СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПУЗЫРЧАТКИ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии и может быть использовано для диагностики пузырчатки.

Известен способ диагностики пузырчатки с использованием цитологического анализа. Заболевание диагносцируется на основании обнаружения на поверхности эрозий или дна пузырей акантолитических клеток (Tzanck A. Le citodiagnostic immediat en dermatologic. Ann.Derm. Siph. 1948, 55, 205-218). При микроскопии мазков со свежих поражений кожи или слизистой больных истинной пузырчаткой, как правило, обнаруживаются акантолитические клетки Тцанка.

Однако несмотря на достаточно высокую информативность этого метода, обнаружение акантолитических клеток еще не подтверждает диагноза истинной пузырчатки, так как акантолиз может наблюдаться и у больных хронической доброкачественной семейной пузырчаткой Гужеро- Хейли-Хейли, истинной экземе, фолликулярным дискератозом Дарье и различными вирусными пузырьковыми поражениями кожи.

В сомнительных случаях для подтверждения диагноза истинной пузырчатки проводят гистологическое исследование биоптатов пораженной кожи или слизистой оболочки (Ромейс В. Микроскопическая техника, 1954, 48-175). Объекты из патологически измененных тканей иссекают на границе с нормальными частями так, чтобы были захвачены вместе и нормальные, и измененные участки. Первым этапом обработки кусочков является фиксация с целью закрепления тканевых структур в том виде, какой они имели в момент иссечения кусочка ткани. Кусочки толщиной 0,5-1,0 см фиксируют в 10- 20%-ном формалине в течение 24-48 ч. После фиксации в формалине ткань можно сразу резать на замораживающем микротоме, либо подвергать дальнейшей обработке для заливки в целлоидин или парафин. Результаты оцениваются с помощью светового микроскопа. Ранним гистологическим признаком пузырчатки является межклеточный отек эпидермиса и деструкция десмосом в нижних участках мальпигиева слоя. В результате акантолиза в эпидермисе образуются щели, а затем пузыри над базальным слоем. В дерме воспалительные явления небольшие или вовсе отсутствуют. Недостатком при использовании этого метода является существование сходных изменений при некоторых других заболеваниях, например, себорейном дерматите, импетиго, розовом лишае, буллезной многоформной экссудативной эритеме, вегетирующей пиодермии, болезни Дарье.

Наиболее перспективным направлением в диагностике пузырчатки является иммунофлюоресцентное исследование, применяемое для обнаружения методом прямой иммунофлюоресценции фиксированного иммуноглобулина класса G в межклеточной склеивающей субстанции эпидермиса больного. Данный способ принят нами за прототип. Иммунолюминесценция в медицине. Под ред. Е.Н.Левиной, М. Медицина, 1977, с.145-183.

Известный способ осуществляют следующим образом. Ткань биоптата замораживают при низкой температуре. Серийные срезы из замороженной нефиксированной ткани толщиной 5 мкм готовят в криостате (-20^oC), помещают на предметное стекло, подсушивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем срезы промывают в физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS), pH 7,0-7,4, в течение 10 мин с целью удаления не связанных с тканями растворимых белков и обрабатывают люминесцирующей сывороткой (метка изотиоцианатом флюоресцеина) против иммуноглобулинов классов (G, M, A) в течение 30 мин. Затем вновь промывают PBS в течение 10 мин и заключают под покровное стекло и 60%-ный нейтральный глицерин.

Для контроля одновременно проводят изучение криостатных срезов, окрашенных гематоксилином и эозином в световом микроскопе. При исследовании срезов кожи или слизистой больных пузырчаткой после обработки в люминесцентном микроскопе связанный с тканью иммуноглобулин класса G обнаруживается в межклеточных пространствах многослойного плоского эпителия. Как правило, он имеется как в участках пораженной кожи, так и в участках без видимых поражений. Однако в участках с наличием сильных нарушений структуры кожи или слизистой оболочки нередко можно обнаружить лишь следы фиксированного иммуноглобулина. Особая практическая ценность метода иммунофлюоресценции при данном заболевании связана с тем, что он позволяет провести диагностику пузырчатки и отдифференцировать ее от других хронических буллезных дерматозов. При буллезном пемфигоиде, например, отмечается фиксация иммуноглобулина класса G в зоне базальной мембраны, а при дерматите Дюринга в той же локализации иммуноглобулина класса А.

