СПОСОБ ОБРАБОТКИ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ Российский патент 2003 года по МПК G01N1/28 G01N1/30 

Предполагаемое изобретение относится к способам диагностики, а именно к способу подготовки гистологических и биологических образцов для микроскопического исследования.

Обычная подготовка тканей к гистологическим исследованиям включает парафинирование образца ткани, получение среза парафинированного образца, укрепление среза на предметном стекле, растворение парафина, окрашивание среза и заключение в оптическую среду. Подготовленный таким образом образец исследуют под микроскопом. Парафинирование образца необходимо для предотвращения сминания ткани при получении среза и сохранения исследуемых тканевых и клеточных структур. Однако парафинирование тканей требует их обезвоживания, так как содержащие воду ткани плохо или совсем не пропитываются парафином.

Обезвоживание тканей производят в жидкости, смешивающейся с водой; затем такую жидкость нужно заменить растворителем парафина, смешивающимся с обезвоживающей жидкостью.

Известен способ обезвоживания гистологических образцов в 1,4-диэтилендиоксиде (диоксане) [Б. Ромейс. Микроскопическая техника. - М.: ИЛ, 1953, с. 81-82] . Диоксан хорошо смешивается и с водой, и с парафином, поэтому нет необходимости в обработке вторым растворителем для вытеснения обезвоживающего растворителя перед парафинированием.

Однако диоксан огнеопасен и высокотоксичен, токсичность диоксана носит кумулятивный характер, а к запаху диоксана человек быстро привыкает и перестает его замечать. Все это приводило к отравлениям, и обезвоживание диоксаном не получило распространения.

Также известен способ обезвоживания путем четырехкратной выдержки гистологических образцов в ацетоне [Р. Лилли. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. - М.: Мир, 1969, с. 69]. Обезвоживание в ацетоне происходит быстро: при использовании на каждой стадии свежего ацетона достаточного выдержать образец в каждой порции растворителя по 20 мин. Однако использование свежего растворителя на каждой стадии дорого. Поэтому свежий ацетон используют только для четвертой стадии, сдвигая сосуды на одну позицию; четырежды использованный ацетон очищают перегонкой. При обезвоживании по такой схеме образцы выдерживают в каждой порции по 40 мин.

Обезвоживание ацетоном имеет тот недостаток, что ацетон нарушает тканевые и клеточные структуры. Поэтому обезвоживание ацетоном лишь иногда используется в случаях, когда требуется экспресс-анализ.

Наиболее близким по совокупности существенных признаков к заявляемому способу является способ обработки гистологических и биологических образцов путем последовательных погружений образцов в водный раствор фиксирующего вещества, по крайней мере в три порции обезвоживающей жидкости, содержащей воду, и по крайней мере в три порции полностью безводной обезвоживающей жидкости [P. Лилли. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. - М. : Мир, 1969, с. 69]. В качестве фиксирующего вещества наиболее употребительным является 4%-ный водный раствор формальдегида. В качестве обезвоживающих жидкостей в известном способе используются этиловый или изопропиловый спирты, или их смеси. Указанный способ позволяет заменить воду, содержащуюся в клетках и тканях гистологических и биологических образцов, без нарушения тканевой и клеточной структуры. Указанный способ широко применяется в лабораториях, как при ручной так и при механизированной и автоматизированной обработке гистологических и биологических образцов [см., например, ЕР 0077477, опубл. 1983; ЕР 0269316, опубл. 1988; патент ФРГ 3042578, опубл. 1987; патент США 4576796, опубл. 1986; патент США 4911915, опубл. 1990; патент РФ 2150097. опубл. 2000, БИ 15].

В процессе обезвоживания в обрабатывающие жидкости из образцов попадают содержащиеся в тканях вода, жиры, белки и пр. Накопление этих компонентов в обрабатывающих жидкостях приводит к снижению скорости обработки и качества образцов. При длительном использовании загрязненных жидкостей в образцах могут появиться зоны, не поддающиеся исследованию [см. S.W. Thomson, L.G. Luna. An Atfas of Artifacts Encountered in the Preparation of Microscopic Tissue Sections. Ch. C. Thomas Publishers, USA, 1978, р. 76-77]. В интенсивно работающих лабораториях обновление спиртов обычно производят дважды в неделю. Как и в случае с ацетоном, первую (наиболее разбавленную и загрязненную) жидкость выливают, сосуды сдвигают на одну позицию, последний сосуд заливают свежей безводной жидкостью.

