СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ОБРАЗЦОВ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ В КОМПЛЕКСЕ С ИМПЛАНТИРОВАННЫМИ ЭЛЕМЕНТАМИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ СВЕТОВОЙ МИКРОСКОПИЕЙ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/48 

Описание патента на изобретение RU2564895C1

Настоящее изобретение относится к медицине и биологии, а именно к технике изготовления гистологических образцов биологических тканей, с элементами имплантированных металлических и/или полимерных конструкций для изучения с помощью световой микроскопии.

На сегодняшний день важной клинической проблемой остается изучение взаимодействия между тканями организма человека и металлическими или синтетическими имплантатами, такими, например, как эндоваскулярные стенты и протезы кровеносных сосудов. Исследование различных видов стентов и протезов, материалов, используемых для их изготовления, лекарственных покрытий и других способов модификации поверхности требует детального гистологического анализа тканей на границе с имплантатом.

Наиболее известный метод подготовки биологических тканей, содержащих металлический компонент, для исследования с помощью световой микроскопии заключается в фиксации материала в формальдегиде/параформальдегиде с последующим удалением металлической конструкции из биологической ткани (Giessen W.J., Serruys P.W., Beusekom H.M. Coronary stenting with a new, radiopaque, balloon-expandable endoprosthesis in pigs. Circulation. 1991; 83:1788-1798). После фиксации материал обезвоживают, заключают в парафин, изготавливают гистологические срезы и окрашивают их. Недостатком данного способа является повреждение биологических тканей в результате механического удаления металлических или полимерных фрагментов имплантата, приводящего к нарушению архитектуры ткани и невозможности оценить клеточные реакции на поверхности материала.

Наиболее близким к заявляемому способу является метод, основанный на фиксации биологического материала в формальдегиде с дальнейшим заключением в смолы на основе метакрилатов и акрила (Major A., Guidoin R., Soulez G. Implant degradation and poor healing after endovascular repair of abdominal aortic aneurysms: an analysis of explanted stent-grafts. J Endovasc Ther. 2006; 13: 457-467). Из образца, заключенного в смолу, с помощью алмазного ножа или высокоточного отрезного станка готовят тонкие срезы толщиной 10-20 мкм, которые тщательно полируют и окрашивают гистологическими красителями.

Основными недостатками данного способа является трудоемкость, сложность получения тонких срезов образцов и необходимость в специальном оборудовании для их изготовления.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является возможность послойного исследования гистологических образцов биологических тканей, с элементами имплантированных металлических и/или полимерных конструкций без повреждения клеточных компонентов и изменения архитектуры ткани в зоне контакта с инородным телом.

Технический результат достигается за счет того, что биологический материал, содержащий металлические и/или полимерные конструкции, обрабатывают раствором фиксаторов, последовательно обезвоживают и погружают в прозрачную смолу для холодной заливки; после получения твердого образца выполняют полировку и окрашивание поверхности исследуемого биологического материала, а исследование образца осуществляют на глубину 1-2 мкм, при этом микроскопию последующих слоев выполняют после шлифовки и повторного окрашивания поверхности образца.

В соответствии с предлагаемым способом образец биологической ткани в комплексе с металлической и/или полимерной конструкцией фиксируют в любом из известных химических фиксаторов: альдегиды (формальдегид, глутаровый альдегид), хромовая кислота, спирты (этанол, метанол), ацетон, соли ртути (сулема), кислоты (уксусная, трихлоруксусная, пикриновая, азотная). После фиксации образцы отмывают в течение 0,5-1 часа в фосфатно-солевом буфере и далее проводят их обезвоживание с помощью этилового спирта. Для чего гистологические образцы помещают последовательно в растворы этилового спирта с возрастающей концентрацией от 30% до 100% на время 1-24 часов в каждой порции. Кроме этанола для обезвоживания может быть применен безводный ацетон, изопропанол, диоксан, глицерин. После обезвоживания материал помещают на 1-3 часа в растворитель (ацетон, окись пропилена, 1,2-эпоксипропан).

После обезвоживания материал погружают в прозрачную смолу для холодной заливки, в качестве которой может быть использована эпоксидная, акриловая или полиэфирная смолы. Перед тем как поместить образец в смолу осуществляют его пропитывание раствором, содержащим смолу и растворитель в соотношении 1:1 на 6-24 часов. После чего образец пропитывают чистой смолой в течение 12-24 часов и далее проводят ее полимеризацию.

Полученный твердый образец, заключенный в смолу, шлифуют и полируют до поверхности биологического материла, которую необходимо исследовать. Окраску препарата выполняют щелочными растворами метиленового синего, толуидинового синего, азура II и другими. При этом происходит окрашивание только поверхностного слоя на глубину 1-2 мкм.

Для дифференциальной окраски спиртовыми красителями, например гематоксилин и эозин, предварительно осуществляют травление верхнего слоя препарата насыщенным раствором гидроксида натрия в этиловом спирте. После чего выполняют отмывку от щелочи и окрашивают образец по стандартному протоколу.

