СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНАЛЬГЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 1996 года по МПК A61K38/01 

Изобретение касается нового применения протеина С в качестве лекарственного средства, обладающего анальгетической активностью.

Протеин С является зависящим от витамина К глюкопротеином, который синтезируется в печени и циркулирует в плазме в концентрации 4 мкг/мл в виде неактивного профермента. На поверхности стенок сосудов /эндотел/ он переводится с помощью комплекса тромбин-тромбомодулина в активную серипротеазу /активированный протеин С/. Известно, что активированный протеин С обладает профибринолитическими свойствами. Он действует также антикоагуляционно, потому что он путем протеолиза расщепляет фактор Ya, кофактор для вызванной влиянием фактора Ха активации протромбина /образования тромбина/, и фактор VIIIa, кофактор для вызванной влиянием фактора IXa активации фактора Х.

Активация протеина С в живом организме представляет собой реакцию отрицательной обратной связи генерирования тромбина. Чтобы развить оптимальную биологическую активность, необходим кофактор /протеин S/.

В заявке на патент Австрии N A 1551/89 описан фармацевтический препарат, который содержит протеин С и может использоваться для лечения или предотвращения тромбозов и тромбоэмболических осложнений.

Поскольку как протеин С, так и активированный протеин С можно рассматривать как аутогенные протеины, фармацевтические препараты на базе этих протеинов имеют преимущество в том, что могут применяться практически без побочных воздействий.

Задачей изобретения является расширение области терапевтического применения протеина С или активированного протеина С.

Изобретение базируется на знании того, что вызванное воспалительными процессами повышенное ощущение боли может быть снижено с помощью протеина С или активированного протеина С. Таким образом, оно охватывает применение протеина С или активированного протеина С для лечения болезненных состояний, которые вызываются острыми или хроническими воспалительными процессами, причем болезненные состояния могут быть вызваны посттравматическими, послеоперационными или первичными или вторичными злокачественными заболеваниями.

В частности, фармацевтический препарат пригоден для лечения ревматоидного артрита, миозита, гастрита или колита, для лечения воспалений в мочеполовом тракте, а также для лечения воспалительных процессов, которые появляются в рамках острого или хронического отторжения трансплантата.

Получение протеина С.

Протеин С высокой степени чистоты был получен из сырой фракции протеина С, которая была получена из имеющегося в продаже концентрата комплекса протромбина. Очистка осуществлялась методом аффинной хроматографии с помощью моноклональных антител. Моноклональные антитела антипротеина С были получены следующим образом.

BAL B/C-мыши были иммунизированы с помощью 100 мкг человеческого протеина С с двухнедельными интервалами путем внутрибрюшинной инъекции. После шести недель было еще раз инъецировано 50 мкг человеческого протеина С и три дня спустя было осуществлено слияние. Линия миеломных клеток /РЗ-Х-63-AG-8-653, 1,5 x 10⁷ клеток/ была смещена с 1,7 х 10⁸ клеток селезенки мыши и было осуществлено слияние по модифицированному методу Келера-Милештайна с использованием PEG 1500 /Kohler G. Milestein C. Nature 256 /1975/ 495-497/.

Положительные клоны, испытанные с помощью ELISA, были дважды субклонированы. Производство асцита осуществлялось путем инъекции 5 x 10⁶ гибридных клеток каждой BAL B/C-мыши спустя две недели после обработки пристаном.

Иммуноглобулин был очищен из асцита путем осаждения сульфатом аммония и с помощью последующей хроматографии на QAE-Sephadex и последующей хроматографии на Sephadex G200. Чтобы уменьшить риск переноса муринных вирусов, антитела перед иммобилизацией были еще раз подвергнуты инактивации вирусов. Полученные таким образом антитела протеина С были сцеплены с CNBR-сефарозой 4В. Для очистки протеина С с помощью аффинной хроматографии были использованы следующие буферные средства: в качестве абсорбционного буфера: 20 ммолей Триса, 2 ммоля этилендиаминтетрауксусной кислоты, 0,25 моля NaCl и 5 ммолей бензамидина, в качестве промывочных буферов использовались: 20 ммолей Триса, 1 моль NaCl, 2 ммоля бензамидина, 2 ммоля этилендиаминтетрауксусной кислоты, pH-величина составила 7,4, в качестве элюирующего буфера использовали: 3 моля NaSCN, 20 ммолей Триса, 2 моль NaCl, 0,5 ммоля бензамидина, 2 ммоля этилендиаминтетрауксусной кислоты.

