СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕКСТРАНА Российский патент 1997 года по МПК C12P19/04 C08B37/02 A61K31/715 

Изобретение относится к области биотехнологии и химической технологии, конкретно к способу деполимеризации декстранов, а именно к способу получения декстрана со средневесовой молекулярной массой (м.м.) 1000 Д, который может быть использован в медицинской промышленности препарата, способного предотвращать случаи тяжелых анафилактических реакций при трансфузии декстрановых кровезаменителей с более высокой м.м. декстран 70, декстран 40.

За рубежом широко применяется препарат "Промит" (Швеция), представляющий собой декстран со средневесовой м.м. 1000 Д. Его получают ферментативным синтезом нативного декстрана из сахарозы с применением микроорганизмов вида. Далее нативный декстран подвергается глубокому гидролизу и фракционированию для получения продукта с требуемой м.м. (1).

Указанный препарат обладает свойствами моновалентного гаптена. Субстанция декстрана с м. м. 1000 Д реагируют лишь с индивидуальным реакционным центром декстранового антитела без образования последующих "мостовых" связей и не имеет тенденции к образованию иммунных комплексов.

Избыток моновалентного гаптена, вводимого при внутривенном влиянии, конкурирует с поливалентными гаптенами (препаратами декстрана с более высокой м.м.) в реакциях образования иммунных комплексов и препятствует возникновению анафилаксии.

Широко известен способ частичного расщепления нативного декстрана, который осуществляется путем кислотного гидролиза (2). Процесс проводят в кислой среде при температуре 85 87^oC и постоянном перемешивании. Этот метод применяется для получения декстранов с м.м. 70000 и 40000 Д. Недостатком этого метода является невозможность получения низкомолекулярных декстранов с заданной молекулярной массой, т.к. при глубоком химическом гидролизе процесс неуправляем, и атаке ионами водорода в первую очередь подвергаются более доступные молекулы декстрана с малыми м.м. и в результате значительно возрастает доля ди- и моносахаров в конечном продукте гидролиза.

Описываемый способ направлен на получение декстрана с молекулярной массой ≈ 1000 Д.

Для этого в способе частичного расщепления высокомолекулярного декстрана путем кислотного гидролиза его водного раствора в присутствии соляной кислоты при нагревании подкисленный водный раствор высокомолекулярного декстрана пропускают через сильносшитые катионитные ионообменные смолы макропористой структуры на основе сульфитированных сополимеров стирола с дивинилбензолом в H⁺ форме, имеющих pH 0,85 1,1 при температуре 85±1^oC, со скоростью 0,01 0,25 объема в час.

Способ в соответствии с изобретением заключается в следующем: стеклянную колонку (высота 600 мм, диаметр 35 мм) заполняют катионитной ионообменной смолой (объем смолы 500 мл), пропускают через нее последовательно 1 М раствор NaOH, дистиллированную воду, 1 М раствор соляной кислоты и отмывают дистиллированной водой до pH 0,85 1,1. Водный раствор высокомолекулярного декстрана с концентрацией 5 10% подкисляют соляной кислотой (pH 1,0 1,5) и пропускают через колонку с ионообменной смолой со скоростью 0,01 0,25 объема в час. Процесс частичного расщепления нативного декстрана контролируется вискозиметрически и методом гель-проникающей хроматографии на сефадексе C-15, которая фиксирует от скорости потока водного раствора исходного декстрана через катионит.

Получают растворы частично гидролизованного декстрана со средней молекулярной массой 1300 1700 Д, которые подвергают фракционированию на сефадексе C-15 на колонке, калиброванной декстраном 1000 со скоростью 150 - 220 мл в час.

Преимуществом данного способа является возможность осуществления глубокого гидролиза высокомолекулярного декстрана до декстрана с м.м. 1000 Д с выходом конечного продукта около 50%
Предлагаемый способ позволяет полностью автоматизировать процесс и осуществить его непрерывным поточным методом без использования больших количеств неорганических кислот, что значительно повышает технико-экономические показатели технологии и решает проблему экологии.

Применение в качестве твердофазного катализатора ионообменных смол с размером пор от 250 до 2500 макропористой структуры с высокоразвитой удельной поверхностью (до 350 м²/г), содержащих SO₃H группы, позволяет проводить процесс гидролиза с высокими скоростями и большой избирательностью по молекулярным массам вследствие высоких коэффициентов диффузии молекул декстрана в макропоры ионита.

