СПОСОБ ОЧИСТКИ ИНСУЛИНА Российский патент 2000 года по МПК A61K38/28 

Изобретение относится к медицинской промышленности, а именно к очистке инсулина, применяемого в терапии сахарного диабета, от антигенных и других примесей, которые сопутствуют инсулинам природного происхождения (из поджелудочной железы свиней и крупного рогатого скота) и биосинтетическому инсулину человека, производимому методами биотехнологии.

Основной антигенной примесью в препаратах инсулина является проинсулин, вызывающий выраженные аллергические реакции при лечении больных сахарным диабетом. Содержание проинсулина в инсулиновых препаратах по современным фармакопейным требованиям не должно превышать 10 частей на миллион (10 п.п. м. ), т. е. не должно составлять более 0,001%. Такие же высокие требования предъявляются и к содержанию бактериальных пептидов в инсулине человека, получаемом методами биотехнологии.

Известен способ очистки инсулина [1] путем сорбции инсулинсодержащего сырья на макропористом сульфокатионите, смешанном с инертным силикатным наполнителем в равном объемном соотношении, с последующей промывкой смеси микродисперсии и наполнителя 0,2 - 0,3 М уксусноаммонийным буфером при pH 5,2 - 6,4 и десорбцией инсулина 0,02 - 0,03 М буферным раствором (трис: фосфатный буфер: ацетат аммония) при pH 6,4 - 7,6. К недостаткам этого способа относятся невысокий выход инсулина после очистки (64-70%) и его большая антигенность (содержание проинсулина 0,5% вместо 0,001%).

Известен также способ получения высокоочищенного инсулина [2] путем многостадийной очистки, включающей вначале катионообменную хроматографию инсулина в фосфатном буфере на сульфокатионите КУ-23И (диаметр частиц 200-300 мкм) с применением для элюирования 0,018-0,022 М линейного фосфатного буфера в градиенте pH от 6,7 - 6,8 до 7,9 - 8,0 с последующим выделением инсулина изоэлектрическим осаждением; далее осажденный инсулин подвергают циркуляционной гель-проникающей хроматографии при 4 - 6^oC на Сефадексе G-50 сверхтонкий (фирма Pharmacia, Швеция) в 1 М уксусной кислоте, после чего хроматографируют при 6-8^oC на колонке с анионообменным силикагелем PAE-300 (фирма Amicon, США) в элюенте с pH 7,8 - 8,5, состоящем из ТРИС/HCl, трилона Б и этанола (50-60 об.%), с экспотенциальным градиентом хлорида натрия (0,0 - 1,0 М). После цитратной кристаллизации получают инсулин, отвечающий современным требованиям по антигенности, но достигается этот результат слишком большой затратой материальных и трудовых ресурсов, при этом выход инсулина невысокий - 55 - 65%. К недостаткам рассматриваемого способа очистки инсулина следует отнести также использование импортных носителей и оборудования для колоночной хроматографии, что дополнительно ограничивает возможность его практического использования.

Наиболее близким к предлагаемому является способ очистки инсулина [3] посредством гель-проникающей хроматографии на сшитых декстрановых гелях в 0,5 М уксусной кислоте (прототип). После очистки по этому способу инсулина крупного рогатого скота (к.р.с.) с исходным содержанием инсулина и проинсулина соответственно 92,5 и 4,21% получают инсулин к.р.с., еще содержащий 0,44% проинсулина (вместо требуемого содержания не более 0,001%). При аналогичной гель-проникающей хроматографии свиного инсулина (содержание в исходном материале инсулина и проинсулина 90,7 и 2,42% соответственно) получают инсулин, также лишь частично очищенный от проинсулина: в целевом продукте его количество составляет 0,57%, т.е. превышает требуемое в 570 раз.

Таким образом, известный способ не позволяет получать инсулин требуемой степени чистоты в отношении основной антигенной примеси - проинсулина.

