СПОСОБ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ ОТ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗВАННЫХ НЕМАТОДАМИ Российский патент 1997 года по МПК A01N43/36 

Изобретение относится к средствам и способам борьбы с заболеваниями, вызываемыми паразитическими нематодами у растений и животных.

С 40-х гг. стали доступными многие химикаты, активные против нематод, паразитирующих на растениях. Они часто проявляли нежелательные токсические воздействия; например, фумигант дибромхлорпропан был снят с продажи в 1977 г. так как он вызывал бесплодие у работающих. Во время 60-х гг. нематоциды фумигантного типа были вытеснены гранулированными системными нематоцидами. Они использовались с тех пор, типичным соединением являлся оксамил. Эти соединения являлись главным образом производными оксикарбаматов и органофосфатов, и из-за их токсичности они использовались под жестким контролем. Следовательно, было бы хорошо иметь противонематодные агенты, которые были бы благоприятны для окружающей среды, т.е. сами были бы нетоксичными, а продукты их разложения не действовали на организмы.

Настоящее изобретение обеспечивает применение соединения 2R,5R-диоксиметил-3R,4R-диоксипирролидина (ДМДП)

или его солей присоединения кислоты для борьбы с заболеваниями, вызванными паразитарными нематодами на растениях, включая сельскохозяйственные культуры, и у млекопитающих. Изобретение также включает семена в оболочке, обработанные или пропитанные ДМДП или его солью.

Механизм, по которому ДМДП действует на заболевания, вызванные паразитарными нематодами у растений, может включать любое нематотоксическое, нематостатическое или антипитательное действие как на взрослых, так и на ювенильных нематод, ингибирование введения из личиночных форм нематод, ингибирование образования корневых клубеньков для питания нематод, и далее охватывает любое действие на нематоды, которое предотвращает их питание и/или передачу вирусов растений.

ДМДП имеет природное происхождение и, как было показано, обладает низкой фитотоксичностью.

Открытие и экстракция ДМДП было описано L.E. Fellows and G.M. Fleet в "Ингибиторы алкалоидной гликолидазы из растений" (Выделение природных продуктов. G.H. Wagman and R. Cooper, Eds. Elsevier, Amsterdam, 1988, с. 540-565). В этом обзоре упомянуты некоторые свойства ДМДП, включая инсектицидную и отпугивающую насекомых активность, обе были определены экспериментально в тестах с кормом. Более четко они описаны у L.E. Fellows Химия в Британии, с. 842-844 (1987). Эти и другие свойства ДМДП более обширно рассмотрены во II главе "Метаболизм азота в растениях", Plenum Publishung Corporation, 1989, с. 394-427, L.E. Fellows et al. особенно на страницах 410 (на которой ссылаются на S.V. Evans et al. Entomol, Exp, App. 37, 257-261 (1985), 411 (на которой упоминается собственная работа авторов и W.M. Blaney et al. Entomol. Exp. Appl. 36, 209-216 (1984) и 415. Смотри также L.E. Fellows et al. в "Swainsonine and Related Glycosidase Inhibitors", L. James, A.D. Elbein, R. J. Molyneax and C. D. Warren, Eds. Iova State University Press, 1989, pp. 396-416. Свойства ДМДП, упомянутые там, не указывают на противонематодное действие.

Дополнительное преимуществом ДМДП связано со способом его нанесения при обработке растений, особенно сельскохозяйственных культур. Многие существующие противонематодные соединения наносят на почву путем разбрасывания и вносят, используя роторные культиваторы. ДМДП может быть нанесен на листья, которые каким-то образом возбуждают противонематодное действие в корнях растения. Возможно ДМДП передается через флоему, но это не является определенным. Следовательно, ДМДП может быть нанесен путем опрыскивания листьев вместо или в дополнение к вышеупомянутому традиционному способу нанесения. Подходящая дозировка при нанесении ДМДП на почву составляет по крайней мере 24 до не более 48 кг/га на 20 см глубины. ДМДП также может быть нанесен путем предварительной обработки семян растений перед посевом.