Пример 1. Через колонку, заполненную 500 мл катионообменной макропористой смолы типа КУ-23, последовательно пропускают 1 М раствор WaOH, дистиллированную воду, 1 М раствор соляной кислоты и отмывают апирогенной водой до pH 0,85, систему термостатируют при температуре 85±1^oC. Водный раствор нативного декстрана (C= 5%) подкисляют соляной кислотой до pH 1,5 и пропускают через колонку и ионообменной смолой со скоростью 0,01 0,04 колонночного объема в час.

Полученный раствор частично гидролизованного декстрана порциями по 200 мл фракционируют на колонке (диаметр 40 мм, высота 600 мм), заполненный носителем сефадекс C-15 (700 мл), со скоростью 0,32 колоночных объема в час, отбирая фракцию, соответствующую по времени выхода эталону декстран 1000, и лиофильно сушат. Выход по сухому веществу 48% M_w=1200 Д. Готовят лекарственную форму, содержащую 15% субстанции декстрана и 0,6% натрия хлорида, стерильно фильтруют, разливают и стерилизуют обычным способом.

Получают стерильный, апирогенный, прозрачный, слегка желтоватый раствор препарата, не отличающийся по физико-химическим и биологическим свойствам от препарата Промит.

Пример 2. Колонку, подготовленную описанным выше способом и отмытую апирогенной водой до pH 0,96, термостатируют при температуре 85±1^oC. Водный раствор декстрана с м.м. 60000±10000 Д (C=10%) подкисляют соляной кислотой до pH 1,0 и пропускают через колонку с ионообменной смолой со скоростью 0,08 0,12 колоночного объема в час и фракционируют со скоростью 0,27 объема в час описанным выше способом. Выход по сухому веществу 53% M_w=1000 Д. Готовят лекарственную форму, содержащую 14,7% субстанции низкомолекулярного декстрана и о,6 натрия хлорида, стерильно фильтруют, разливают и стерилизуют обычным способом.

Получают стерильный, апирогенный, прозрачный, бесцветный раствор препарата, не отличающийся по физико-химическим и биологическим свойствам от шведского препарата Промит.

Пример 3. Колонку, подготовленную описанным выше способом и отмытую до pH 1,1, термостатируют при температуре 85±1^oC. Водный раствор декстрана с м. м. 5000±1500 Д (C= 8%) подкисляют соляной кислотой до pH 1,2 и пропускают через колонку и ионообменной смолой со скоростью 0,18 0,25 колоночного объема в час, фракционируют со скоростью -,20 колоночного объема в час описанным выше способом. Выход по сухому веществу 49% M_w=1100 Д. Готовят лекарственную форму, содержащую 15% субстанции низкомолекулярного декстрана и 0,6% натрия хлорида, стерильно фильтруют, разливают и стерилизуют обычным способом.

Получают стерильный, апирогенный, прозрачный, бесцветный раствор препарата, не отличающийся по физико-химическим и биологическим свойствам от шведского препарата Промит.

Использование: биотехнология, химическая технология, медицинская промышленность для получения препарата низкомолекулярного декстрана. Сущность изобретения: предлагается метод получения декстранов со средневесовой молекулярной массой 1000 Д. В способе частичного расщепления высокомолекулярного декстрана путем кислотного гидролиза его водного раствора в присутствии соляной кислоты при нагревании подкисленный водный раствор высокомолекулярного декстрана пропускают через сильносшитые катионитные ионообменные смолы макропористой структуры на основе сульфитированных сополимеров стирола с дивинилбензолом в H⁺ форме, имеющих pH 0,85 - 1,1, при температуре 85±1^oC со скоростью 0,01 - 0,25 объема в час.

Способ получения декстрана путем кислотного гидролиза водных растворов высокомолекулярных декстранов в присутствии соляной кислоты при нагревании, отличающийся тем, что подкисленный водный раствор высокомолекулярного декстрана пропускают через ионообменную смолу на основе сульфированного сополимера стирола с дивинилбензолом в Н⁺-форме, имеющей pH 0,85 1,1, со скоростью 0,01 0,25 об./ч, полученный гидролизат пропускают через колонку, заполненную носителем сефадекс С-15, со скоростью 0,2 0,32 об./ч и полученную фракцию декстрана с мол.м. 1000 Д высушивают известными методами.