ДИПИРИДАМОЛ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПРОЛИФЕРАТИВНЫХ БОЛЕЗНЕЙ Российский патент 1997 года по МПК A61K31/505 

Настоящее изобретение относится к локальной доставке дипиридамола для лечения пролиферативных болезней.

Пролиферативные болезни, такие, как сосудистый рестеноз, склеродермия, псориаз и ревматоидный артрит, являются проявлением фундаментального механизма избыточного разрастания клеток в специфичной ткани или органе. В каждом из этих заболеваний избыточное разрастание клеток в значительной степени вносит вклад в патогенез болезни.

Например, сосудистый рестеноз отличается реокклюзией коронарных артерий после чрескожной чреспросветной коронарной пластической операции на сосудах, удаления склеротических бляшек, лазерной ангиопластики и хирургического вживления дополнительных артерий. Реокклюзия коронарных артерий вызвана частично избыточным разрастанием гладких мышечных клеток сосудов. См. статью "Внутреннее разрастание клеток гладкой мускулатуры, как объяснение рецидива коронарного артериального стеноза после чрескожной чреспросветной пластической операции на коронарных сосудах" авторов Austin et al. Journal of the American College of Cardiology 6: 369-375, (авг. 1985).

Сосудистый рестеноз остается главным длительным осложнением после хирургического вмешательства по поводу закупоренных артерий при чрескожной и чреспросветной пластической операции на коронарных сосудах, при артериотомии, при лазерной ангиопластике и при хирургическом вживлении дополнительных артерий. Примерно у 35% больных, перенесших чрескожную, чреспросветную пластическую операцию на сосудах, повторная закупорка происходила в пределах от трех до шести месяцев после операции. Применяемые сейчас методы лечения сосудистого рестеноза включают механическое вмешательство с помощью таких устройств, как стенты, либо фармакологические виды терапии, включающие гепарин, низкомолекулярный гепарин, кумарин, аспирин, рыбий жир, кальциевый антагонист, стероиды и простациклин. Эти методы не могут сдержать нарастание повторной закупорки и оказываются неэффективными для лечения и предотвращения сосудистого рестеноза. См. статью "Предотвращение рестеноза после чрескожной чреспросветной пластической операции на коронарных сосудах: Поиск волшебной пули", авторов Hermans et al. American Heart Journal, 122: 171-187 (июль 1991). Чрезмерное разрастание фибробластных и мезенхимальных клеток сопровождается ревматоидным артритом и псориазом. Воспалительный процесс, которым отличается ревматоидный артрит, приводит к выделению факторов роста, вызывающих активное разрастание мезенхимных клеток. Это разрастание связано с образованием избыточных количеств ферментов, способных разрушить соединительные ткани, окружающие сустав. Фармакологические средства, подавляющие реакцию разрастания, могут быть эффективными при подавлении некоторых разрушительных сил ревматоидного артрита. См. "Последние достижения в понимании патогенеза пролиферативного повреждения ревматоидного артрита", автора Harris Arthritis and Rheumatism, 19: 68-72 (январь февраль 1976).

Склеродермия (системный склероз) представляет собой многосистемное заболевание, поражающее главным образом сосудистую, кожную, опорно-двигательную, желудочно-кишечную, дыхательную, сердечную и почечные системы. Считается, что видимые рассеянные клинические признаки системного склероза связаны с выраженным сосудистым поражением в различных органах, оказавшихся мишенью. Это поражение сосудов имеет воспалительную, пролиферативную и затвердевательную фазы и явно связано с разрастанием фибробласт и клеток, способных к фибробластной активности.

Контроль этого механизма фиброластного активирования и разрастания может быть полезным при лечении или при профилактике системного склероза. См. "Патогенез системного склероза: Сосудистая гипотеза", авторов Campbell et al. Seminars in Arthritis and Rheumatism, 4: 351-368 (май, 1975).

