СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ ВИРУСОВ Российский патент 1997 года по МПК C12N7/00 A61K39/12 

Изобретение относится к способу выращивания вирусов.

Способы выращивания вирусов и вирусных агентов известны. Исходными материалами для этих способов часто являются так называемые культуры первичных клеток, которые получают из тканей человека и животных. Эти первичные клетки инфицируют вирусом ("посевным вирусом") и размножением вируса образуют антиген.

Методика размножения, например, таежного весенне-летнего энцефалита /вирус/ FSME вирус/ изложена в патенте Австрии В 358167, в котором описан способ выращивания вирусов, предусматривающий инфицирование посевным материалом клеточной культуры куриных эмбрионов, суспендирование ее в питательной среде с последующим культивированием и выделением вирусов. Для этой цели полученную таким образом биомассу выдерживают в аэробных условиях при температуре от 25 до 38^oC в течение 1-5 дней в суспензии. После этого клетки, а затем части клеток отделяют центрифугированием, полученную вирусную суспензию инактивируют посредством формалина или β-пропиолактона и вирусный агент концентрируют при помощи ультрафильтрации, очищают и обычным образом перерабатывают в вакцины.

При обычных обработках первичных клеточных культур особое внимание обращают на то, чтобы получить отдельные клетки или по возможности, максимально небольшие соединения клеток. Для достижения этой цели ткань необходимо механически или ферментативно максимально сильно измельчить. Такая обработка приводит однако одновременно также и к отмиранию многих клеток. Если такие клеточные приготовления поселяют на поверхности подходящих носителей, то мертвые клетки могут остаться в надосадочной жидкости. При применении таких клеточных приготовлений в суспензиях культур для производства вирусного антигена FSME нет никакой возможности отделить живые клетки от мертвых или же поврежденных клеток. Происходящий со временем лизис клеток ведет впоследствии к значительным загрязнениям протеинов клетки в среде, которые с трудом отделяются от желаемого продукта.

Так незначительна и репродуцируемость производства вируса/вирусного антигена при применении отдельных клеток или небольших клеточных агрегатов в суспензии, потому что это приводит к сильному повреждению клеток, например, из-за воздействия режущих усилий во время процесса перемешивания.

Настоящее изобретение ставит перед собой задачу устранения вышеперечисленных недостатков и тем самым разработку способа выращивания вирусов, согласно которому вирусы можно получать из питательной среды с высокой чистотой и производительностью.

Задача решается тем, что в качестве клеточной культуры куриных эмбрионов используют биомассу, состоящую из клеточных агрегатов куриных эмбрионов размером 100 1000 мкм, которую после инфицирования вирусосодержащим материалом культивируют в питательной среде при содержании кислорода не менее 0,01 ммоль/л, преимущественно 0,006 ммоль/л, при этом биомасса для выращивания вирусов при культивировании обеспечивает высокую производительность вирусов, проста в обращении и может быть использована для широкомасштабного производства вирусов.

Способ согласно изобретению позволяет получать клеточные агрегаты посредством механической или ферментативной обработки куриных эмбрионов, причем размельченную механическим путем массу для дальнейшего распадения клеточных скоплений можно продолжить измельчать до желаемой величины клеточных агрегаций при помощи протеазы, как, например, трипсином, химотрипсином или эластазой.

Клеточные агрегации биомассы можно получать также и из отдельных клеток человека или животных, обрабатывая последние при помощи агрегатирующих клетки субстанций, как, например, агглютинином.

Отделение клеточных агрегаций и отдельных клеток с диаметром больше, чем 1000 mм или меньше, чем 100 μм можно осуществлять просеиванием или же преимущественно осаждением. Проводить осаждение по сравнению с просеиванием легче, потому что легко происходит закупорка сит, содержащих величину пор, равную 100 μм. Кроме того, осаждение производится без сложных и дорогих сепарирующих устройств, причем здесь имеются также преимущества в отношении обеспечения стерильности. Оказалось, что клеточные агрегации с диаметром между 100 μм и 1000 μм осаждаются со скоростью свыше 1 см/мин, в то время как меньшие клеточные агрегации осаждаются со скоростью менее 1 см/мин. Отделение частиц с крупностью менее 1000 μм можно производить простым путем при помощи сит, потому что в данном случае возможность закупорки сит небольшая.

Предпочтительная форма выполнения способа согласно изобретению отличается тем, что культивирование проводят при исходной метаболической активности биомассы, измеренной по потреблению глюкозы, равной 5 мг глюкозы на грамм биомасс в ч.

Клеточные агрегации, применяемые в способе с использованием биомассы, согласно изобретению обладают, кроме того, также и тем преимуществом, что они уже при инфицировании сравнительно небольшим количеством посевного вируса производят большое количество антигена. Оказалось, что для инфицирования клеточных агрегаций (менее, чем 100 μм или более, чем 1000 μм) необходимо применять существенно большее количество посевного вируса, чтобы получить такое же количество вируса/вирусного антигена.