В частности: концентрат комплекса протромбина растворяли в абсорбционном буфере, причем было использовано примерно 10 г концентрата комплекса протромбина на 20 мл моноклональную колонку антител. Затем растворенный концентрат комплекса протромбина фильтровали, в течение 15 мин центрифугировали при 20000 об/мин и фильтровали с помощью концентрата, центрифугировали в течение 15 мин при 20000 об/мин и стерильную фильтровали с помощью 0,8 мкм фильтра. Стерильно профильтрованный и растворенный концентрат комплекса протромбина наносили на колонку с долей расхода 10 мл/час. Затем колонку промывали промывочным буфером до отсутствия протеина и затем связанный протеин С вымывали с помощью элюирующего буфера с долей расхода 5 мл/час и собирали фракции. Элюированный протеин С был диализирован в буфере /0,2 мол/ литр триса, 0,15 моля глицина и 1 ммоль этилендиаминтетрауксусной кислоты, рН 8,3/. Содержание протеина С в отношении антигена определялось с помощью метода Лауреля и в отношении активности после активирования протеина С.

Полученный элюат протеина С переводился в фармацевтически приемлемый препарат следующим образом.

Вначале элюат подвергали ультрафильтрации и диафильтрации. Для диафильтрации применяли буфер с рН-величиной 7,4, который на литр содержал 150 ммолей NaCl и 15 ммолей тринатрийцитрат 2H₂O. Полученный фильтрат был подвергнут сублимационной сушке и в течение часа инактивировался относительно вирусов путем обработки паром при температуре 80±5^oC и давлении 1375±35 мбар.

Лиофильно высушенный инактивированный относительно вирусов материал затем растворяли в стерильном изотоническом растворе NaCl и с помощью ионообменной хроматографии на Q-сефарозе были удалены возможно имеющиеся антитела или сывороточный амилоид Р. Очищенный раствор концентрировали с помощью дальнейшей операции ультрафильтрации и диафильтрации. Затем к полученному раствору в расчете на литр добавляли 10 г альбумина, 150 ммолей NaCl и 15 ммолей тринатрийцитрата. Значение рН раствора составила 7,5. Мышиный иммуноглобулин, а также факторы II, VII, IX и X выявить не удалось. Затем раствор был стерильно профильтрован, слит и лиофилизирован. Удельная активность составила 14 единиц протеина С на мг. Единица активности протеина С была определена как активность протеина С в 1 мл нормальной плазмы и калибровалось относительно первого международного стандарта протеина С. В качестве испытания активности был использован амидолитический тест, причем протеин С был активизирован с помощью протака /фирмы "Пентафарм"/.

Получение активированного протеина С
Активирование очищенного протеина С осуществлялось благодаря тому, что 70 мл тромбина /500 N1H единиц/мл, примерно соответственно 200 N1H единиц/мг протеина/ cцепляли с CNBR сефарозой 4В, после чего протеин С смешивали с гелем тромбина в соотношении примерно 6 единиц протеина С к единице тромбина при температуре 37^oC и при непрерывном встряхивании реакция продолжалась 3 часа. Затем с помощью хромогенного субстрата /S 2366/ определяли активность протеина С. Активированный протеин был затем стерильно профильтрован и путем слива и лиофилизовали был изготовлен для фармацевтического препарата.

Антиноцицептивное действие
Антиноцицептивное действие было подтверждено на воспаленной крысиной лапе путем определения болевого порога, с добавлением и без добавления протеина С /активированного протеина C/.

Болевой порог измерялся по аналогии с методом, описанным Рандалом и Селито /Arch. Int. Pharmacodyn. 111, 409-419, 1957/. Для этого ртутный манометр был соединен со шприцем емкостью 10 мл, колба которого была оснащена короткой цапфой. С помощью этого шприца оказывалось возрастающее давление на лапу крысы /20 мм ртутного столба/сек/. Болевой порог указывался в виде того давления в мм ртутного столба, которое необходимо, чтобы вызвать поверхностную реакцию лампы.

Для исследования использовались женские особи крыс весом от 250 до 350 г. Воспаление вызывалось с помощью 3 мг карагенина /сигма, С-1013/, растворенного в 100 мкл изотонического раствора поваренной соли, путем внутриподошвенной инъекции в лапу крысы.

Болевой порог измерялся перед инъекцией /контрольная величина/ и ежечасно в течение шести часов после инъекции карагенина. Болевой порог, который был измерен после инъекции карагенина, был выражена в процентах контрольной величины.

Протеин С или активированный протеин С инъецировался внутривенно в хвостовую вену непосредственно после инъекции карагенина. Объем инъекции составлял 2 мл/кг.