Однако объем обрабатываемых тканей не постоянен. Так, при обработке эндоскопических и пункционных биопсий он во много раз меньше объема образцов, взятых при исследовании операционного или аутопсийного материала (0,001-0,01 см³ и до 1 см³ соответственно). Надежные критерии оценки состояния жидкостей отсутствуют; принятый порядок обновления жидкостей приводит к тому, что их часто обновляют задолго до исчерпания их работоспособности. Это, в свою очередь, приводит к непроизводительным расходам и увеличению объема загрязненных жидкостей, утилизация которых также требует расходов.

Технический результат, на достижение которого направлено заявляемое изобретение, заключается в сокращении непроизводительных расходов обезвоживающих жидкостей при сохранении высокого качества обработки.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе обработки гистологических и биологических образцов путем последовательных погружений образцов в обрабатывающие жидкости, включающие водный раствор фиксирующего вещества, по крайней мере три обезвоживающие жидкости, содержащие воду, и по крайней мере три обезвоживающие жидкости, не содержащие воды, в воду, содержащуюся в водном растворе фиксирующего вещества, добавляют химическую метку, а в обезвоживающую жидкость, не содержащую воды, добавляют индикатор, образующий с химической меткой окрашенное соединение, и при возникновении заметного глазу окрашивания обезвоживающей жидкости, не содержащей воды, ее заменяют.

В качестве химической метки в заявляемом способе используют растворимые в воде и в спиртах соли переходных металлов в степени окисления 2+, например соли железа(II), кобальта(II), никеля(II), меди(II) или цинка. Это могут быть хлориды, сульфаты, ацетаты указанных металлов. Количество соли, добавленной в водный раствор фиксирующего вещества, составляет 2 - 40 г в расчете на ион металла на 1 л воды.

В качестве индикатора используют такие вещества, как орто-фенантролин, дифенилтиокарбазон, α-нитрозо-β-нафтол, диэтилтиокарбамат натрия, 8-оксихинолин, 1-(пиридилазо)-2-нафтол, 1-(пиридилазо)резорцин и 2-карбокси-2'-гидрокси-5'-сульфоформазилбензол, взятые в концентрации 0,001-0,4 г/л. Возможно также использование в качестве индикатора роданидов калия и натрия в концентрации 5-10 г/л.

В качестве обезвоживающей жидкости в заявляемом способе использованы этиловый или изопропиловый спирты, или смеси на основе спиртов, например смеси этилового или изопропилового и метилового спиртов, этилового, метилового спирта и ацетона и т.п., преимущественно этиловый и изопропиловый спирты.

Цветные реакции используемых металлов с используемыми индикаторами в воде, хлороформе, бензоле, циклогексане и четыреххлористом углероде известны [Е. Сендал. Колориметрические методы определения следов металлов. - М.: Мир, 1964; Ю.Ю. Лурье. Справочник по аналитической химии. - М.: Химия, 1979]. Однако эти реакции не изучались в спиртах; не были известны ни цвета образующихся соединений, ни концентрационные границы определения.

В качестве фиксирующего вещества используют предпочтительно формальдегид (4%-ный водный раствор) или смеси на его основе.

Далее заявляемый способ поясняется примерами, но не ограничен ими.

Пример 1.

В устройство для обработки гистологических образцов загружается 300 кассет, содержащих каждая по одному эндоскопическому образцу объемом 0,001 см³. Суммарный объем образцов составляет 0,3 см³. Батарея обрабатывающих жидкостей включает 7 контейнеров объемом по 3 л, содержащих соответственно:
1) фиксирующее вещество - 4%-ный водный раствор формальдегида, содержащий 39,85 г/л (8 г/л в расчете на железо) FeSО₄•7H₂O;
2) 70%-ный водный раствор этилового спирта;
3) 80%-ный водный раствор этилового спирта;
4) 90%-ный водный раствор этилового спирта;
5, 6 и 7) 100% этиловый спирт, содержащий 0,2 г/л орто-фенантролина.

Указанные жидкости подают в устройство, где фиксирующий раствор пребывает 8 часов, а спиртовые растворы по 1 часу.

Количество предшествующей жидкости, перенесенной в последующую, складывается из жидкости, содержащейся в образцах, и жидкости, переносимой на поверхности кассет и деталей аппарата (стенки контейнера и трубопровода), количество которой для данного аппарата является постоянным и составляет 25 мл.

После обработки указанных образцов изменения окраски жидкости в пятом контейнере не произошло.