ДМДП является водорастворимым и, следовательно, может быть нанесен без поверхностного активного или диспергирующего агента. Предпочтительная концентрация активного ингредиента и доза нанесения зависят от способа нанесения и типа желаемого эффекта, например, они могут различаться на нематотоксичность и на ингибирование переноса вирусов. Для опрыскивания листьев предполагается, что обычно растения могут быть опрысканы раствором, содержащим 0,01-3,5 г/л, предпочтительно 0,01-1,0 г/л активного ингредиента до тех пор, пока раствор не начнет стекать. Более низкие концентрации могут быть полезными в некоторых случаях, хотя более высокие концентрации часто могут быть толерантными.

ДМДП проявляет свои свойства против широкого спектра нематод, воздействующих на растения, например, нематод корневых наростов, цист-нематод и нематод, переносящих вирусы. Особенно отметим его активность против повреждающих урожаи нематод следующих видов: Meloidodyne, Ilobodera, Heterodera, Rapopholus, Pratylenchus, Hirschmanniella, Scutellonema, Hely'cotylenchus, Tylenchus, Rotylenchus, Ditylenchus, Longidorus, Xiphinema.

Что касается нематод, которые инфицируют млекопитающих, ДМДП является активным против широкого спектра гельминтных нематод, особенно против нематод следующих родов: Haemonchus, Feladorsagia, Nematodirus, Trichostrongylus, Dictyocaulus и Cooperia, особенно против видов Haemonchus contortus и Teladorsagia circumcincta (ранее классифицированного как Ostertagia circumcincta).

ДМДП может быть экстрагирован из Derris elliptica Benth/Zequminosae/, как описано A. Welter et al./Phytochem. 1976, 15, 747-749) или может быть синтезирован из Д-глюкозы Fuhrman et al, Nature, 1984, 307, 755-758); L.W.J. Fleet and R.W. Smith, Tetrahedron Letters, 26, (11), 1465-1468 (1985) или из Z-сорбозы (P. Card et al. Org. Chem. 1985, 50, 891-893).

В приведенном выше описании ДМДП наносят также в виде его солей присоединения кислоты, которые могут быть любыми, что совместимо с целями использования, например, сельскохозяйственно или ветеринарно приемлемыми, если их используют на растениях или животных (но не людях), соответственно. Такие соли могут быть получены традиционными способами из свободного основания.

Следующие примеры иллюстрируют изобретение. "Твин" является торговым названием. Единицы "ппм" определяют раствор, содержащий мг испытуемого соединения в 1 л воды, в растворах для испытаний in vitro или в растворах для нанесения на поверхность листьев. В примерах ДМДП означает свободное основание.

Пример 1. Эксперименты по восприимчивости к вирусу и его переносу
Испытывают действие химиката на восприимчивость к вирусу вектора нематоды при экспозиции не содержащих вируса нематод с зараженным вирусом растительным источником в присутствии испытуемого соединения. Эффективность химиката может быть определена при сравнении скоростей последующего переноса вируса обработанными и необработанными нематодами.

Во всяком случае может быть определен перенос вируса при химическом воздействии при нанесении химиката после того, как нематоды, восприимчивые к вирусу, питались на растениях-рецепторах.

Эксперименты проводили в пластиковых горшках емкостью 25 см³, выдерживаемых в камерах с контролируемой температурой (Taylor and Brown, Nematol. Medit. 1974, 2, 171-175), используя трехнедельные проростки Petunia hibrida Vilm. Использованным сочетанием нематода/вирус было Xiphinema diversicandatum с вектором Arabic Mosaic Virus.

Проростки Petunia высаживали в 22 мл смеси 3:1 песок/глина. Через 28 ч растения инокулируют вирусом. Через еще 24 ч в каждый горшок помещают 5 взрослых нематод (испытуемые химикаты добавляют в то же самое время, если испытывается восприимчивость к вирусу). Для каждой обработки делается 10-15 повторов. Через 3 нед. извлекают нематоды и затем вносят в почву, в которой выращивают безвирусные растения-рецепторы. (Если исследуется перенос вируса, испытуемые химикаты добавляют в то же самое время). Еще через 4 нед. нематоды снова извлекают и подсчитывают. Подсчитывают галлы на корнях рецепторных растений, корни мацерируют и сок наносят на листья растения Chenopodium quinoa (индикатор вируса).