При патогенезе пролиферативных болезней избыточное разрастание клеток происходит в результате присутствия различных факторов роста и цитокинов, таких, как фактор роста, полученный из тромбоцитов, эпидермальный фактор роста, фибробластный фактор роста и интерлейкин-1 (IL-1). Например, факторы роста, продуцируемые клеточными составляющими в крови и поврежденной стенкой артериального сосуда, являются промежуточным звеном при пролиферации гладких мышечных клеток при сосудистом рестенозе. Новый способ введения дипиридамола для подавления роста, является поэтому полезным для лечения пролиферативных болезней, таких, как псориаз, ревматоидный артрит, склеродермия и сосудистый рестеноз. The American Journal of Medicine, 70, 1231-1236 (июнь 1981).

Дипиридамол обычно предписывают в качестве противотромбоцитного или фосфодиэстеразного ингибитора. Он был исследован независимо или в сочетании с аспирином и/или простациклином для лечения сосудистого рестеноза. Результаты этих исследований наглядно показали, что дипиридамол при системном введении неэффективен для лечения или профилактики сосудистого рестеноза у больных. Hermann et al. American Heart Journal, 122: 177-187 (июль, 1991), Harker et al. Arteriosclerosis, 10: 828а (сентябрь-октябрь, 1990) and FitzGerald, The New England Journal of Medicine, 316: 1247-57 (май, 1987). Применение дипиридамола для лечения рестеноза было неэффективным в этих исследованиях из-за системного способа введения. Сыворотка крови снижает эффективность системно введенного дипиридамола в качестве ингибитора разрастания клеток.

Только при наблюдении влияния сыворотки крови на системновведенный дипиридамол стало наконец возможным исследовать применение дипиридамола в качестве антипролиферативного средства. В изобретении описана локальная доставка дипиридамола в качестве способа ингибирования разрастания клеток и его полезность для лечения пролиферативных болезней, таких, как рестеноз, склеродермия, псориаз и ревматоидный артрит.

Настоящее изобретение обеспечивает способ ингибирования разрастания клеток в млекопитающих, который содержит локальную доставку ингибиторного количества дипиридамола.

Дипиридамол является хорошо известным соединением, широко применяемым в качестве коронарного вазодилататора. The Merck Index Tenth Edition 3366 (1983). Его химическим названием является 2,6-бис-(диэтанол-амино)-4,8-дипиперидинопиримидо [5,4-d] пиримидин. Его получение описано в патенте Великобритании 807826 (1959, Thomae).

Локальную доставку ингибиторного количества дипиридамола для лечения клеточной пролиферации можно осуществить множеством способов, которыми вводят дипиридамол в месте или вблизи места разрастания. Примеры способов локальной доставки предназначены не для того, чтобы ограничивать, а для того, чтобы иллюстрировать доступные способы. Примеры включают катетеры для локальной доставки, специфические местные носители, имплантаты, прямые инъекции или непосредственные применения.

Локальная доставка с помощью катетера позволяет внести фармацевтический агент непосредственно в область пролиферативного поражения. Примеры локальной доставки с использованием катетер-баллона описаны в Европейской патентной заявке 383492 А2 и в патенте США 4636195 (Wolinsky, 13 января 1987).

Локальная доставка с помощью имплантата включает хирургическое помещение матрицы, содержащей фармацевтический агент, внутрь пролиферативного повреждения. Имплантированная матрица высвобождает фармацевтический агент при диффузии, химической реакции или под действием растворителя Langer Science, 249: 1527-1533 (сентябрь, 1990). Примером локальной доставки с помощью имплантата является использование стента. Стенты сконструированы так, чтобы механически предотвратить коллапс и повторную закупорку коронарных артерий. Включение фармацевтического агента в стент позволяет доставлять лекарство непосредственно в место разрастания. Локальная доставка с помощью этого способа описана в ссылке Kohn, Pharmaceutical Technology (октябрь, 1990). Вторым примером является система доставки, в которой полимер, содержащий фармацевтический агент, вводят внутрь повреждения в жидком виде. Затем полимер затвердевает, образуя имплантат на месте. Этот способ описан в PCT WO 90/03768. (Donn, 19 апреля 1990). Другим примером является доставка фармацевтического средства с помощью полимерного внутрипросветного герметика. В этом способе используют катетер для нанесения полимерного имплантата на внутреннюю поверхность полости сосуда. Фармацевтический агент, включенный в биодеградируемый полимерный имплантат, благодаря этому высвобождается в хирургическом месте. Способ описан в PCT WO 90/01969. (Schindler, 23 августа, 1989). Последним примером локальной доставки с помощью имплантата является непосредственная инъекция пузырьков или микрочастиц в пролиферативное место. Эти микрочастицы могут состоять из таких веществ, как протеины, липиды, углеводы или синтетические полимеры. Эти микрочастицы содержат включенный в них фармацевтический агент, который может быть распределен по всей микрочастице либо по поверхности микрочастицы как покрытие. Системы доставки с применением микрочастиц описаны у Lange, Science Science: 249: 1527-1533 (сентябрь, 1990) и Mathiowitz et al. J. App. Poly Sci. 26: 809 (1981).