Аналогичным образом были обработаны еще 14 партий эндоскопических образцов по 300 штук в каждой. Заметное красно-оранжевое окрашивание спирта в пятом контейнере произошло после обработки 15 партии.

Микроскопическое исследование образцов показало, что образцы всех 15 партий обработаны качественно.

Пример 2.

Опыт проводили, как в примере 1, но устройство было загружено аутопсийными образцами объемом около 0,7 см³, общий объем обрабатываемой ткани составлял 210 см³. Окрашивание в пятом контейнере появилось после обработки третьей партии.

Микроскопическое исследование показало, что образцы обезвожены качественно.

Пример 3.

Опыт проводят, как в примере 1, но обезвоживание проводят изопропиловым спиртом. В изопропиловый спирт, не содержащий воды, вводят 0,4 г на литр орто-фенантролина.

После 15-го цикла фиксации и обезвоживания в пятом контейнере появляется заметное желтое окрашивание. Спирт заменяют.

Микроскопическое исследование показало, что образцы обезвожены качественно.

Пример 4.

Опыт проводят, как в примере 3, но обработке подвергают 300 аутопсийных образцов общим объемом 270 см³. Заметное окрашивание в пятом контейнере возникает после 3-го цикла обезвоживания.

Микроскопическое исследование показало, что образцы обезвожены качественно.

Пример 5.

Опыт проводят, как в примере 1, но в раствор фиксирующего вещества вводят 8,8 г/л (2 г/л в расчете на цинк) сульфата цинка (ZnSO₄•7H₂O). В этиловый спирт, не содержащий воды, вводят 0,002 г/л дифенилтиокарбазона.

После 15-го цикла обработки в пятом контейнере появляется заметное малиново-красное окрашивание. Спирт заменяют.

Микроскопическое исследование показало, что образцы обезвожены качественно.

Пример 6.

Опыт проводят, как в примере 3, но в раствор фиксирующего вещества вводят 70,4 г/л (16 г/л в расчете на цинк) сульфата цинка. В изопропиловый спирт, не содержащий воды, вводят 0,001 г/л дифенилтиокарбазона.

После 13-го цикла обработки в пятом контейнере заметно красное окрашивание.

Пример 7.

Опыт проводят, как в примере 2, но в раствор фиксирующего вещества вводят 57,25 г/л (12 г/л в расчете на кобальт) сульфата кобальта (CoSO₄•7H₂O), а в этиловом спирте, не содержащем воды, растворяют 10 г/л роданида калия.

После 3-го цикла обработки в пятом контейнере заметно голубое окрашивание.

Пример 8.

Опыт проводят, как в примере 7, но в этиловый спирт, не содержащий воды, вводят 0,02 г/л α-нитрозо-β--нафтола.

После третьего цикла обработки в пятом контейнере заметно красновато-коричневое (цвет крепкого чая) окрашивание.

Пример 9.

Опыт проводят, как в примере 2, но в раствор фиксирующего вещества вводят 34,30 г/л (12 г/л в расчете на медь) ацетата меди. В этиловый спирт, не содержащий воды, вводят 0,04 г на литр диэтилтиокарбамата натрия.

После третьего цикла обработки в пятом контейнере заметно желтовато-зеленое окрашивание.

Пример 10.

Опыт проводят, как в примере 9, но берут 114,34 (40 г в расчете на медь) ацетата меди, а в этиловый спирт, не содержащий воды, добавляют 0,02 г/л 8-оксихинолина.

После третьего цикла обработки в пятом контейнере заметно зеленое окрашивание.

Пример 11.

Опыт проводят, как в примере 2, но в раствор фиксирующего вещества вводят 38,27 г/л (8 г/л в расчете на никель) сульфата никеля NiSО₄•7Н₂О. В этиловый спирт, не содержащий воды, вводят 0,004 г/л дифенилтиокарбазона.

После третьего цикла обработки в пятом контейнере заметно фиолетовое окрашивание.

Пример 12.

Опыт проводят, как в примере 4, но в раствор фиксирующего вещества вводят 52,8 г/л (12 г/л в расчете на цинк) сульфата цинка. В изопропиловый спирт, не содержащий воды, вводят 0,01 г/л 1-(пиридилазо)-2-нафтола.

После третьего цикла обработки в пятом контейнере заметно красно-коричневое (цвета крепкого чая) окрашивание.

Пример 13.