Антиноцицептивный эффект протеина С зависит от дозы и является значительным /p менее 0,01 для 80 единиц/кг, p менее 0,001 для 250 и 800 единиц/кг/.

Этот эффект протеина С может быть подтвержден также путем подкожного введения.

Кроме того, удалось подтвердить, что активированный протеин С в дозе 250 единиц-кг в течение 2 часов после внутриподошвенной инъекции карагенина также обладает антиноцицептивным действием. Активированный протеин С в дозе 250 единиц/кг, введенный внутривенно за 10 минут до вызванного карагенином воспаления, также имеет антиноцицептический эффект, который продолжается в течение 2 часов. Антиноцицептический эффект активированного протеина С также зависит от дозы.

Гистологические исследования лап крыс, которые были обработаны протеином С или активированным протеином С, показали уменьшенное периваскулярное число лейкоцитов по сравнению с необработанными животными.

Кроме того, оказалось, что неизбирательный блокатор β-адренорецепторов пропранолол повышает антиноцицептивное действие протеина С /800 единиц-кг/. Антагонизирующее протеину С действие пропранолола удалось подтвердить в диапазоне доз от 0,03 до 1 мг/кг при внутривенном введении /см. табл. 1/.

Однако этот антагонизм не ограничен пропранололом, а в зависимости от дозы другие b-блокирующие субстанции также антагонизируют действие протеина С, как это показано в табл.2 для случая с пиндололом.

После выключения симпатической нервной системы путем химической симпатэктомии с помощью резерпина /7,5 мг/кг внутрибрюшинно, от 18 до 24 часов/ и альфа-метил-р-тирозина /250 мг/кг внутрибрюшинно, 5 часов/ протеин С становится сильно эффективным антиноцицептивно. Однако и на этих симпатэктомированных животных пиндолол полностью антагонизирует эффект протеина С /табл.3/. Таким образом, может быть исключено участие просеинаптического симпатического нерва в действии протеина С. Поэтому эффект протеина С обусловлен непосредственным действием на постсинаптические b-адренорецепторы.

Эффект протеина С должен повторяться с помощью b-симпатикомиметических препаратов. Фенотерол, инъецированный внутривенно в количестве или 5 мг/кг к началу опыта, или 3 мг/кг к моменту времени "3 часа", приводит к значительной антиноцицептации. Таким образом, стимулирование постсинаптических b-адренорецепторов приводит к антиноцицептивному действию.

Биохимическое действие b-симпатикомиметического эффекта протеина С вызывает благодаря связыванию с адренергными b-рецепторами и стимулированию мембраносвязанного энзима аденилциклазы, который катализирует внутриклеточное образование сАМР из АТФ, сАМР активизирует протеин-фосфокиназы, которые в свою очередь путем фосфорилирования переводят неактивные энзимы в активные. Таким образом, например, b-симпатикомиметически повышается липолиз и глюкогенолиз.

Физиологические воздействия протеина С по причине его b-симпатикомиметического действия многообразны, повышение сАМР в тромбоцитах приводит к подавлению функции тромбоцитов и к задержке связывания тромбина с поверхностью тромбоцитов. Таким образом, протеин С может использоваться для того, чтобы предотвратить зависящие от тромбоцитов образования сгустков крови, в частности, в артериальной сосудистой системе в результате связывания с тромбоцитными b-адренорецепторам, положительные b-адреноцепторное действие протеина С оказывает на сердце положительный инотропный эффект и расслабляюще действует на гладкую мускулатуру /например, на бронхиолы/. На основании b-симпатикомиметического действия на сосудистую систему протеин С терапевтически может использоваться при периферийных нарушениях местного кровообращения. Также было обнаружено, что внутрикоронарное введение активированного протеина С у собак приводит к повышению коронарного кровотока по причине сосудорасширяющего действия. Сосудорасширяющее действие протеина С может быть использовано для лечения гипертонии. b-симпатикомиметическому действию протеина С может быть также приписано уменьшающее интенсивность воспаления действие. b-симпатикомиметическое действие протеина С приводит к подавлению высвобождения гистамина в легком. Благодаря b-симпатикомиметическому действию протеина С он может использоваться в качестве токолитика.

Изобретение касается применения протеина С или активированного протеина С в качестве средства, обладающего анальгетической активностью. Препарат пригоден для лечения болезненных состояний, которые вызываются острыми или хроническими воспалительными процессами (ревматоидный артрит, миозит, гастрит, колит, воспаления в мочеполовом тракте). 3 табл.

Применение протеина С или активированного протеина С в качестве средства, обладающего анальгетической активностью.