Полученный окрашенный препарат исследуют с помощью световой микроскопии в проходящем и в отраженном свете с использованием люминесценции и без нее. При необходимости дальнейшего изучения более глубоких слоев материала образец шлифуют до нужной глубины, после чего выполняют полировку и повторное окрашивание поверхностного слоя образца.

Технический результат предлагаемого изобретения поясняет изображение, где на фиг. 1 - представлен гистологический образец биологической ткани, извлеченный из легочной артерии, содержащий металлические стойки эндоваскулярного стента при окрашивании метиленовым синим с увеличением световой микроскопии × 200. На изображении отмечены: 1 - материал стента; 2 - грануляционная соединительная ткань, содержащая отдельные макрофаги, фибробласты и гигантские многоядерные клетки инородных тел; 3 - зрелые волокна соединительной ткани, образующие фиброзную капсулу.

Пример 1.

Эндоваскулярный стент с участками нативной ткани был извлечен из легочной артерии при проведении реоперации. Материал фиксировали в забуференном формалине в течение двух суток, после чего отмывали дважды по 30 минут в фосфатно-солевом буфере. Для обезвоживания материала осуществляли его проводку в растворах этилового спирта следующим образом:

1. 30% этиловый спирт - 2 раза по 30 минут.

2. 50% этиловый спирт - 2 раза по 30 минут.

3. 70% этиловый спирт - 2 раза по 40 минут.

4. 80% этиловый спирт - 2 раза по 60 минут.

5. 95% этиловый спирт - 60 минут, затем еще 120 минут.

6. 100% этиловый спирт - 2 раза по 60 минут.

После обезвоживания образец помещали в 100% ацетон - 2 раза по 60 минут, и далее еще на 120 минут. Затем образец выдерживали в смеси ацетона и смолы в соотношении 1:1 в течение 12 часов, а после этого в чистой смоле под вакуумом для полного пропитывания - 6 часов. Пропитанные кусочки материала помещали в специальные формы, заливали смолой и выдерживали 12 часов при комнатной температуре, далее проводили полимеризацию смолы при температуре 60°C до полного застывания.

Дальнейшую обработку осуществляли на шлифовально-полировальном станке с использованием шлифовальных дисков в следующем порядке: 1200, 1000 и 800. Для полировки последовательно использовали сукно различной упругости в комбинации с суспензиями, содержащими монокристаллические алмазы:

1. Шерстяное сукно с 9 мкм алмазной суспензией.

2. Шелковое сукно с 6 мкм алмазной суспензией.

3. Бархатное сукно с лубрикантом.

Для проведения окраски готовили краситель: 0,5% раствор метиленового синего в 0,5% водном растворе тетрабората натрия. Отполированный образец помещали в краситель на 7 минут при 60°C, после чего отмывали водой, высушивали и изучали светом на микроскопе в проходящем и отраженном свете с люминесценцией.

При микроскопическом исследовании было обнаружено образование фиброзной капсулы вокруг металлических стоек стента. В окружающих тканях наблюдали умеренную воспалительную инфильтрацию мононуклеарными клетками, а также фибробласты и отдельные гигантские многоядерные клетки инородных тел. Кроме того, были выявлены небольшие участки неоинтимы и организованного тромба.

Таким образом, предлагаемый метод подготовки биологического материала позволяет изучать морфологию и клеточный состав тканей, контактирующих с металлическими и полимерными конструкциям, без механического нарушения целостности комплекса ткань-имплантат.

