет 99,5% К фильтрату добавляют 76 г активированного угля и проводят адсорбцию гиббереллина на уголь при перемешивании в течение 4 ч. затем уголь отделяют, промывают водой и десорбируют гиббереллин с угля водным раствором ацетона с массовой долей 90% После отгона ацетона из водно-ацетонового элюата гиббереллина получают 106 мл водного концентрата (3,13 гиббереллина по массе). Выход активного вещества на стадиях сорбции десорбции на угле составляет 55,9% Выход гиббереллина от содержания его в культуральной жидкости составляет 53,5%
По прототипу при всех прочих равных условиях выход гиббереллина по водному концентрату от содержания его в культуральной жидкости составляет 40,5% Увеличение выхода БАВ по предлагаемому способу по сравнению с прототипом составляет 32,1% (отн.).

Пример 2.

Фильтрат гиббереллина получают по примеру 1 и затем проводят сорбцию гиббереллина на неионогенный макропористый сорбент Поролас Т. Десорбцию активного вещества осуществляют водным раствором ацетона (с массовой долей 50% ). После отгона ацетона из элюата получают 215 мл водного концентрата (5,62 г гиббереллина по массе). Выход БАВ в водном концентрате от содержания гиббереллина в культуральной жидкости составляет 96,1% (по прототипу 40,5%).

Пример 3.

1500 мл гидролизата витамина B₁₂ (51,3 мг) пропускают через гетероцепной полимерный материал на основе полисульфона (ПС-50) со скоростью 25,5 л/м²ч. Получают 1875 мл фильтрата (51,04 мг). Выход витамина B₁₂ на стадии получения фильтрата составляет 99,5% Полученный фильтрат пропускает через карбоксильный катионит СГ-1М, сорбированный витамин B₁₂ десорбируют с катионита водным раствором аммиака с концентрацией 0,6-0,7 моль/л. Получают 275 мл аммиачного элюата витамина B₁₂ (49,5 мг). Выход БАВ на стадии сорбции-десорбции от содержания его в гидролизате составляет 97% Выход по прототипу 90% Увеличение выхода витамина B₁₂ по предлагаемому способу в сравнении с известным составляет 7,8% (отн.).

Пример 4.

3 л. культуральной жидкости эритромицина (10,56 млн. ед.) фильтруют под вакуумом и получает 6 л нативного раствора с промывными водами (10,03 млн. ед. ). Выход БАВ на стадии фильтрации культуральной жидкости составляет 95% Полученный нативный раствор эритромицина пропускают через гетероцепной полимерный материал на основе полисульфонамида (ПСА) со скоростью 21,4 л/м²ч. Получают 7,5 л. фильтрата (9,98 млн. ед.). Выход БАВ на стадии получения фильтрата составляет 99,5% Из полученного фильтрата проводят экстракцию целевого продукта бутилацетатом и получают 496 мл бутилацетатного экстракта эритромицина (9,48 млн.ед.). Выход БАВ на стадии экстракции составляет 95% Выход в бутилацетатном экстракте от содержания эритромицина в культуральной жидкости составляет 89,8% Выход по прототипу 67,9% Увеличение выхода эритромицина по предлагаемому способу по сравнению с известным составляет 32,2% (отн.)
Пример 5.

6,0 л нативного раствора окситетрациклина (50,6 млн. ед.) пропускают через гетероцепной полимерный материал на основе полисульфонамида (ПСА) с о скоростью 15,1 л/м²ч. Получают 7,62 л фильтрата антибиотика (50,3 млн.ед.). Выход окситетрациклина на стадии получения фильтрата составляет 99,5% Из полученного фильтрата осаждают цетазоловый комплекс антибиотика при pH=8,5, затем комплекс 6%-ный раствором щавелевой кислоты при pH=1,0-1,2. Получают 1830 мл концентрата окситетрациклина (47,85 млн. ед.) Выход антибиотика по концентрату разложенного комплекса от содержания окситетрациклина в нативном растворе составляет 94,6% (по прототипу 84,6%). Увеличение выхода антибиотика по предлагаемому способу в сравнении с известным составляет 11,8% (отн.).

Пример 6.

Фильтрат окситетрациклина, полученный по примеру 5, пропускают через неионогенный макропористый сорбент Поролас Т. Сорбированный антибиотик десорбируют водно-изопропанольным раствором. Получают 1,36 л водно-изопропанольного элюата окситетрациклина (43,7 млн. ед.). Выход антибиотика в элюате от содержания его в нативном растворе составляет 86,4% Из полученного элюата проводят осаждение основания окситетрациклина, минуя стадию осаждения промежуточного продукта цетазолового комплекса. Увеличение выхода антибиотика по сравнению с известным составляет 15% (отн.).

Пример 7.

3 л культуральной жидкости канамицина (8,67 млн. ед.) обрабатывают щавелевой кислотой, после чего фильтруют под вакуумом. Получают 5,5 л нативного раствора с промывными водами (8,32 млн. ед.) Выход на стадии фильтрации культуральной жидкости составляет 96% Полученный нативный раствор канамицина подщелачивают и фильтруют. Выход антибиотика на стадиях предварительной обработки и двойной фильтрации составляет 95% Отфильтрованный нативный раствор канамицина пропускают через карбоцепной полимерный материал на основе полиакрилонитрила (ПАН-20) со скоростью 27,2 л/м²ч. Получают 6,75 л фильтрата (7,87 млн. ед.). Выход на стадии получения фильтрата канамицина составляет 99,5% Из полученного фильтрата антибиотик сорбируют на катионит КБ-4П-2, затем десорбируют канамицин с катионита 2н. водным раствором аммиака. Получают 152 мл. аммиачного элюата (7,52 млн.ед.). Выход на стадиях сорбции-десорбции канамицина составляет 95,5% Выход антибиотика от содержания его в культуральной жидкости составляет 86,7% По прототипу выход канамицина составляет 73,5% Увеличение выхода канамицина по предлагаемому способу в сравнении с известным составляет 18,0% (отн.)
Пример 8.