Через 12 дн. исследуют растения C. quinoa на симптомы вируса. Для каждой обработки делается 10-15 повторов в обоих вирусных тестах. Во всех случаях контролем служили опыты без добавления химиката.

Испытанными химикатами были ДМДП (15 и 30 ппм) и обычное нематоцидотоксическое соединение оксамил (7 ппм).

В табл. 1 приведено действие ДМДП на ингибирование образования корневых галлов и процент восприимчивости вируса по сравнению с контрольной величиной.

В табл.2 показано ингибирующее действие ДМДП на образование корневых галлов и процент переноса вируса по сравнению с контрольной величиной.

Пример 2. Тест на выведение. Тест на выведение исследует действие испытуемых химикатов на выведение из яиц Ilobodera pallita белой цист-нематоды картофеля (PCN).

Помещают в пробирку 10 цист PCN одинакового размера и цвета, в пробирке содержится 0,25 мл раствора испытуемого соединения (концентрация 50 ппм и 100 ппм) и 0,75 мл диффузата картофеля. Диффузат корней обычно стимулирует выведение ювенильных особей из яиц цист. Каждую обработку повторили 4 раза. Дважды каждую неделю удаляют жидкость и подсчитывают количество живых и мертвых вылупившихся ювенильных особей. Смесь диффузат/химикат пополняют после каждого подсчета нематод. Пробирки хранят при 19^oC между подсчетами.

В табл.3 показано количество ювенильных вылупившихся особей, мертвых или живых, как среднее из четырех подсчетов. Эти же данные также выражают как действия. В табл.3 показано также, что ДМДП сильно снижает количество ювенильных особей, вылупившихся из цист.

Этот эксперимент повторяют, используя Ilobodera rostochiensis. В табл.4 показан снижения выживших нематод по сравнению с контролем через 4 нед. Из табл.4 можно видеть, что ДМДП оказывает лучшее действие, чем его соль кислоты.

Пример 3. Тест на токсичность in vitro. Группы из 10 активных взрослых Xiphinema diversicandatum помещают вручную в индивидуальные стеклянные ванночки, содержащие дистиллированную воду. В заданное время партию нематод переносят в 1 мл аликвоты испытуемого соединения при различных концентрациях испытуемого соединения или для контроля в 1 мл дистиллированной воды. Каждую обработку выполняют в трех повторностях. Подсчитывают количество иммобилизованных нематод в два интервала, 48 и 72 ч. Их считают неподвижными, если они не двигаются при стимуляции путем касания кисточкой из щетины. Все испытания проводят при 5^oC.

В табл. 5 показана токсичность ДМДП in vitro в интервале концентраций. Процент неподвижности, который приведен, скорректирован для контроля неподвижности по формуле Эббота. Отмечено снижение токсичности in vitro при 200 ппм и выше. Также наблюдается аномальное падение токсичности при 25 ппм.

Было обнаружено различие токсичности в подобных испытаниях для взрослых и ювенильных нематод. В табл.6 показаны величины ЭК₅₀ (эффективная концентрация, требующаяся для иммобилизации 50% общего количества нематод), рассчитанные из результатов.

Этот эксперимент повторяют, заменив X. diversicaudatum на Ilobodera rostochiensis. Эти результаты приведены в табл.7, из которой можно видеть, что как ДМДП, так и его соли кислот являются токсичными для нематод.

Пример 4. В табл.8 показана зависящая от дозы активность ДМДП с использованием трех тестов: эксперимент в разделенных горшках, эксперимент в мини-горшочках и эксперимент с испытанием на галлах.

а. Тест в разделенных горшочках. Тест показывает, обладают ли противонематодные агенты изобретения репеллентным или противопитательным действием на нематоды и/или нематоцидным действием.

"Разделенный горшочек", т.е. горшочек, разделенный на две секции материалом с малым меш (смотри Alphey et al. Revue Nematol. 1988, 11 (4), 399-404) используют. Каждую сторону заполняют 37 мл почвы (смесь 3:1 песка и глины). В почву добавляют испытуемые соединения в концентрациях, показанных в табл. 8, на сторону, в которой выращивают проростки Petunia. С другой стороны добавляют 100 взрослых Xiphinama diversicandatum. Каждую обработку выполняют в 8 повторностях.