К недостаткам метода относится возможность получения как ложноположительных, так и ложноотрицательных иммуноморфологических реакций (по нашим данным в 5% и 23% соответственно). Ложноположительные реакции при прямой иммунофлюоресценции встречаются при некоторых других заболеваниях, таких например, которые могут быть вызваны действием лекарственных препаратов, при болезни Гроувера, афтозном стоматите. Ложноотрицательные и слабые реакции, не позволяющие с уверенностью поставить диагноз пузырчатки, отмечаются либо в начале заболевания, либо в период ремиссии и на фоне медикаментозного лечения. Отрицательные реакции иммунофлюоресценции в срезах биопсии в этих случаях могут быть связаны с синтезом небольших трудноуловимых количеств аутоантител к антигенам межклеточной склеивающей субстанции, кроме того, в связи со слабой афинностью (степенью связывания с антигеном) аутоантител и быстрым распадом иммунного комплекса, а также наличием в тканях иммунных комплексов в растворимой форме. Наличие ложноотрицательных реакций в известном способе снижает его точность до 77%
Целью изобретения является повышение точности диагностики пузырчатки.

Предлагаемый способ диагностики пузырчатки путем иммунофлюоресцентного метода отличается тем, что производят предварительную обработку срезов 40-60% -ной водной смесь этанола в течение 1-3 мин. Модифицированная методика: использовались слабо фиксированные срезы в стабилизирующем растворе 40-60% -ном этанола. При использовании водной смеси этанола нами установлено, что такое мягко денатурирующее средство как 40-60%-ная водная смесь этанола стабилизирует связь между антителом и тканевым антигеном, препятствуя вымыванию антител к антигенам межклеточной склеивающей субстанции из срезов, что выражается в выявлении реакции в межклеточных пространствах. Выраженной коагуляции растворимых белков при этом не происходит, что удается проконтролировать с помощью обработки срезов более сильными фиксирующими жидкостями, например, 96% -ным этанолом. В последнем случае выявляется иммуноглобулин G плазмы крови в просветах сосудов дермы и иммуноглобулин G экссудативной жидкости, пропитывающей дерму или эпиредмис. Экспериментальным путем нами установлены параметрические значения реализации способа: 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 96% водной смеси этанола и выявили, что оптимальным для проявления реакции является 50%-ная водная смесь этанола, но возможно использовать раствор в параметрах от 40% до 60% Использовать менее концентрированную водную смесь этанола нельзя вследствии слабого стабилизирующего эффекта. Более высокая концентрация (60-96% ) приводит к коагуляции растворимых белков тканевых жидкостей. При обработке срезов менее 1 мин полного эффекта не достигается, более длительная обработка (более 3 мин) полученный эффект не усиливает.

Пример 1. Обследована больная К. 69 лет. Больна около месяца. Впервые высыпания появились на слизистой оболочке полости рта в виде эрозий. Проводилось лечение по поводу стоматита стоматологом по месту жительства без эффекта.

При поступлении в кожную клинику МОНИКИ общее состояние больной было удовлетворительным. Ведущие жалобы: высыпания на слизистой оболочке полости рта, трудность при глотании. При осмотре: патологический процесс носил локальный характер, располагался на слизистой левой щеки, небных дужек, корня и боковых поверхностях языка, десен, особенно выражен у основания нижних зубов. Процесс представлен эрозиями с ярко-красным дном, линейной и овальной форм, несливающиеся между собой, различных размеров. На слизистой левой щеки
покрышка эпителия вскрывшегося пузыря, отмечалась отслойка эпителия от подслизистого слоя. Симптом Никольского положительный. Отмечалась мацерация слизистого твердого неба и задней стенки глотки. Слезотечение глаз. Кожа клинически интактна.