Целью изобретения является разработка простого способа очистки инсулина, одновременно обеспечивающего его высокий выход и качество, отвечающее современным фармакопейным требованиям к инсулинам животного происхождения и к биосинтетическому инсулину человека.

Для улучшения качества и обеспечения высокого выхода инсулина по заявляемому способу свиной инсулин, инсулин к.р.с. или биосинтетический, например, генно-инженерный инсулин человека подвергают гель-проникающей хроматографии в водной уксусной кислоте на гидрофильном геле ("Гефил-1") [4].

Заявляемый способ осуществляется следующим образом.

В колонну с нейтральным носителем "Гефил-1", уравновешенным в 0,7-1,2 М уксусной кислоте, вводят раствор инсулина (с содержанием монофракции инсулина не менее 80%) в 0,7-1,2 М уксусной кислоте с концентрацией инсулина от 5 до 15% и с общим количеством инсулина от 4,0 до 7,0 г на 1 л уравновешенного геля. Инсулин элюируют 0,7-1,2М раствором уксусной кислоты при скорости потока от 2,0 до 5,0 мл (см²•ч) при 8 - 15^oC. Из основной массы элюата известным способом (путем осаждения аморфного инсулина с последующей цитратной кристаллизацией) выделяют высокоочищенный монокомпонентный инсулин. Чистоту выделяемого инсулина определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), а содержание проинсулина и бактериальных пептидов (в случае биосинтетического, например, генно-инженерного инсулина человека) методом радиоиммунологического анализа (РИА).

Выход целевого продукта составляет 75-85% с содержанием монофракции инсулина 98,0-98,5%, при этом содержание проинсулина составляет менее 2 п.п.м., а содержание бактериальных пептидов (в биосинтетическом инсулине человека) - менее 1 п.п.м. (т.е. менее 0,0001%), количества дезамидоинсулина и неидентифицированных примесей во всех случаях не превышают 1% (ВЭЖХ).

Таким образом, получаемый по заявляемому способу инсулин (из животного сырья или человеческий биосинтетический) по своим характеристикам отвечает требованиям мировых стандартов, что не обеспечивается известным способом очистки инсулина.

Пример 1. 2,0 г свиного инсулина с активностью 25,0 ЕД/мг (по данным биотестирования) и содержанием проинсулина 2800 п.п.м. (по данным РИА) растворяют в 1 М растворе уксусной кислоты до концентрации инсулина, равной 10%. Раствор инсулина вводят в колонку (внутренний диаметр 5,0 см, высота 22 см), заполненную гидрофильным гелем "Гуфил-1", уравновешенным 1М уксусной кислотой (нагрузка инсулина на колонку составляет 4,6 мг/мл геля), и элюируют инсулин 1М раствором уксусной кислоты при 10^oC со скоростью 2,4-2,6 мл/(см²•ч). Из основной части элюата выделяют высокоочищенный монокомпонентный инсулин известным способом. Получают 1,6 г свиного инсулина с содержанием принсулина 1,0 п.п.м. (по данным РИА) и активностью 27,7 ЕД/мг (по данным биотестирования). Выход по массе 80,0% от исходной субстанции инсулина. Выход по монофракции инсулина - 88,6%.

Пример 2. 43,8 г свиного инсулина с активностью 25,2 ЕД/мг (по данным биотестирования) и содержанием проинсулина 3500 п.п.м. (по данным РИА) растворяют в 1 М уксусной кислоте до концентрации инсулина, равной 12%. Раствор инсулина вводят в колонну (внутренний диаметр 10,0 см, высота 100 см), заполненную гидрофильным гелем "гефил-1", уравновешенным 1М уксусной кислотой (нагрузка инсулина на колонну составляет 7,3 мг/мл геля) и элюируют инсулин 1М уксусной кислотой при 10^oC со скоростью потока 1,9-2,1 мл/(см²•ч). Высокоочищенный могокомпонентный инсулин выделяют известным способом из части элюата, соответствующей основному пику. Получают 32,9 г свиного инсулина с содержанием проинсулина 1,7 п.п.м. (по данным РИА) и активностью 27,5 ЕД/мг (по данным биотестирования). Выход по массе - 75,1% от неочищенной субстанции инсулина. Выход по монофракции инсулина - 82,0%.