Через 21 дн обе половинки горшочка разделяют и извлекают из почвы с каждой стороны нематод. Подсчитывают корневые галлы на растениях с обработанных сторон (табл. 9). Подсчитывают количество живых и мертвых нематод в каждой половине и приводят его в табл.9.

Табл.8 показывает, что ДМДП обладает противопитательным действием против нематод при всех испытанных концентрациях. Табл.9 показывает, что 80 ппм ДМДП также обладает нематотоксическим действием в том, что со стороны растений больше нематод было иммобилизовано, чем в горшочке, куда был нанесен оксамил.

b. Тест с минигоршочком. Этот тест идентифицирует нематоцидный эффект химиката в почве и его действие на питательное поведение нематод.

Проростки петунии выращивают в 22 мл почвы (песок глина 3:1). В почву добавляют раствор испытуемого соединения или воды (контроль) с 5 или 10 взрослыми Xiphinema diversicandatum. Каждую обработку проводят в 10 повторностях. Через 3 нед. нематоды извлекают и регистрируют количество галлов, вызванных питанием нематод на корнях, и выражают как средний процент снижения контрольной величины.

Табл. 10 показывает, что ДМДП обладает репеллентным для нематод или противопищевым действием. Наиболее эффективной концентрацией ДМДП оказалась 25 ппм.

c. Тест с галлами. В тесте с галлами проростки томата, стимулированные для получения тонких придаточных корней путем удаления основной корневой системы, выращивают в трубках, содержащих 25 г тонкого просеянного сухого песка, 350 Meloidogyne incognita /J2/ и ДМДП в растворе в воде. Действие ДМДП на способность нематод вызывать галлы на корнях растений было изучено в течение периода времени 10-12 дн. В тест включен контроль с водой. Каждую обработку проводили в 10 повторностях.

В табл.11 приведены результаты, из которых видно, что ДМДП является одинаково эффективным в интервале 2,5-25 ппм, не менее эффективным при 50 и 240 ппм. Различные тесты указывают подобный уровень активности ДМДП, использованного в интервале между 2,5 ппм и 100 ппм.

Пример 5. Способ нанесения а) нанесение на корни. Для теста, будет ли противонематодный агент более эффективным при систематическом нанесении на растения, подходит тест с минигоршочками. Извлекают корни Petunia hybrida и отрезают концы стеблей, из которых отрастают вновь образующиеся корни, помещают их в раствор испытуемого соединения (концентрации показаны в табл.5) на 24 ч перед началом эксперимента. Действие этих обработанных растений X. diversicandatum сравнивают с действием растений, у которых обрезанные концы были погружены на 24 ч в воду. Табл.12 показывает, что обработанный корень с последующим нанесением почвы является подходящим методом обработки ДМДП.

b) нанесения на листья. Повторяют тест с мини-горшочком и тест с галлами, описанные в примере 4, но испытуемые соединения вводят путем нанесения на листья проростков томатов. В этих испытаниях на листья наносили 0,4 мл испытуемого соединения в растворе концентрацией 200 ппм в воде или одной воды вместе с 0,05% смачивающим раствором Твин 80 наносят на листья.

Снижение галлообразования на 86% в тесте с мини-горшочками и на 79% в галло-тесте по сравнению с контролем показывает, что действие испытуемого соединения выражается на корневой системе, обеспечивая защиту против нематод.

Пример 6. Данные по фитотоксичности. Испытывают ДМДП на трех различных видах растений при концентрации 200 ппм в течение 14 дн, используя методы, приведенные в тестах с мини-горшочками. Проростки затем оставляют расти в течение 16 дней и измеряют роста по отношению к контрольным растениям. Также измеряют длину корней и длину побега.

Табл.13 показывает влияние ДМДП на рост растений. Все цифры даны в роста относительно контролей (100% так же как контроль, >100% больше, чем контроль).

Райграсс при обработке ДМДП вырос только на 69% от контроля. Это может не быть существенным в поле, так как концентрация ДМДП (200 ппм), которая была использована, вдвое больше эффективной дозы, требующейся для контроля нематод.