6 л нативного раствора феноксиметилпенициллина (46,03 млн. ед.) пропускают через гетероцепной полимерный материал на основе полисульфонамида (ПСА) со скоростью 10,3 л/м²ч. Получают 7,5 л фильтрата феноксиметилпенициллина (45,8 млн. ед.). Выход антибиотика на стадии получения фильтрата составляет 99,5% Из полученного фильтрата антибиотик экстрагируют бутилацетатом, затем проводят реэкстракцию и вторую бутилацетатную экстракцию. Получают 625 мл бутилацетатного экстракта финоксиметилпенициллина (43,6 млн. ед.). Выход антибиотика на стадии экстракции составляет 95,2% от содержания его в фильтрате и 94,7% от содержания его в нативном растворе. Выход антибиотика по известной технологии в экстракте от нативного раствора до термической и кислотной обработок составляет 70,2% Увеличение выхода антибиотика по предлагаемому способу в сравнении с известным способом составляет 34,9% (отн.).

Пример 9.

1 л нативного раствора гентамицина (0,54 г) с содержанием органических примесей 23,7 мг/мл и белка 67,5 мкг/мл пропускают через гетероцепной полимерный материал на основе полисульфонамида (ПСА) со скоростью 21 л/м²ч. Получают 1,1 л фильтрата антибиотика (0,476 г) с содержанием органических примесей 20,9 мг/мл и белка 54 мкг/мл. Выход гентамицина на стадии получения фильтрата составляет 97,2% от содержания антибиотика в нативном растворе. Снижение содержания органических примесей и белка в фильтрате гентамицина составляет 12% и 20% соответственно. Полученный фильтрат антибиотика пропускают через катионит КБ-2, гентамицин десорбируют с катионита 2 н водным раствором аммиака. Получают 5,5 мл элюата антибиотика (0,45 г). Выход гентамицина в элюате от содержания его в нативном растворе составляет 83,3% по известному способу 58,2% Увеличение выхода антибиотика 43,1% (отн.).

Пример 10.

1 л нативного раствора сизомицина (0,34 г) обрабатывают аналогично примеру 9. Получают водно-аммиачный элюат сизомицина (0,32 г). Выход антибиотика в элюате от содержания его в нативном растворе составляет 94,0% по прототипу 87,6% Увеличение выхода антибиотика 7,3% (отн.).

Пример 11.

10 л нативного раствора феноксиметилпенициллина (75,0 млн. ед.) пропускают через гетероцепной полимерный материал на основе полисульфонамида (ПСА) со скоростью 18,6 л/м²ч. Получают 10,5 л фильтрата феноксиметилпенициллина (74,625 млн. ед. ). Выход антибиотика на стадии получения ультрафильтрата составляет 99,5% Из полученного фильтрата антибиотик осаждают раствором серной кислоты с массовой долей от 3 до 6% при pH от 2,0 до 2,3. Получают 46,3 г. технической ФМП-кислоты с активностью 1450 мкг/мг (67,16 млн. ед.). Выход на стадии осаждения 90% Техническую ФМП-кислоту перекристаллизовывают из водно-ацетоновой смеси. Получают 30 г ФМП-кислоты с активностью 1680 мкг/мг (50,4 млн. ед.), выход на стадии перекристаллизации 75% Выход от нативного раствора 67,2% Выход от культуральной жидкости 63,8% по известной технологии 55,0% Увеличение выхода в сравнении с известной технологией составляет 16% (отн).

Источники информации
1. Жуковская С.А. Медицинская промышленность СССР, 1966, N 3, с 18.

2. Кавати Сохэ, Вакадзава Тачаки, Япония патент N 10179 от 19.12.61. РЖХ. 1968, N 18П.

3. Linde H. Lohr W. ГДР патент N 31481 от 13.10.61, РЖХ, 1965, N 12П.

4. Жуковская С.А. Бойко И.Д. Медицинская промышленность СССР, 1964, N 1, с. 38.

5. Stroud S. W. Ransley Н.М.Р. ФРГ патент N 941686 от 19.04.56, РЖХ, 1958, N 6, с. 389.

6. Musil Grech 1959, 92034, Oct 15, CA 1960, 54, N 8, 79886.

7. Патент США N 2509010, 1950, Manyf. Chemist, 1950, 21, N 11, 501.

8. Верникова Л.М. Жуковская С.А. Антибиотики, 1968, N 11, с. 982-991.

9. Верникова Л.М. Жуковская С.А. Антибиотики, 1972, N 4, с. 375-382.

10. Верникова Л.М. Жуковская С.А. Антибиотики, 1974, N 8, с. 697-710, с. 795-8-1.

11. Верникова Л.М. Жуковская С.А. Антибиотики, 1978, N 4, с. 298-304.

12. А.с. СССР N 158391, кл. C 12 P 1/06, 1962 (прототип).

Использование: биотехнология, выделение биологически активных веществ. Сущность изобретения: способ выделения биологически активных веществ предусматривает фильтрацию культуральной жидкости, пропускание фильтрата через полисульфон или полисульфонамид или полиакрилонитрил и последующее выделение целевого продукта. 1 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Способ выделения биологически активных веществ, включающий фильтрацию культуральной жидкости и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что перед выделением целевого продукта фильтрат дополнительно пропускают через гетеро- или карбоцепной полимерный материал со скоростью 10 50 л/м² • ч. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве полимерного материала используют полисульфон, или полисульфонамид, или полиакрилонитрил.