Описана локальная доставка с помощью специфических для места носителей, где фармацевтический агент присоединяют к носителю, который направляет или присоединяет лекарство к пролиферативным клеткам. Примеры этого способа доставки включают применение носителей, таких, как протеиновый лиганд или моноклональное антитело или мембрана с закрепленным линкером. Lange, Science 249: 1527-1533 (сентябрь, 1990), Langworth, Genetic Engineering News (сентябрь, 1990).

Локальная доставка путем непосредственного нанесения включает использование местных применений. Примером локальной доставки путем непосредственного применения является нанесение фармацевтического агента непосредственно на артериальный вживленный дополнительный канал во время хирургической процедуры.

Локальная доставка путем прямой инъекции включает инъекцию мелких частиц дипиридамола, суспендированных в инертном носителе, в таком, как стерильный солевой раствор, непосредственно внутрь места разрастания.

Дозировка дипиридамола, которая нужна для получения терапевтического эффекта, зависит от способа введения и от конкретных обстоятельств больного. Терапевтическая дозировка дипиридамола представляет собой количество достаточное для ингибирования разрастания клеток. Предпочтительный диапазон дозировок составляет от примерно 1 мкг/день до примерно 100000 мкг/день, введенных в месте или вблизи места пролиферации.

Термин "обработка" включает введение соединения по настоящему изобретению, чтобы предотвратить начало симптомов смягчить проявление симптомов, или исключить болезнь, состояние или нарушение.

Микрочастицы для использования вместе с катетером для локальной доставки можно приготовить, используя следующие составные части: биологическое поверхностно-активное вещество (0,1 -3% по объему), декстроза (2 5% по объему), дипиридамол (измельчен до частиц размером 2 10 микрон, 0,1 10 мг/мл) и вода.

Вышеуказанные компоненты смешивают и инжектируют внутрь пролиферативного повреждения. Следующий пример состава для локальной доставки дипиридамола приведен только для иллюстрации и не предназначен никоим образом ограничивать объем изобретения.

Микрочастицы приготовили, используя указанные ниже компоненты:
полиоксиэтиленсорбит 2% (по объему)
Декстроза 5% (по объему)
Дипиридамол (измельченный) 250 мг
Вода 50 мл
Микрокапсулы инжектировали внутрь пролиферативного повреждения с помощью катетера.

Важным аспектом настоящего изобретения является локальная доставка дипиридамола, чтобы предотвратить пролиферацию клеток. Клеточную пролиферацию можно вызвать с помощью цитокинов, таких, как интерлейкин-1 (IL-1) или множественные факторы роста, такие, как фактор роста тромбоцитного происхождения, эпидермальный фактор роста и/или фибробластный фактор роста.

Предыдущие попытки использовать дипиридамол для лечения рестеноза были неэффективными из-за системного метода введения. Системное введение включает способы доставки, при которых фармацевтический агент вводят в весь организм. Примеры системной доставки включают оральное и внутривенное введение.

