СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВИРОВАННЫХ ЛИМФОЦИТОВ В КРОВИ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/48 G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологическим методам исследования, и касается выявления в организме человека активированных лимфоцитов.

Известен способ определения активированных лимфоцитов в крови, включающий в себя их культивирование вне организма в питательной среде с антигенами или митогенами и приготовление мазков для морфологического анализа [1] При этом за активированные принимаются лимфоциты, трансформированные в областные формы и митозы. Однако известный способ по своей сути является пробирочным методом, моделирующим иммунологическую ситуацию на какой-либо антиген, следовательно, он позволяет выяснить лишь потенциальную способность лимфоцитов к иммунному ответу, а не их реальную активность в организме человека. Результаты данного способа необходимо экстраполировать на организмный уровень, что еще больше снижает объективность способа.

Известен также способ определения активированных Т-лимфоцитов в крови человека, включающий культивирование лимфоцитов 48 54 ч в среде с митогеном фитогемагглютилином, активирующий преимущественно Т-лимфоциты, введение колхицина, останавливающего деление лимфоцитов на стадии метафазы, приготовление препаратов хромосом и их цитогенетический анализ [2] Данный метод основан на анализе в лимфоцитах, проходящих первое митотическое деление, ассоциаций акроцентрических хромосом, являющихся цитогенетическим седлом (признаком) их предшествующей пролиферации и миграции из периферических лимфоидных органов в организме человека. За активированные принимаются лимфоциты без ассоциаций и с двумя ассоциирующими акроцентриками, образовавшиеся в результате серии митотических делений, при которых разрушаются ассоциации. Данный метод является достаточно сложным (необходимо культивировать лимфоциты в стерильных условиях, останавливать деление клеток колхицином на стадии метафазы, т. к. хромосомы можно изучать только во время деления клеток); малодоступным для массового внедрения (необходимы дефицитные реактивы, дорогостоящее оборудование), а также требуется определенная квалификация исполнителя (знание культуры клеток, владение цитогенетическим методом). Данный метод также недостаточно объективный, так как в культуре часть лимфоцитов погибает, не все из живых лимфоцитов вступают в митотический цикл на период фиксации клеток, используемые митогены активируют определенную субпопуляцию из имеющихся лимфоцитов.

Целью изобретения является повышение объективности оценки, упрощение определения и сокращение времени анализа функциональной активности лимфоцитов непосредственно в организме человека.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе [2] включающем определение активности лимфоцитов по остаточным признакам их пролиферативной активности в лимфоидных органах, измеряют диаметр лимфоцитов в мазке, составляют их размерные классы и по количеству лимфоцитов диаметром 6,5 мкм и меньше 6,5 мкм определяют активированные лимфоциты.

Сопоставительный анализ заявленного решения с прототипом показывает, что заявляемый способ отличается от известного тем, что число активированных лимфоцитов определяется по наличию остаточных морфологических признаков их предшествующей пролиферативной активности в лимфоидных органах, путем анализа размерных классов лимфоцитов в мазке, приготовленном в период взятия крови на анализ. За активированные принимаются лимфоциты диаметром 6,5 и меньше 6,5 мкм. Следовательно, полученный образец крови не надо культивировать, кроме того, объем его минимальный и может быть 0,1 0,2 мл, позволяющий приготовить мазок крови и подсчитать количество лейкоцитов для перевода относительного количества активированных лимфоцитов в абсолютные величины, что значительно упрощает метод и делает его доступным для скренирующих обследований. Таким образом, заявляемое решение соответствует критерию "новизна".

Известно техническое решение [1] в котором активность лимфоцитов определяется по диаметру клеток, подвергшихся трансформации после стимуляции антигенами и митогенами в культуре, причем бластные клетки имеют больший диаметр по сравнению с неактивированными первичными малыми лимфоцитами. Кроме того, данное техническое решение позволяет выяснить лишь потенциальную способность лимфоцитов к иммунному ответу.

Неизвестны технические решения, в которых активность лимфоцитов в крови определяют по их минимальному диаметру. Лимфоциты приобретают морфологию очень малых лимфоцитов диаметром 6,5 мкм и меньше 6,5 мкм после стимуляции антигенами циркулирующих лимфоцитов в периферических лимфоидных органах, их бластной трансформации в крупные клетки, последующей серии митозов (6 10 раз), при которых объем цитоплазмы последовательно уменьшается за счет короткой интерфазы между делениями, не позволяющей восстановить исходный объем цитоплазмы. В итоге образуются клоны очень малых лимфоцитов, которые покидают лимфоидный орган и становятся доступными для анализа при взятии крови. Кроме того, неизвестны технические решения определения активированных лимфоцитов непосредственно в организме без их предварительного культивирования и стимуляции в пробирке. Определение активированных лимфоцитов без их предварительного культивирования и стимуляции антигенами и митогенами и установление зависимости с диаметром лимфоцитов в мазке крови не следует явным образом из известного уровня техники. Исходя из этого, изобретение соответствует требованию изобретательного уровня.

Способ осуществляется следующим образом. Проводят забор крови из пальца или вены, готовят мазок стандартным для гематологических исследований методом и окрашивают его по Романовскому-Гимза. В мазке, начиная от основания "усиков", измеряют диаметр лимфоцитов с помощью окуляр-микрометра. Лимфоциты диаметром 6,5 мкм и меньше 6,5 мкм являются активированными среди лимфоцитов в крови человека на момент взятия образца крови на анализ.