Проводилась дифференциальная диагностика между пузырчаткой акантолитической и буллезным пемфигоидом. С этой целью использовались цитологический, гистологический и иммуноморфологический методы исследования. При исследовании мазков- отпечатков со дна эрозий найдены единичные эпителиальные клетки с начинающимся акантолизом. При гистологическом исследовании слизистой полости рта отмечалась десквамация покровного эпителия с частично сохранившимся базальным слоем, обширные участки изъязвления, замещенные грануляциями. Наблюдаемые изменения при данных методах исследования не прояснили картину в плане дифференциальной диагностики
Учитывая способность кожи элиминировать иммунные комплексы, нами был изучен биоптат клинически интактной кожи в прямой иммунофлюоресценции. При обработке криостатных нефиксированных срезов сыворотками против основных классов иммуноглобулинов (A, M, G) и третьего компонента комплемента была отмечена диффузная реакция с сывороткой против иммуноглобулина класса G по эпидермису и местами очень слабая фиксация иммуноглобулина класса G по межклеточной склеивающей субстанции (МСС) эпидермиса и волосяных фолликулов, что вызывало сомнение в постановке диагноза акантолитической пузырчатки, но дало возможность исключить буллезный пемфигоид в связи с отсутствием фиксации иммуноглобулина класса G в зоне базальной мембраны. В дальнейшем нами были использованы криостатные срезы, предварительно обработанные 40%-ной водной смесью этанола в течение одной минуты. При обработке сывороткой против иммуноглобулина класса G при этом выявлена четкая реакция по МСС эпидермиса, что характерно для вульгарной пузырчатки.

На основании полученных результатов больной выставлен диагноз: вульгарная пузырчатка слизистой полости рта и проведена кортикостероидная терапия (максимальная доза преднизолона составила 100 мг per os с постепенным снижением дозы до 25 мг в день). Больная выписана с положительным клиническим эффектом (полная эпителизация эрозий слизистой полости рта, отсутствие болезненности при глотании и слезотечения).

Пример 2. Обследован больной Х. 54 лет. Болен около полугода. Впервые высыпания появились на коже в подключичной области справа в виде пузырька с серозным содержимым. Со слов больного через 1-2 дня на месте пузыря образовалась эрозия, которая быстро заэпителизировалась. Через неделю с момента эпителизации эрозии на том же самом месте появился пузырь. Больной дерматологом по месту жительства был направлен в Московский областной кожно-венерологический диспансер (МОКВД) с диагнозом себорейная пузырчатка. Там были исследованы мазки-отпечатки со дна эрозий. Акантолитические клетки не обнаружены. Акантолитическую пузырчатку исключили и назначили мазевую терапию. Однако на фоне проводимой терапии появлялись новые высыпания в виде пузырей. С предварительным диагнозом: пемфигоид Левера направлен на госпитализацию в кожную клинику МОНИКИ.

При поступлении состояние больного было удовлетворительным. Ведущие жалобы: пузыри и эрозивные высыпания на коже. При осмотре: патологический процесс локализован на коже подключичной области справа, грудины и межлопаточной области в виде эрозий размерами до 5 мм в диаметре, несливающиеся между собой, местами в виде геморрагических корочек. На коже спины (межлопаточная область) наблюдались единичные напряженные пузыри размером до 5 мм в диаметре на неизмененном фоне кожи. Симптом Никольского отрицательный. Видимые слизистые и кожа волосистой части головы свободны от высыпаний. Повторно исследованы мазки отпечатки из содержимого пузыря. Акантолические клетки не найдены, обнаружены эозинофилы (5- 10 в поле зрения). Из анамнеза: начальный сахарный диабет. Наследственность: у матери рак губы.