Производство вируса/вирусного антигена можно дополнительно повысить, если биомассу выдерживать в питательной среде при концентрации кислорода, равной по меньшей мере 0,01 ммоль/л, но преимущественно по меньшей мере 0,06 ммоль/л.

Выгодно, если по способу согласно изобретению культивирование проводят при исходной биомассе, равной 10 30 мг клеточных агрегаций на 1 мл питательной среды.

Способ согласно изобретению особенно пригоден для производства вируса таежного весенне-летнего энцефалита (вирус FSME) вирусного антигена, если она состоит из клеточных агрегаций клеток куриного эмбриона, при этом производительность при получении вируса/вирусного антигена можно далее повысить тем, если в питательной среде устанавливают долю кислород-трансфер на уровне 1,60 ммоль О₂ • 1 л^-1 ч^-1oC 2,40 ммоль О₂ • 1 л^-1 • ч^-1, но преимущественно между 1,65 и 2,40 ммоль О₂ • 1 л^-1 • 1 ч^-1.

Доля кислород-трансфер (oxygen transfer rate, OTR) выраженная в ммоль О₂ • л^-1 • 1 ч^-1, является, как известно, мерой внесения кислорода в клеточную культуру. Доля поглощения кислорода (oxygen uptake rate, OUR) является в свою очередь метаболической производительностью клетки в общем и тем самым косвенным указанием на производительность вируса/вирусного антигена клетки.

Согласно всем известным сегодня методикам производства вирусного антигена FSME удельная производительность вирусного антигена ограничена, потому что наличие большого количества инфицированных клеток в питательной среде может привести к нежелательной инактивации вирусного титра и разрушению вирусного антигена.

Было обнаружено, что значение pH такой сильно аэрированной культуры не снижается и что можно поддерживать постоянным уровень производительности вируса/вирусного антигена, если в питательную жидкость вводить достаточное количество кислорода, например, перемешиванием или же посредством постоянного и/или динамического газораспределителя.

Как показали измерения, культура с плотностью клеток, равной 2 • 10⁷ клеток на миллилитр, которая контактирует с кислородной атмосферой исключительно через свою поверхность, в значительной степени снижает производительность FSME. Если же, напротив, активным образом вносить кислород в культуру, то выход антигена может сильно возрасти.

Предпочтительная форма выполнения способа согласно изобретению заключается в том, что при скорости переноса кислорода в питательной среде, равной 1,65 ммоль O₂ • 1 л^-1 • 1 ч^-1, концентрацию биомассы в питательной среде устанавливают на уровне 30 мг на 1 мл питательной среды.

Эксперименты показали, что производительность вируса FSME /вирусного антигена пропорциональна концентрации применяемой согласно изобретению клеточной агрегации. Способ согласно изобретению можно осуществлять также при концентрации клеточных агрегаций, равной менее чем 10 мг/мл. В противоположность этому, было установлено, что в случае культивации инфицированных отдельных клеток необходима обязательно минимальная концентрация для производства вируса/вирусного антигена, равная 10 мг/мл.

Высокие титры посевного вируса, необходимые для инфицирования первичных клеточных культур достигают, как всегда размножением вируса в мозгу мыши. Благодаря тому, что клеточные агрегации согласно изобретению можно инфицировать существенно небольшим количеством вируса, существует возможность получать необходимый для инфицирования биомассы посевной вирус из надосадочной клеточной культуры. Это значительно снижает вероятность контаминации протеина мозга мыши.

Оказалось, кроме того, что биомасса, используемая в способе и согласно изобретению состоящая из клеточных агрегаций куриных эмбрионов, точно так же пригодна для производства вирусного антигена гриппа вакцины или авипокса (Avipox).

Заявленным способом сначала получают по большей части именно все вирусы. Из полученной суспензии вирусов, например, путем разрушения структуры вирусов при переработке, возникают вирусные антигены (= вирусные фрагменты), несущие антигенные поверхностные детерминанты.

Согласно изобретению количество полученного антигена определяется методом Elisa. Метод Elisa является стандартным методом определения вируса или вирусного антигена, подробно описанным во многих литературных источниках, например, в публикации Antigenic Variation among Members of the Tick-borne Encephalitis complex, John R. Stephenson, a и др. J. Gen. Virol (1984 год), 65, 81 89, в которой полно представлена методика получения количеств например, FSME антигена по способу Elisa. Эта же публикация подтверждает и обозначает очень тесную связь понятий вирус и вирусный антиген и в равной мере относится к получению того и другого.

Более подробно предмет изобретения описывается ниже при помощи нижеследующих примеров его выполнения.