Пример 7. Тест в канистре. Маленькие канистры, чистые, заполняют приблизительно 25 г почвы. Добавляют 1 мл испытуемого соединения и 1 мл воды, содержащей 1500 яиц PCN. В компост помещают маленькие кусочки картофеля Дезире с побегами. Для закрывания канистр используют крышки, проткнутые 3-4 раза. Затем канистры помещают на поддон, покрытый черным полиэтиленом, и оставляют при постоянной температуре 20^oC. Через 4 нед. осуществляют первый подсчет цист, затем каждую последующую неделю до тех пор, пока не кончится восьмая. Табл. 14 показывает снижения цист по сравнению с контролем. Можно видеть, что ДМДП является эффективным для снижения количества развивающихся цист.

Пример 8. Способы нанесения II. Как продолжение примера 5, был проведен дополнительный эксперимент в песке и почве или с разными растениями и нематодами, чтобы показать различные способы нанесения ДМДП.

Тест на смачивание песка в пробирке (табл.15). Стеклянные пробирки (7,5x2,5 см) заполняют 24,5 г просеянного сухого песка. Добавляют 4 мл наночистой воды и делают отверстие в песке. Добавляют 1 мл испытуемого соединения и 1 мл воды, содержащей 350 Meloidoqyne javanica непосредственно перед посадкой в отверстие ростка томата. Затем все пробирки составляют на 14 дн. В этом эксперименте и в тесте на листья с песком в пробирках (табл.16) готовят ростки, отрезав имеющиеся у них корни и дав регенерировать тонкие придаточные корни перед использованием. Табл.15 показывает действие ДМДП и его соли кислоты в интервале концентраций. Результаты показаны как снижения живых нематод по сравнению с контролем (нет испытуемого соединения).

Тест на листья с песком в пробирках. Заполняют 3 стеклянных пробирки (7,5x2,5 см) 24,5 г просеянного сухого песка. Добавляют 5 мл наночистой воды и сажают в пробирку ростки томатов. Неабсорбирующую хлопковую вату помещают вокруг основания ростка, чтобы защитить песок от разбрызгиваемого испытуемого препарата. Пробирки помещают в инкубатор на всю ночь. На следующий день каждое растение опрыскивают 0,1 мл испытуемого химиката кистью на воздухе и оставляют в инкубаторе. На следующий день в каждую пробирку добавляют 1 мл воды, содержащей 350 Meloidoqyne javanica. Затем все пробирки оставляют на 14 дн. Табл.16 показывает действие ДМДП и его соли кислоты на ряд растений. Результаты показаны как в табл.15.

Нанесение на листья (табл.17). Горшки 2,5 см заполняют 75 г универсальной почвы Левингтона и песком в соотношении 3:1. Растения томатов (возраст 34 дн) сажают в эти горшки и добавляют 1 мл воды. Почву защищают фильтровальной бумагой, и горшки оставляют на ночь в теплице. На следующий день каждое растение опрыскивают 0,3 мл испытуемого соединения кистью на воздухе и затем оставляют на всю ночь в теплице. На следующий день фильтровальную бумагу удаляют и добавляют в почву 350 Meloidoqyne javanica или Meloidoqyne incognita в 1 мл воды. Горшки затем составляют на 12 дн, после чего подсчитывают количество живых и мертвых нематод. Табл.17 показывает действие ДМДП на а) Meloidoqyne javanica и b) Meloidoqyne incognita.

Нанесение на почву (табл. 18). Повторяют предыдущую процедуру с тем исключением, что на первый день в почву вносят 1 мл испытуемого соединения и 1 мл воды с нематодами и оставляют горшки на 14 дн. Результаты показаны в табл.18 обычным образом.

Использование: сельское хозяйство, химические способы защиты растений. Сущность изобретения: листья растений или почву, на которой они произрастают, обрабатывают 2R, 5R-дигидроксиметил-3R, 4R-дигидроксипирролидинном (ДМДП) в эффективном количестве. 2 з.п. ф-лы, 18 табл.

1. Способ защиты растений от заболеваний, вызванных нематодами, включающий контактирование нематод с эффективным для них количеством активного агента вблизи растений, отличающийся тем, что в качестве активного агента используют 2R, 5R-дигидроксиметил-3R, 4R-дигидроксипирролидин (ДМДП) формулы

в виде свободного основания или в виде его сельскохозяйственно приемлемой кислотно-аддитивной соли. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что ДМДП наносят на почву. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что ДМДП наносят опрыскиванием на листья растений.