Основанием для утверждения, что субпопуляция циркулирующих лимфоцитов в пределах размерных классов 6,5 мкм и меньше активированная, является обнаруженная высокая (r=0,7-0,8) положительная корреляция этой доли лимфоцитов с частотой классов лимфоцитов без ассоциаций и с двумя ассоциирующими акроцентриками. Согласно сравниваемым прототипам указанные цитогенетические классы лимфоцитов также являются активированными антигенами, образовавшимися в периферических лимфоидных органов после серии митотических делений при иммуногенезе. Высокая положительная корреляция сравниваемых показателей, полученных разными способами, свидетельствует об однородности анализируемых субпопуляций лимфоцитов среди циркулирующих лимфоцитов. Эти субпопуляции входят в состав постпролиферативного пула лимфоцитов, генерируемых в периферических лимфоидных органах при иммуногенезе на многочисленные антигены и аутоантигены, имеющиеся в организме, следовательно, эти лимфоциты являются активированными. Активированные субпопуляции лимфоцитов мигрируют из периферических лимфоидных органов после серии митотических делений (6 10 раз) в ответ на антигенный стимул и становятся доступными для анализа при взятии крови. При движении хромосом при митозе разрушаются ассоциации акроцентрических хромосом или их остается минимальное количество, то есть они составляют классы лимфоцитов без ассоциаций и с двумя ассоциирующими акроцентриками (КЛО+2), которые тестируются в крови известным цитогенетическим методом [2] Кроме того, в последовательно профилирующих лимфоцитах уменьшается объем клетки за счет короткой (6 8 ч) интерфазы, при которой дочерние клетки не успевают восстановить объем цитоплазмы и количества в ней органоидов. В длительно циркулирующих лимфоцитах (дни, недели, месяцы) объем клетки восстанавливается в пределах их тканевой и видовой нормы реакции. Следовательно, вновь образовавшиеся активированные лимфоциты будут иметь наименьший диаметр не более 6,5 мкм клетки по сравнению с неактивированными длительно циркулирующими и тестируются в мазке крови с помощью заявляемого способа. Объем постпролиферативного пула лимфоцитов, выделяющийся из периферических лимфоидных органов, колеблется в зависимости от антигенной нагрузки, физиологического состояния организма, влияния факторов внешней среды, конституциональных особенностей организма.

Пример конкретного выполнения.

Излучалась частота активированных лимфоцитов с помощью заявленного способа и прототипа у следующих контингентов лиц:
1. Здоровые доноры 21 26 лет (6 человек);
2. Больные неврозами при поступлении на лечение в течение разгрузочной диетотерапии (употребление только минеральной воды, 10 человек);
3. Хирургические больные до общей анестезии и спустя 1 час после нее (6 человек).

Приведенные в таблице данные показывают, что только размерные классы 6,5 мкм и меньше 6,5 мкм положительно в высокой степени коррелируют с цитогенетическими показателем и активности лимфоцитов (КЛО+2), тогда как с другими размерными классами корреляции была отрицательной или отсутствовала. Учитывая, что цитогенетический показатель активности лимфоцитов является доказанным фактом, то его высокая прямая корреляция с размерными классами лимфоцитов 6,5 мкм и меньше 6,5 мкм позволяет считать эти морфологические классы лимфоцитов также активированными. Примечательно, что количество активированных лимфоцитов, выявленное с помощью предлагаемого морфологического критерия, выше, чем с помощью цитогенетического теста, что указывает на большую объективность выявления общего количества активированных лимфоцитов в циркулирующем пуле лимфоцитов заявляемым способом.

Полученные показатели активированных лимфоцитов и изученных контингентов лиц соответствуют конкретным иммунологическим ситуациям. У здоровых доноров частота классов 6,5 мкм и меньше 6,5 мкм равняется 45,4% У больных неврозами на фоне абсолютного голодания частота активированных лимфоцитов в периферической крови значительно снижается до 29,7% в связи с их депонированием в шоковых органах (желудочно-кишечный тракт) и частично за счет угнетения образования в периферических лимфоидных органах. У больных до общего наркоза доля активированных лимфоцитов по цитоморфометрическому показателю составляла 32,7% а спустя 1 час после него 62,8% Такой значительный сдвиг показателей за столь короткий промежуток времени (1 ч) можно объяснить только нарушением миграции активированных лимфоцитов и их нормального распределения между системами органов.

Таким образом, по динамике размерных классов лимфоцитов в периферической крови можно оперативно контролировать интенсивность пролиферации и миграции активированных лимфоцитов, относящихся к клеткам с диаметром до 6,5 мкм, их перераспределение в организме к местам депонирования антигенов, изучать напряженности иммунитета и его корреляцию с помощью иммунотропной терапии.

Источники информации
1. Е.Ф.Чернушенко, Л.С.Когосова, С.И.Гончарова и др. Унифицированные иммунологические методы обследования больных на стационарном и амбулаторном этапах лечения. Методические рекомендации. Киев. 1988. 18 с.

2. А.К.Фролов, В.К.Фролов. Способ определения активированных Т-лимфоцитов в крови. А.С. N 1024838 (прототип).

Использование: в области медицины, в частности в иммунологии. Сущность изобретения: проводят забор крови, и в мазке крови, который готовят стандартным методом для определения формулы крови, измеряют диаметр лимфоцитов, составляют их размерные классы, и по количеству клеток с диаметром до 6,5 мкм и меньше определяют активированные лимфоциты. Способ позволяет повысить объективность, оперативность и доступность и определения лимфоцитов крови непосредственно в организме человека. 1 табл.

Способ определения активированных лимфоцитов в крови, включающий забор крови, приготовление мазка стандартным методом для определения формулы крови, окрашивание его по Романовскому Гимза и исследование, отличающийся тем, что измеряют в мазке с помощью окулярмикрометра диаметры лимфоцитов, составляют их размерные классы и по количеству лимфоцитов диаметром 6,5 мкм и меньше определяют активированные лимфоциты.