Пример 3. В условиях, описанных в примере 1, проводят очистку 2,0 генно-инженерного инсулина человека с активностью 26 ЕД/мг (по данным биотестирования), с содержанием проинсулина 2840 п.п.м. и бактериальных пептидов 503,5 п.п.м. (по данным РИА). Получают 1,55 г инсулина человека с содержанием проинсулина 0,6 п.п.м. и бактериальных пептидов 0,5 п.п.м. (по данным РИА), и активностью 28,5 ЕД/мг (по данным биотестирования). Выход по массе составляет 77,5% от исходной субстанции инсулина. Выход по монофракции инсулина - 84,9%.

Литература
1. Авторское свидетельство СССР N 1007675, A 61 K 37/26, 30.03.83. (Институт высокомолекулярных соединений АН СССР, Ленинградский завод медпрепаратов "Ленмясопром").

2. Патент РФ N 2120299, A 61 K 38/28, 20.10.98 (Акционерное Курганское общество "Синтез").

3. Патент ФРГ N 2505307, C 07 C 103/52, 29.11.84 (Eli Lilly and Co., Indianapolis, Ind., US)
4. Патент РФ N 2076871, C 08 B 37/02, 10.04.97.

Изобретение относится к области медицины, а именно к очистке применяемого в терапии сахарного диабета инсулина, выделяемого из животного сырья или же получаемого методами биотехнологии (например, генно-инженерного инсулина человека). Очищаемый инсулин подвергают гель-хроматографии в 0,7-1,2 М уксусной кислоте на колонне, заполненной гидрофильным гелем, полученным поликонденсацией полиглюкина с эпихлоргидрином и уравновешенным 0,7-1,2 М раствором уксусной кислоты. При загрузке на колонну количество инсулина составляет 4-7 г на литр уравновешенного геля, при этом концентрация инсулина в наносимом растворе составляет 5-15%. Элюирование инсулина осуществляют при 8-15°С со скоростью потока 2,0-5,0 мл/(см²•ч), целевой продукт выделяют цинковым осаждением и подвергают цитратной кристаллизации, получают инсулин с выходом 75-85% и содержанием монофракции инсулина 98,0-98,5%, при этом содержание проинсулина составляет менее 2 п.п.м., содержание бактериальных пептидов (в генно-инженерном инсулине человека) - менее 1 п.п.м. (т.е. менее 0,0001%), а количества дезамидоинсулина и неидентифицированных примесей во всех случаях не превышает 1% (методы РИА и ВЭЖХ). Техническим результатом изобретения является получение высокоочищенного инсулина. 4 з.п.ф-лы.

1. Способ очистки инсулина путем наслоения исходного препарата инсулина на хроматографическую колонку, содержащую гидрофильный гель, уравновешенный в водном растворе уксусной кислоты, элюирования целевого продукта раствором уксусной кислоты с последующим цинковым осаждением, отличающийся тем, что для хроматографии используют гель, приготовленный поликонденсацией полиглюкина с эпихлоргидрином в водно-щелочной среде, уравновешивание геля и элюирование осуществляют раствором уксусной кислоты в концентрации 0,7 - 1,2 М, а полученный целевой продукт подвергают цитратной кристаллизации. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что проводят очистку биосинтетического и полусинтетического препарата инсулина. 3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что проводят очистку инсулина человека, полученного генно-инженерным методом (рекомбинантным). 4. Способ по пп.1 - 3, отличающийся тем, что концентрация инсулина при нанесении на колонку составляет 5 - 15% по весу на объем наносимого раствора. 5. Способ по пп. 1 - 4, отличающийся тем, что количество инсулина при загрузке на колонку составляет 4 - 7 г на литр уравновешенного геля.