Похожие патенты RU2564895C1

название год авторы номер документа
Способ подготовки образцов костной ткани человека для исследования методом растровой электронной микроскопии 2018
  • Гилев Михаил Васильевич
  • Ананьев Максим Васильевич
  • Измоденова Мария Юрьевна
  • Антропова Ирина Петровна
  • Степанов Степан Игоревич
  • Еремин Вадим Анатольевич
  • Фарленков Андрей Сергеевич
  • Кисимов Андрей Александрович
RU2688944C1
СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ОБРАЗЦОВ КОСТНОЙ ТКАНИ С ИМПЛАНТИРОВАННЫМ МЕТАЛЛОМ ДЛЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ 2022
  • Сирак Сергей Владимирович
  • Сирак Екатерина Сергеевна
  • Перикова Мария Григорьевна
  • Сирак Алла Григорьевна
  • Дилекова Ольга Владимировна
  • Сирак Александр Сергеевич
  • Арутюнова Алина Павловна
  • Кобылкина Татьяна Леонидовна
  • Еникеев Амир Маратович
RU2797125C1
СПОСОБ ГИСТОХИМИЧЕСКОГО ВЫЯВЛЕНИЯ МЕТАЦИДА В ПЕЧЕНИ ПРИ ОТРАВЛЕНИИ СУРРОГАТНЫМ АЛКОГОЛЕМ НА ПОЛИМЕРНОЙ ОСНОВЕ 2010
  • Фрисс Светлана Анатольевна
RU2433409C1
Способ прижизненного исследования функционирования, ремоделирования и эндотелизации протезов для сосудистой реконструкции после имплантации в эксперименте на крупных лабораторных животных 2023
  • Антонова Лариса Валерьевна
  • Арнт Анастасия Андреевна
  • Колесников Алексей Юрьевич
  • Кочергнин Никита Александрович
  • Сенокосова Евгения Андреевна
  • Прокудина Екатерина Сергеевна
RU2817271C1
ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНАЯ БИОДЕГРАДИРУЕМАЯ СОСУДИСТАЯ ЗАПЛАТА ДЛЯ АРТЕРИАЛЬНОЙ РЕКОНСТРУКЦИИ 2019
  • Антонова Лариса Валерьевна
  • Миронов Андрей Владимирович
  • Королева Людмила Сергеевна
  • Севостьянова Виктория Владимировна
  • Барбараш Ольга Леонидовна
  • Барбараш Леонид Семенович
RU2707964C1
Способ приготовления гистологических препаратов роговицы глаза 2019
  • Первых Светлана Леонидовна
RU2697475C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОДЕГРАДИРУЕМОГО КОМПОЗИТНОГО МАТРИКСА НА ОСНОВЕ РЕГЕНЕРИРОВАННОГО ФИБРОИНА ШЕЛКА Bombyx mori И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ 2012
  • Агапов Игорь Иванович
  • Мойсенович Михаил Михайлович
RU2483756C1
Способ изготовления гистологических препаратов 2015
  • Ефремова Ольга Александровна
  • Иванов Николай Сергеевич
  • Любовцева Любовь Алексеевна
RU2613175C1
СПОСОБ ПОДГОТОВКИ БИОЛОГИЧЕСКОГО ОБРАЗЦА К ГИСТОЛОГИЧЕСКОМУ ИССЛЕДОВАНИЮ 1994
  • Извозчиков И.Б.
  • Клочкова О.В.
  • Криволапов Ю.А.
  • Ермилов А.Н.
RU2089871C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО ОБРАЗЦА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЙ МЕТОДОМ СКАНИРУЮЩЕЙ ЗОНДОВОЙ НАНОТОМОГРАФИИ 2020
  • Агапов Игорь Иванович
  • Агапова Ольга Игоревна
  • Боброва Мария Михайловна
  • Сафонова Любовь Александровна
  • Ефимов Антон Евгеньевич
RU2766727C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 564 895 C1

Реферат патента 2015 года СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ОБРАЗЦОВ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ В КОМПЛЕКСЕ С ИМПЛАНТИРОВАННЫМИ ЭЛЕМЕНТАМИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ СВЕТОВОЙ МИКРОСКОПИЕЙ

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для изготовления гистологических образцов биологических тканей с элементами имплантированных металлических и/или полимерных конструкций для изучения с помощью световой микроскопии. Способ заключается в том, что биологический образец последовательно обрабатывают раствором фиксаторов, отмывают, обезвоживают, пропитывают раствором прозрачной смолы для холодной заливки в течение 6-24 часов, погружают в чистую смолу на 12-24 часа и окрашивают красителями на глубину 1-2 мкм. При этом микроскопию последующих слоев выполняют после шлифовки, полировки и повторного окрашивания поверхности образца. Изобретение позволяет проводить послойное исследование образцов без повреждения клеточных компонентов и изменения архитектуры ткани в зоне контакта с инородным телом. 1 ил., 1 пр.

Формула изобретения RU 2 564 895 C1

Способ изготовления образцов биологических тканей в комплексе с имплантированными элементами для исследования световой микроскопией, включающий последовательную фиксацию, отмывание и обезвоживание биологического образца с последующим пропитыванием его раствором прозрачной смолы для холодной заливки в течение 6-24 часов и погружением в чистую смолу на 12-24 часа, а также окрашивание красителями, отличающийся тем, что окрашивание образца осуществляют на глубину 1-2 мкм, а исследование материала выполняют послойно без подготовки срезов, для чего проводят шлифовку поверхности на нужную глубину, полировку и повторное окрашивание образца.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2015 года RU2564895C1

Major A., Guidoin R., Soulez G
Implant degradation and poor healing after endovascular repair of abdominal aortic aneurysms: an analysis of explanted stent-grafts
J Endovasc Ther
Пломбировальные щипцы 1923
  • Громов И.С.
SU2006A1
СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ОБРАЗЦОВ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ К ГИСТОЛОГИЧЕСКИМ ИССЛЕДОВАНИЯМ 2011
  • Иванченко Андрей Викторович
  • Мационис Александр Эдуардович
  • Пешков Максим Валерьевич
RU2499242C2
СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ОБРАЗЦОВ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ В СКАНИРУЮЩЕМ ЭЛЕКТРОННОМ МИКРОСКОПЕ 2008
  • Силантьева Тамара Алексеевна
  • Горбач Елена Николаевна
  • Ирьянов Юрий Михайлович
  • Ступина Татьяна Анатольевна
  • Ворсегова Татьяна Николаевна
RU2397472C1
IN 0201105895 P1, 11.10.2013

RU 2 564 895 C1

Авторы

Мухамадияров Ринат Авхадиевич

Севостьянова Виктория Владимировна

Головкин Алексей Сергеевич

Нохрин Андрей Валерьевич

Даты

2015-10-10Публикация

2014-06-09Подача