Сыворотка крови снижает эффективность системно введенного дипиридамола в качестве ингибитора пролиферации клеток. Влияние сыворотки на антипролиферативную активность дипиридамола было продемонстрировано следующим образом: гладкие мышечные клетки из аорты кролика (полученные способом эксплантата, как описано в ссылке Ross, Journal of Cell Biology, 50: 172 (1971) посадили в 96-ячейные чашки для выращивания культуры в среде Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), содержащей 10% бычьей эмбриональной сыворотки (Gibco Laboratories Grand Island, Нью-Йорк), 2 миллимоль/л L-глутамина, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Выращивание прекратили, соединенные культуры в 96 ячейках микротитровальных чашках инкубировали в среде, содержащей 1% 5% или 20% сыворотки (Hyclone Laboratories, Logan, Юта), 2 миллимоль/л L-глутамина, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, 40 нг/мл фактора роста тромбоцитного происхождения (Genzyme, Кембридж, Миннесота), 1 микрокюри/ил ³H тимидина (Дюпон, Бостон, Миннесота) и указанные концентрации дипиридамола (Sigma Chemical, Сан-Луи, Миссури). Клетки инкубировали при 37^oC в течение 24 часов в атмосфере 5% CO₂/95% воздуха. В конце 24 часов клетки зафиксировали в метаноле и определили синтез ДНК по включению ³H тимида, как описано в ссылке Bonin et al. Exp. Cell Res. 181, 475-482 (1989). Таблица 1 наглядно показывает, что возрастающие концентрации сыворотки ослабляют эффект ингибирования роста, обусловленный дипиридамолом.

Влияние системно введенного дипиридамола на пролиферацию клеток было продемонстрировано следующим образом.

Баллонное повреждение левых общих сонных артерий самцов крыс Sprague-Dawley (350-400 г) осуществили путем трех проходов надутого катетера-баллона 2 г. Fogauty (Baxter Healthcare, MeGaw Park, Иллинойс), как описано в ссылке Clowes et al. Lab. Invest, 49: 208-215 (1983). Животных анестезировали с помощью кетамина (Ketamine (80 мг/кг, внутримышечно, Aveco, Ft Dadge 1A) и ромпуна (Rompun) (16 мг/кг, внутримышечно, Hobay Corp. Shawnee, Канзас). Вход катетера-баллона в левую общую сонную артерию сделали через прорезь в наружной сонной артерии, которую завязали в конце хирургической операции. Дипиридамол системно вводили в течение двух недель (0,03 и 0,10% вес/вес в виде добавки к еде, соответственно, эквивалентно примерно 30 и 100 мг/кг/день). Никакого существенного влияния на внутреннее утолщение в поврежденных баллоном сонных артериях не наблюдали, как это показано в таблице 2.

Эффект по настоящему изобретению, заключающийся в подавлении клеточной пролиферации и внутреннего утолщения при локальной доставке дипиридамола был наглядно продемонстрирован в исследованиях. Следующие примеры иллюстрируют настоящее изобретение, и они не должны его ограничивать.

Пример 1
Катетерное повреждение сонных артерий
Катетерное повреждение левых общих сонных артерий самцов крыс Sprague-Dawley 350-400 г) осуществили путем трехкратного пропускания надутого катетера-баллона 2F Focarty, как описано в ссылке Clowes et al. Lab. Invest, 49: 208-215 (1983). Животных анестезировали с помощью кетамина (Ketamine) (80 мк/кг, внутримышечно) и ромпуна (Rompun) (16 мг/кг, внутримышечно). Впуск катетера-баллона в левую общую сонную артерию сделали через разрез во внешней сонной артерии, которую завязали в конце хирургической операции. Непрерывную локальную доставку дипиридамола осуществляли с помощью миносмотического насоса, имплантированного под кожу на спине крысы. Насосы заправили перед операцией, имплантировали сразу после катетерного повреждения. Дозированные растворы доставляли в добавочное (внешнее) пространство, окружающее поврежденную сонную артерию, через микро-ренатановый катетер (MRE-40 Baxter Healthcare Santa Ana, Калифорния) при скорости 5 мкл в час. Катетер пришили на месте с помощью двух лигатур (шелк 4-0) к левой внешней сонной артерии.