Пример 1. Влияние величины клеточных агрегаций на выход антигена.

Куриные яйца SPF (cpecific pathogen free) высиживают в течение 12 дней при температуре 37^oC, проверяют при помощи теневого прибора успешное развитие эмбриона, дезинфицируют спиртом и открывают в стерильном боксе. Эмбрионы извлекают, промывают и грубо измельчают в режущем устройстве. После этого проверяют ферментативное "переваривание" эмбриональной ткани с помощью добавки протеолитических ферментов (1 мг/эмбрион) при температуре 37^oC в течение 20 мин. Из этой тканевой суспензии были отделены куски ткани > 1000 μм через сито с размером отверстий, равным более 1000 μм. Дальнейшее разделение этих клеточных агрегаций можно было осуществить осадительным способом, при котором в качестве критерия разделения была выбрана норма осаждения ≥1 см/мин. Для этой цели клеточную суспензию нагнетали через осадительный сосуд снизу вверх при норме потока ≥1 см/мин. Отдельные клетки или небольшие клеточные агрегации оставались в суспензии, в то время как клеточные соединения большей величины осаждались на дне сосуда. Исследования, проведенные при помощи сит с различной величиной пор, свидетельствовали о том, что осаждающиеся в этих условиях клеточные соединения имели величины разделения, равные от <1000 μм и >100 μм. Величины остающихся в суспензии клеточных соединений была поэтому <100 μм.

Таким образом было получено три фракции клеточных агрегаций:

Из этих фракций были суспендированы соответственно одинаковые концентрации биомасс (30 г на литр) в питательной среде (Med 199) и инфицированы вирусом FSME (10•10⁵ pfu на мг биомассы). Размножение вируса осуществляли при температуре 37^oC, причем клетки в суспензии держали при равномерном перемешивании. Через четыре дня определили количества образованного антигена, для чего применили Elisa.

В случае фракции 1 (клеточные агрегации меньше, чем 100 μм производство вируса/вирусного антигена составило 4,9 μг/мл. В случае фракции 2 (клеточные агрегации превышают 1000 μм) производство вируса/вирусного антигена составило 4,7 μг/мл, а в случае фракции согласно изобретению производство вируса/вирусного антигена составило 9,3 μг/мл.

Пример 2. Влияние величины клеточных агрегаций на загрязнение с CEC - протеином CEC (chick embrio cell) +, (см. + клетка эмбриона цыпленка).

Питательные среды фракций 1 и 3, полученные согласно примеру 1, проверили через два дня после начала культивирования на содержание CEC-протеина. Питательная среда содержала 1,80 мг CEC-протеина/мл, в то время как в питательной среде фракции 3 было установлено только 0,84 мг CEC-протеина/мл.

Пример 3. Влияние количества посевного вируса на производство вируса/вирусного антигена.

Биомассы с величинами клеточных агрегаций фракций 1 и 3 культивировали и определяли производство вируса/вирусного антигена по способу, описанному в примере 1, при этом в случае для инфицирования использовали на фракцию четыре различных количества посевного вируса (3,2•10³ pfu, 1•10⁴ pfu, 3,2•10⁴ pfu и 1•10⁵ pfu соответственно на мг биомассы). Полученные результаты можно видеть на приведенной нижеследующей таблице 1, свидетельствующей о том, что фракция 3, применяемая согласно изобретению, дает при том же самом количестве посевного вируса существенно более высокий выход вируса/вирусного антигена.

Пример 4. Влияние концентрации кислорода на производство вирусного антигена.

Биомассу согласно изобретению культивировали в питательной среде согласно описанным в примере 1 условиям при различных концентрациях кислорода, и определяли количество вирусов/вирусных антигенов. Полученные результаты представлены в нижеследующей таблице 2, причем выход вируса/вирусного антигена при концентрации кислорода, равной 0,06 ммоль/л, принят за 100
Пример 5. Влияние трансфера перевода кислорода на выход вируса/вирусного антигена.

Биомассу с клеточными агрегациями фракции 3, инфицировали, как это было описано в примере 1, вирусом, культивировали в сосудах различной величины, аэрируя воздухом, чтобы получить различные значения OTR. Суспензию выдерживали в течение 4 дней при температуре от 33^oC до 37^oC и определили выход вируса/вирусного антигена (см. таблицу 3).

Из приведенных в таблице 3 результатов можно прийти к заключению, что в случае, когда OTR превышает 2 выход вируса/вирусного антигена можно получить около 6 μг /мл.

Пример 6. Вирус гриппа, продуцируемый стандартной клеточной биомассой и биомассой клеточных агрегатов.

