СПОСОБ ПОДГОТОВКИ БИОЛОГИЧЕСКОГО ОБРАЗЦА К ГИСТОЛОГИЧЕСКОМУ ИССЛЕДОВАНИЮ Российский патент 1997 года по МПК G01N1/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к гистологическим исследованиям биологических образцов тканей, взятых у человека или животных при хирургических вмешательствах или при аутопсии.

Обычная подготовка тканей к гистологическим исследованиям включает парафинирование образца ткани, получение среза парафинированного образца, укрепление его на предметном стекле и окрашивание. Парафинирование образца необходимо для предотвращения сминания тканей при получении среза и сохранения исследуемых тканевых и клеточных структур. Однако парафинирование тканей требует предварительного обезвоживания, т.к. содержащие воду ткани плохо или совсем не пропитываются парафином.

Обезвоживание тканей производят в жидкости, смешивающейся с водой; затем такую жидкость нужно заменить растворителем парафина, способным смешиваться с обезвоживающей жидкостью. Обычная процедура обработки тканей включает выдерживание их в нескольких порциях обезвоживающей жидкости с последующим выдерживанием в нескольких порциях растворителя парафина и занимает от 12 до 72 ч в зависимости от используемых пар жидкостей, свойств биологической ткани, размеров исследуемого образца и других условий.

Известен способ [1] подготовки биологического образца к гистологическому исследованию, включающий последовательное вымачивание образца в порциях 70% этилового спирта в течение 16 ч, 85% этилового спирта в течение 8 ч, 95% этилового спирта в течение 16 ч, 100% этилового спирта в течение 2 ч, смеси 100% этилового спирта с бензилом в соотношении 1:1 в течение 1 ч, в двух порциях бензола по 30 мин и последующее парафинирование. В качестве растворителя парафина, кроме бензола, можно использовать толуол, ксилол, петролейный эфир, сероуглерод, хлороформ и четыреххлористый углерод.

Кроме очень большой длительности обезвоживания (43 ч), способ [1] имеет тот недостаток, что все используемые в нем растворители парафина вредные вещества, особенно при постоянной с ними работе, поскольку их вредность имеет кумулятивный характер.

Также известен способ [2] подготовки биологических образцов к гистологическому исследованию, включающий обезвоживание путем четырехкратной выдержки в течение 20 минут в порциях свежего ацетона с последующими выдержками в бензоле и парафинированием.

Однако такой ускоренный способ применим только в случае, когда требуется экспресс-анализ, поскольку обработка ацетоном приводит к значительному нарушению тканевых и клеточных структур. Кроме того, ацетон не менее вреден, чем бензол или хлороформ.

Также известен способ [3] подготовки биологических образцов к гистологическому исследованию, включающий обезвоживание образцов 1,4-диэтиленоксидом (диоксаном) и последующее парафинирование. Диоксан одинаково хорошо смешивается как с водой, так и парафином, поэтому нет необходимости в обработке вторым растворителем для вытеснения обезвоживающего агента перед парафинированием, что заметно упрощает процесс.

Недостатком способа [3] является токсичность диоксана, имеющая к тому же кумулятивный характер, а также тот факт, что исследователь быстро перестает ощущать запах диоксана, что приводит к отравлениям.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу является способ [4] подготовки биологических образцов к гистологическому исследованию, включающий обезвоживание образца в среде 99% изопропилового спирта с последующим его парафинированием. Как показано в [4] образцы можно подвергать парафинированию непосредственно после обезвоживания в изопропиловом спирте, не вытесняя его растворителем, хорошо смешивающимся с парафином, что значительно упрощает и удешевляет процесс.

Однако наши исследования показали, что при полном пропитывании парафином образца, обработанного по способу [4] на срезах наблюдается слабое расслоение коллагена и небольшие изменения жировой ткани по сравнению с образцами той же ткани, обработанными классическим способом [1] При исследовании образцов тканей, полученных при хирургических вмешательствах или при патолого-анатомических исследованиях подобные изменения, вызванные несовершенством способа, могут привести к неправильным выводам о состоянии ткани и вызвавших его причинах.

Целью предлагаемого изобретения является сохранение тканевых и клеточных структур биологического образца в процессе его подготовки к гистологическому исследованию при сохранении высокой производительности этого процесса.

Указанная цель достигается тем, что в способе подготовки биологических образцов к гистологическим исследованиям, включающем обезвоживание образца в изопропиловом спирте с последующей пропиткой образца парафином, в используемый для обезвоживания изопропиловый спирт вводят поверхностно-активное вещество в количестве 0,01-0,5 мас. В качестве поверхностно-активного вещества (ПАВ) лучше использовать неионогенные ПАВ, такие как оксиэтилированные эфиры ангидросорбита и жирных кислот, алкилфеноловые эфиры полиэтиленгликолей и др. однако возможно использование катионных ПАВ, таких как алифатические амины (моноалкиламины), диаминодиолеат или алкилтриметиламмонийхлорид, и анионных ПАВ, таких как кальций алкилбензосульфонат. Ограничением в выборе ПАВ служит растворимость этих веществ в изопропиловом спирте. Наилучший результат достигнут при использовании алкилфеноловых эфиров полиэтиленгликолей или оксиэтилированных эфиров ангидросорбита и жирных кислот.