Через четырнадцать дней после операции животных анестезировали (см. выше) и перфузировали через абдоминальную аорту катаболическим образом при физиологическом давлении с пункт цинк-формалиновым фиксатором (Anatech, LTD) Battle Creek, M1). Средние части (5 мм) сонных артерий удалили из животных, обработали и залили в парафин. Срезали по три смежных поперечных среза (толщиной 5 мкм) от каждого сосуда, окрасили гематоксилином и эозином, и внутренние зоны поперечного сечения анализировали с помощью анализатора изображения Quantimet 970, Cambridge Inst. Cambridge, Великобритания).

Различие между внутренними зонами, обработанными лекарством, и контрольными группами анализировали для выявления статистической характеристики, используя т-тест Стьюдента, описанного в ссылке Tallarida et al. Manual of Pharmacologic Calculations with Computer Programs, Springer-Verlag, 1981, p. 51. Значения P ниже, чем 0,05 принимали за проявление статистической характеристики. Результаты показаны в таблице 3.

Пример 2
Дипиридамол также ингибирует разрастание клеток мезенхимного происхождения. Ингибирование фибробластного роста дипиридамолом показано следующим образом: 20000 фибробластов BaIo/cЗТЗ (Американская коллекция типов культур тканей, CCL-163) посадили в 12-ячеистые чашки для культуры ткани в 3 мл DMEM, содержащего 5% сыворотку бычьего эмбриона, 2 миллимоль/л L-глутамина, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, и проводили выращивание в течение 18-24 часов. Затем клетки перенесли в вышеуказанную среду, содержащую указанные концентрации дипиридамола. Через три дня рост клеток определяли путем подсчета, используя счетчик Коултера ZM (Coulter Diagnostic, Inc.) (См. табл. 4).

Пример 3
Дипиридамол ингибирует пролиферацию гладких мышечных клеток, вызванную множественными факторами роста. Гладкие мышечные клетки из аорты кролика (полученные эксплантатным методом) посадили в 96-ячеистые чашки для культуры ткани в DMEM, содержащий 10% сыворотку бычьего эмбриона, 2 миллимоль/л L-глутамина, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Рост остановили, слитые культуры в 96-ячеистых микротитровальных чашках инкубировали в среде, содержащей 1%-ю плазму с низким содержанием тромбоцитов, 2 миллимоль/л L-глутамина, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 20 нг/мл фактора роста тромбоцитного происхождения, 3 нг/мл эпидермального фактора роста (Genzyme), 3 нг/мл фибробластного фактора роста (Genzyme), 1 микрокюри/мл ³H тимидина и указанные концентрации дипиридамола. Клетки инкубировали при 37^oC в течение 24 часов в атмосфере 5% CO₂/95% воздуха. Через 24 часа клетки зафиксировали в метаноле. Синтез ДНК определяли по включению ³H тимидина, как описано ранее. Результаты в таблице 5 показывают, что дипиридамол ингибирует пролиферацию клеток, вызванную фактором роста тромбоцитного происхождения, фибробластного фактора роста и эпидермального фактора роста.

Способ ингибирования пролиферации клеток млекопитающих, который содержит локальную доставку ингибиторного количества дипиридамола. Ингибирование пролиферации клеток полезно для лечения пролиферативных болезней, таких, как сосудистый рестеноз, склеродермия, псориаз и ревматоидный артрит. Этот способ включает локальную доставку дипиридамола к пролиферативному месту различными способами, включая катетеры локальной доставки, специфические для места носители, имплантаты, прямую инъекцию или прямое применение. 6 з.п. ф-лы, 5 табл.

1. Способ ингибирования пролиферации клеток различных тканей млекопитающего, отличающийся тем, что используют дипиридамол, обеспечивая поступление ингибирующего количества препарата в зону пролиферации. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что воздействие осуществляют на гладкие мышечные клетки сосудов. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что пролиферацию клеток индуцируют фактором роста тромбоцитарного происхождения, эпидермельным фактором роста и/или фибробластным фактором роста. 4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в условиях целостного организма локальную доставку препарата в зону пролиферации осуществляют с помощью катетера. 5. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в условиях целостного организма локальную доставку в зону пролиферации осуществляют с помощью имплантата. 6. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в условиях целостного организма локальную доставку в зону пролиферации осуществляют с помощью прямой инъекции. 7. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в условиях целостного организма локальную доставку осуществляют с помощью мембраны с закрепленным линкером.