Опыт проводят, как в примере 12, но в изопропиловый спирт вводят 0,01 г/л 1-(пиридилазо)резорцина.

После третьего цикла обработки в пятом контейнере заметно красно-коричневое (цвета крепкого чая) окрашивание.

Пример 14.

Опыт проводят, как в примере 2, но в раствор фиксирующего вещества вводят 35,2 г/л (8 г/л в расчете на цинк) сульфата цинка. В этиловый спирт, не содержащий воды, вводят 0,01 г/л 2-карбокси-2'-гидрокси-5'-сульфоформазилбензола.

После третьего цикла обработки в пятом контейнере заметно фиолетовое окрашивание.

Микроскопическое исследование образцов, обработанных в примерах 6-14, показало, что образцы обработаны качественно.

Как видно из приведенных примеров, заявляемый способ позволяет более экономно расходовать обрабатывающую жидкость, поскольку возникновение окраски прямо связано с объемом переносимой жидкости и объемом обрабатываемых образцов.

Изобретение относится к методам диагностики и может найти применение при подготовке гистологических и биологических образцов к микроскопическому исследованию. Способ включает последовательное погружение образцов в водный раствор фиксирующего вещества, по крайней мере в три обезвоживающие жидкости, содержащие воду, и по крайней мере в три обезвоживающие жидкости, не содержащие воды, В воду, содержащуюся в водном растворе фиксирующего вещества, добавляют химическую метку, а в обезвоживающую жидкость, не содержащую воды, добавляют химический индикатор, образующий с химической меткой окрашенное соединение, и при возникновении заметного глазу окрашивания обезвоживающей жидкости, не содержащей воды, ее заменяют. В качестве обезвоживающей жидкости используют этиловый, изопропиловый спирты или смеси на их основе. В качестве химической метки используют соли переходных металлов в степени окисления 2+, таких как соли железа, кобальта, никеля, меди и цинка, в количестве 2 - 40 г (в расчете на металл) на литр воды. В качестве индикатора используются орто-фенантролин, дифенилтиокарбазон, α-нитрозо-β-нафтол, диэтилтиокарбамат натрия, 8-оксихинолин, 1-(пиридилазо)-2-нафтол, 1-(пиридилазо)резорцин и 2-карбокси-2'-гидрокси-5'-сульфоформазилбензол, взятые в количестве 0,001-0,4 г на литр спирта или роданид калия или натрия в количестве 5 - 10 г на литр спирта. Изобретение позволяет сократить непроизводительные расходы обезвоживающих жидкостей при сохранении высокого качества обработки. 11 з.п.ф-лы.

1. Способ обработки гистологических и биологических образцов путем последовательных погружений образцов в обрабатывающие жидкости, включающие водный раствор фиксирующего вещества, по крайней мере три обезвоживающие жидкости, содержащие воду, и по крайней мере три обезвоживающие жидкости, не содержащие воды, отличающийся тем, что в воду, содержащуюся в водном растворе фиксирующего вещества, добавляют химическую метку, а в обезвоживающую жидкость, не содержащую воды, добавляют индикатор, образующий с химической меткой окрашенное соединение, и при возникновении заметного глазу окрашивания обезвоживающей жидкости, не содержащей воды, ее заменяют.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве химической метки используют соль переходного металла в степени окисления 2+, взятую в количестве 2-40 г (в расчете на металл) на 1 л водного раствора фиксирующего вещества.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве химической метки используют соль двухвалентного железа.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве химической метки используют соль двухвалентного кобальта.5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве химической метки используют соль двухвалентного никеля.6. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве химической метки используют соль двухвалентной меди.7. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве химической метки используют соль двухвалентного цинка.8. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве индикатора используют вещество, выбранное из группы, включающей ортофенантролин, дифенилтиокарбазон, α-нитрозо-β-нафтол, диэтилтиокарбамат натрия, 8-оксихинолин, 1-(пиридилазо)-2-нафтол, 1-(пиридилазо)-резорцин, и 2-карбокси-2′-гидрокси-5′-сульфоформазилбензол, взятые в количестве 0,001-0,4 г на литр жидкости, не содержащей воды.9. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве индикатора используют роданид калия или натрия, взятый в количестве 5-10 г на литр жидкости, не содержащей воды.10. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве обезвоживающей жидкости используют этиловый спирт.11. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве обезвоживающей жидкости используют изопропиловый спирт.12. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве обезвоживающей жидкости используют смеси на основе этилового и изопропилового спиртов.