Штаммы гриппа, перечисленные в приведенной ниже таблице 4, были использованы как для инфицирования стандартной клеточной культуры, так и для биомассы клеточных агрегатов. Биомассу клеточных агрегатов получали как раскрыто в USSN 07/854, 630, PCT применение WO 91/09937. 30 г биомассы суспендировали в 1 л культуральной среды и инфицировали вирусом гриппа (1•10⁵ pfu (plaque forming unit бляшкообразующая единица на мг биомассы). Размножение вируса имело место при 37^oC, клетки хранили в суспензии при равномерном перемешивании. Через 4 дня вируссодержащую среду собирали и определяли HA-титр, полученный для различных штаммов гриппа, продуцируемых стандартной клеточной культурой и биомассой клеточных агрегатов. Таким образом, можно видеть, что использование биомассы клеточных агрегатов согласно настоящему изобретению увеличивает выход большинства штаммов, в то время как выходы вирусных штаммов, выращенных в стандартной клеточной культуре, не отличаются от выходов, получаемых при культивировании клеток другими способами.

Пример 7. Вирус простого герпеса (HSV), продуцируемый стандартной клеточной культурой и биомассой клеточных агрегатов.

Суспензия культуры биомассы клеточных агрегатов, имеющих диаметр от 100 до 1000 мкм, как раскрыто в USSN 07/854, 630 и стандартная клеточная культура, были испытаны для производства HSV вируса/вирусного антигена.

30 г биомассы суспендировали в 1 л культуральной среды и инфицировали HSV (1•10⁵ pfu на мг биомассы). Инфицированную культуру инкубировали в течение 72 ч. В течение этого времени ежедневно культуру анализировали. Величину pH и содержание глюкозы в среде поддерживали постоянными.

Накопление вирусного антигена при помощи ферментного иммуносорбентного теста (Elisa) и при помощи вирусного титрования. Elisa для определения HSV-вируса представляет собой: набор Elisa для вируса простого герпеса (Dakopatts) модифицированный для применения в полуколичественном анализе. Антигены определяли при помощи HSV-1 специфичного кроличьего иммуноглобулина, связанного с пероксидазой. Elisa-единицы (EU) определяли согласно разбавлению стандартного препарата BLV 81, содержащей 16 EU/мл в этой системе. Одну Elisa-единицу определяли как эквивалент максимального разбавления, которое дает поглощение при 492 нм больше, чем 0,1 и по меньшей мере двукратно превышает негативный контроль. Вирусный титр определяли как описано Reed и Muench. В таблице 5 сравниваются титры, полученные при помощи биомассы клеточных агрегатов и стандартной клеточной культуры. Титровое количество антигена, полученное из биомассы клеточных агрегатов, составляло около 2,8•10⁵ единиц и HSV-титр 4,4 • 10⁹ в 100 мл культуры.

В таблице 4 сравнивается выход HA-антигена, полученного для различных штаммов гриппа A и B при помощи стандартной клеточной культуры и биомассы клеточных агрегатов.

Использование: настоящее изобретение относится к медицине и биотехнологии. Сущность изобретения: в качестве клеточной культуры эмбрионов используют биомассу, состоящую из клеточных агрегатов куриных эмбрионов размером 100 - 1000 мкм, которую после инфицирования вируссодержащим материалом культивируют в питательной среде при содержании кислорода не менее 0,01 ммоль/л, преимущественно 0,006 ммоль/л. 5 з. п. ф-лы, 5 табл.

1. Способ выращивания вирусов, предусматривающий инфицирование посевным вируссодержащим материалом клеточной культуры куриных эмбрионов, суспендирование ее в питательной среде с последующим культивированием и выделением вирусов, отличающийся тем, что в качестве клеточной культуры куриных эмбрионов используют биомассу, состоящую из клеточных агрегатов куриных эмбрионов размером 100 1000 мкм, которую после инфицирования вируссодержащим материалом культивируют в питательной среде при содержании кислорода не менее 0,01 ммоль/л, преимущественно 0,006 ммоль/л. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что клеточные агрегаты получают посредством механической или ферментативной обработки куриных эмбрионов. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что скорость переноса содержащегося в питательной среде кислорода устанавливают на уровне 1,60 ммоль О₂ • 1л^-1•1ч^-1 2,40 ммоль О₂ •1л^-1•1ч^-1, преимущественно 1,65 2,40 ммоль О₂•1л^-1•1ч^-1. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культивирование проводят при исходной концентрации биомассы, равной 10 30 мг на 1 мл питательной среды. 5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культивирование проводят при исходной метаболической активности биомассы, измеренной по потреблению глюкозы, равной 3 5 мг глюкозы на 1 г биомассы в 1 ч. 6. Способ по пп. 3 и 4, отличающийся тем, что при скорости переноса кислорода в питательной среде, равной 1,65 ммоль O₂ •1л^-1•1ч^-1 концентрацию биомассы в питательной среде устанавливают на уровне 30 мг на 1 мл среды.