Проводилась дифференциальная диагностика между буллезным пемфигоидом и акантолитической пузырчаткой. В непрямой иммунофлюоресценции была исследована сыворотка больного на срезах кожи, пищевода обезьяны и кролика. Картина, характерная для буллезного пемфигоида и вульгарной пузырчатки отсутствовала (циркулирующих в крови аутоантител не выявлено). В прямой иммунофлюоресценции исследован материал биопсии клинически здоровой кожи больного. Нефиксированные криостатные срезы обрабатывали меченным изотиоцианатом флюоресцеина антителами к основным классам иммуноглобулинов (A, M, G) и С3 компоненту комплемента. Установлено отсутствие связанных с тканью иммуноглобулинов класса G в зоне базальной мембраны, по МСС и наличие их в цитоплазме клеток шиповатого слоя эпидермиса. Это давало повод исключить буллезный пемфигоид и пузырчатку акантолитическую. В дальнейшем были использованы криостатные срезы предварительно обработанные 50% водной смесь этанола в течение двух минут, при обработке которых антителами против основных классов иммуноглобулинов была обнаружена фиксация иммуноглобулинов класса G по МСС шиповатого слоя эпидермиса, местами в цитоплазме клеток, на поверхности и в эрозивных участках рогового слоя эпидермиса.

На основании полученных данных больному выставлен диагноз: вульгарная пузырчатка. Спустя неделю после проводимой терапии витамином С (по 0,5 г 2 раза в день) с целью стимуляции функции коры надпочечников, повторно проведено иммуноморфологическое исследование с видимо непораженного участка (клинические новых высыпаний не было, эрозии заэпителизировались). Отмечалась положительная динамика количество фиксированных в МСС иммуноглобулинов класса G значительно уменьшилось. Учитывая положительную клиническую и иммуноморфологическую динамику больной был выписан в удовлетворительном состоянии с рекомендациями в дальнейшем принимать аскорбиновую кислоту по 1 грамму в день и местно применять (в случае вновь появившихся пузырей) полькортолон (аэрозоль).

Пример 3. Обследована больная И. 63 лет. Больна около 8 лет. Впервые высыпания появились на коже живота и под молочными железами в виде пузырей. По месту жительства проводили лечение по поводу псориаза, которым больная страдает около 17 лет. Положительного эффекта от лечения не наблюдалось. Спустя год после появления буллезных высыпаний больная консультирована в МОКВД, где диагносцирована пузырчатка. Диагноз подтвержден цитологическим исследованием (найдены акантолитические клетки). Проводилось лечение преднизолоном (12 табл. в сутки) с положительным клиническим эффектом. Эрозии заэпителизировались и в дальнейшем (около 6 лет) не вызывали беспокойства. Около года назад на почве сахарного диабета, гипертонической болезни острое нарушение мозгового кровообращения (ОНМК) справа. На фоне проводимой неврологической терапии по поводу ОНМК появился сильный зуд и пузырь на коже в межлопаточной области.