Алкилфеноловые эфиры полиэтиленгликолей производит немецкая фирма Merck Co, например монооктилфениловый эфир полиэтиленгликоля общей формулы C₁₄H₂₁O(C₂H₄O)_nH, где n=9-10, под наименованием Triton X-100.

Оксиэтилированные эфиры ангидросорбита и жирных кислот производит американская фирма Sigma Chemical Co; полиоксиэтилен(20)сорбитанмонолаурат выпускается ею под наименованием Tween-20, полиоксиэтилен(20)сорбитанмоноолеат под наименованием Tween-80.

Концентрация ПАВ в изопропиловом спирте должна быть 0,01-0,5 мас. При более низкой или более высокой концентрации ПАВ эффект не достигается.

Используемый в предлагаемом изобретении изопропиловый спирт выпускается промышленностью (ТУ 6-09-402-85).

Нами использовался гомогенизированный парафин с температурой плавления около 56^oC, также выпускающийся промышленностью (ТУ 6-09-4112-75).

Для подготовки образцов к гистологическим исследованиям может быть использовано любое обычно применяемое лабораторное оборудование, в том числе выпускающиеся промышленностью установки.

Обработанные согласно предлагаемому способу образцы сравнивали с обработанными по способу [4]
Пример 1 (контрольный). Фрагменты кожи человека размером 1,0х1,0х0,5 см взяты при вскрытии с передней поверхности брюшной стенки. Фрагменты фиксированы в 4% растворе формальдегида в фосфатном буфере в течении 24 ч и отмыты проточной водой в течении 30 мин. Для обезвоживания фрагменты кожи последовательно выдерживали в 4-х сменах 99% изопропилового спирта по 3 часа в каждой смене. Обезвоженные фрагменты пропитаны парафином (T_пл.=56^oC) выдержкой в двух сменах расплавленного парафина по 2 ч.

Срезы толщиной 5 мкм изготавливали с помощью санного микротома. Помещенные на предметное стекло срезы депарафинировали в 2-х сменах ксилола, окрашивали гематоксилином-эозином и трихромом по Массону. Срезы исследовали под микроскопом при увеличении от 40Х до 1200Х.

Состояние образца хорошее, то есть при полном пропитывании парафином наблюдается, однако, слабое расслоение коллагена и небольшие изменения жировой ткани.

Примеры 2-5. Образцы той же кожи, что и в примере 1, обезвоживали в 99% изопропиловом спирте, в который были добавлены ПАВ тип ПАВ и его количество указаны в таблице.

Парафинирование, приготовление срезов, их обработка и исследование как в примере 1. Результаты микроскопического исследования приведены в таблице.

В таблице степень сохранности структуры тканей в срезах оценивалась в баллах. При этом отсутствие повреждений тканевых и клеточных структур оценивали в 5 баллов; возникновение повреждений, не препятствующих оценке структур, оценивали в 4 балла; существенные повреждения, местами искажающие структуру некоторых тканей в образце, оценивали в 3 балла; выраженные повреждения тканей, делающие образец малопригодным для исследования оценивали в 2 балла.

Как видно из таблицы, ткани, подготовленные заявляемым способом, сохраняют тканевые и клеточные структуры изучаемого образца, что исключает появление диагностических ошибок, приводящих к неправильным выводам о состоянии тканей и вызвавших его причинах.

Источники информации
1. Р. Лилли Патогистологическая техника и практическая гистохимия. M. Мир, 1969, гл. 4.

2. Там же.

3. Tannenberg. Am.J.Clin. 1949, 19, p. 1061.

4. Hauser. Mikroscopie, 1952, I, p. 208 прототип.

Использование: в медицине, в частности в гистологии и может применяться в гистологических исследованиях биологических образцов (тканей, органов), взятых у человека или животных при хирургических вмешательствах или при аутопсии. Сущность изобретения: исследуемый образец обезвоживают в изопропиловом спирте с последующим его парафинированием. При этом в изопропиловый спирт добавляют 0,01-0,5 мас. % поверхностно-активного вещества, преимущественно неионогенного. Способ позволяет сохранить тканевые и клеточные структуры образца в процессе его подготовки к гистологическому исследованию. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ подготовки биологического образца к гистологическому исследованию, включающий обезвоживание образца в изопропиловом спирте с последующим пропитыванием обезвоженного образца парафином, отличающийся тем, что в используемый для обзвоживания изопропиловый спирт вводят поверхностно-активное вещество в количестве 0,01 0,5 мас. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве поверхностно-активного вещества используют неионогенное поверхностно-активное вещество.