При поступлении в кожную клинику МОНИКИ состояние больной было удовлетворительным. Ведущие жалобы: зуд, ощущение жжения в области буллезных высыпаний. При осмотре: процесс носил распространенный характер, локализовался на коже верхних и нижних конечностей (преимущественно на разгибательной поверхности), спины, живота. Патологический процесс был представлен множественными пятнами розового цвета, слегка шелушащимися, единичными папулами величиной 0,5-0,7 см в диаметре, покрытыми серебристыми мелкими чешуйками. Псориатическая триада положительная. На коже спины в межлопаточной области имелся крупной величины эрозивный дефект размером 10х15 см, сплошь покрытый серозно-гнойной корочкой, слоистого характера. Вокруг очага - выраженная воспалительная реакция. На коже над правой лопаткой имелась эрозия размером 3х5 см, покрытая серозно-гнойной корочкой с выраженно воспалительным венчиком. Для подтверждения вульгарной пузырчатки больной было проведено цитологическое, гистологическое и иммуноморфологическое исследования. Цитологически найдены акантолитические клетки. Гистологически - внутриэпидермальные пузыри, преимущественно супрабазальные, содержащие акантолитические клетки. В непрямой иммунофлюоресценции была исследована сыворотка больной на срезах пищевода обезьяны и кролика. Картина, характерная для вульгарной пузырчатки отсутствовала, циркулирующие аутоантитела не обнаружены. В дальнейшем нами был изучен биопсийный материал кожи больной. В прямой иммунофлюоресценции использовали меченные изотиоцианатом флюоресцеина антитела к основным классам иммуноглобулинов и С3 компоненту комплемента. При обработке криостатных нефиксированных срезов установлено скопление материала в виде мелких гранул в верхних отделах дермы, пылевидные гранулы по эпидермису и на его поверхности. Характерная картина для вульгарной пузырчатки (отложения иммуноглобулина класса G по межклеточной склеивающей субстанции эпидермиса) отсутствовала. В дальнейшем нами был использован модифицированный метод прямой иммунофлюоресценции с использованием криостатных срезов, обработанных водной смесью этанола. При обработке криостатных срезов фиксированных 60%-ной водной смесью этанола в течение трех минут антителами к иммуноглобулинам класса G выявлена фиксация иммуноглобулинав по МСС шиповатого слоя в виде гранул.

Суммарные данные клинического, цитологического, гистологического и иммуноморфологического (модифицированная методика) исследования подтвердили диагноз: вульгарная пузырчатка и позволили провести соответствующую терапию. Максимальная доза преднизолона составила 100 мг per os в день с постепенным снижением до 40 мг. Больная выписана в удовлетворительном состоянии с полной эпителизацией эрозий.

К настоящему времени предлагаемым способом обследовано 35 больных, из них 22 человека, страдающих пузырчаткой акантолитической и 13 больных в контрольной группе различными заболеваниями (острым лейкозом, ревматизмом, ревматическим пороком сердца, хронической почечной недостаточностью, красным плоским лишаем, склеродермией, буллезным пемфиноидом, токсикодермией). У двух больных из контрольной группы с буллезным пемфигоидом диагноз пузырчатка акантолитическая был снят. В процессе исследования срезов ткани больных с диагнозом пузырчатки при использовании стабилизирующего раствора (40-60% -ная водная смесь этанола) во всех 22-х случая была отмечена фиксация иммуноглобулина класса G по межклеточной склеивающей субстанции эпидермиса. В 12-ти случаях из 22 этих больных без применения 40-60%-ной водной смеси этанола реакцию выявить не удалось. В пяти случаях из 22-х реакция была слабой и усиливалась только после применения стабилизирующегося раствора. Полученные результаты иммунофлюоресценции координировали с клиническими, цитологическими и гистологическими наблюдениями.

Таким образом, предлагаемая методика позволяет в 100% случаях осуществлять достоверную диагностику заболевания. По сравнению со способами-аналогами предлагаемый метод менее трудоемок (исследование занимает около 1 ч).

Использование: в области медицины, а именно в дерматологии. Сущность изобретения: срезы из нефиксированной ткани толщиной 5 мкм готовят в криостате (-20^oC), обрабатывают 40-60%-ной водной смесью этанола, промывают в физиологическом растворе, pH 7,0-7,4 10 мин с целью удаления не связанных с тканями белков, обрабатывают люминесцирующей сывороткой против иммуноглобулина G 30 мин, промывают 10 мин и заключают в 60% нейтральный глицерин, после чего исследуют криостатные среды органов больного на наличие иммуноглобулина G в межклеточной субстанции многослойного плоского эпителия, после чего диагностируют пузырчатку. Способ позволяет повысить точность диагностики пузырчатки.

Способ диагностики пузырчатки, включающий иммунофлюоресцентное исследование криостатных срезов органов больного на наличие иммуноглобулина G в межклеточной склеивающей субстанции многослойного плоского эпителия, отличающийся тем, что предварительно срезы ткани биопсии интактной кожи обрабатывают 40 60%-ной водной смесью этанола в течение 1 3 мин.