СУБСТРАТ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ФЛАВИВИРУСОВ ИЛИ АРЕНОВИРУСОВ НА ОСНОВЕ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ФЛАВИВИРУСА ИЛИ АРЕНОВИРУСА Российский патент 1997 года по МПК C12N5/00 A61K39/12 

Изобретение относится к матрице со связанными с нею путем адгезии клетками человека или животных и к способу продуцирования вируса/вирусного антигена, особенно вирусного антигена таежного весенне-летнего менингоэнцефалита (FSME)
Инцифирования вирусом таежного весенне-летнего менингоэнцефалита (FSME) наблюдали в Европе со времен Второй мировой войны. В Австрии, в Южной Германии и в Чехословакии по причине инцифирования вирусом FSME ежегодно проходят лечение в стационаре несколько сотен пациентов.

FSME вирус принадлежит к семейству флавивирусов, к более ранней серологической группе В арбовирусов, которая представляет род семейства вирусов Togavirid ae.

Против наиболее значительного и наиболее распространенного возбудителя энцефалита у человека, вируса группы B японского энцефалита, уже долгие годы существуют вакцины. Эти вакцины получают из головного мозга инфицированных мышей, подвергают очистке и считают их надежными и эффективными (Hoke et al, N. Engl. I. Med, 319 608 (1988).

С 1976 г располагают вакциной против FSME, которая допущена органами здравоохранения к применению. Для производства этой вакцины культивируют вирус в головном мозгу инфицированных детенышей мышей, размножают в клетках куриного эмбриона, инактивируют формалином и затем подвергают эффективному способу очистки (Heinz et al. I. Med. Virol, 6 103 (1980).

В литературе описан целый ряд возможностей для размножения арбовирусов, принимая во внимание возможное получение вакцины. Наиболее широко применяемым в настоящее время методом является вакцинация фибробластов куриного эмбриона, полученным из головного мозга мыши FSME посевным вирусом и культивирование вакцинированных клеток. Этот метод требует связанной с затратами очистки антигена, чтобы удалять комплексный гетерологический биологический материал и избегать при повторном назначении полученных из него доз вакцины раздражающего эффекта у подвергшихся вакцинации.

Для подготовки клеток куриного эмбриона следует исходить из SPF (= специальных непатогенных) яиц. Эти SPF-яйца для поддержания их SPF-состояния перед каждым применением должны подвергаться многочисленным длительным исследованиям.

Далее культуры клеток куриного эмбриона показывают лишь небольшие числа поколений при дальнейшем культивировании, благодаря чему установлены граница размера загрузок, трудности сохранения стерильности при выращивании первичной культуры и отсутствие постоянства качества первичных клеток относительно размножения вируса и производства антигена.

Эти недостатки существуют не только при способах для продуцирования FSME-вирусных антигенов, но и при получении антигена вообще.

Изобретение ставит своей задачей улучшить продуцирование вируса/вирусного антигена, особенно FSME-вируса/вирусного антигена, таким образом, чтобы устранить вышеназванные недостатки и предоставить способ для выращивания вирусов/вирусных антигенов в культурах клеток, который позволяет, в частности, производство в крупном промышленном масштабе, причем одновременно культура может сохранять стерильность простым методом. Передача нежелательных клеточных протеинов в надосадочную жидкость культуры должна быть минимальной.

Для решения описанной задачи в распоряжение предоставляют матрицу, т.е. материал-носитель, со связанными с ним путем адгезии клетками человека или животных, причем клетки инфицированы вирусом. Изобретение основано на открытии, что зависящие от поверхности клетки, которые служат для размножения вируса, даже в вирусинфицированном состоянии остаются связанными с матрицей путем адгезии, непрерывно продуцируют в течение относительно длительного времени вирусный антиген и переходят в питательную среду.

Можно хранить загруженную инфицированными клетками матрицу по изобретению в течение нескольких дней при температуре 0 8^oC, следовательно, в условиях, при которых подавлены клеточный метаболизм и тем самым продуцирование вируса. Сохраняемую подобным путем матрицу можно в дальнейшем применять без проблем введением в питательную среду и установлением соответствующих условий культивирования для продуцирования вирусного антигена. Таким образом, матрица по изобретению представляет исходную культуру, которую можно получать с постоянным качеством и с постоянной активностью в запас, состояние которой относительно стерильности можно легко проверять и которая в любое время может быть использована для получения вирусного антигена.

Далее, связывание продуцирующих антиген клеток с носителем допускает крайне простое манипуливание с вирусинфицированными и готовыми к производству клетками. Так, например, можно непрерывно осуществлять производство вируса/вирусного антигена в перфузионном реакторе. Отделение клеток от содержащей антиген среды существенно облегчается благодаря их связыванию с матрицей, вследствие чего матрица по изобретению упрощает производство вируса/вирусного антигена в крупном промышленном масштабе.

Предпочтительный вариант осуществления матрицы по изобретению состоит в том, что в качестве связанных путем адгезии клеток предусмотрены веро-клетки АТТС CCL 81, которые используются преимущественно для производства вирусного антигена весенне-летнего менингоэнцефалита (FSME) и поэтому инфицированы вирусом FSME.

Но связанные путем адгезии с матрицей клетки могут быть инифицированы также флавивирусом или аренавирусом.

В качестве особенно пригодного для матрицы материала оказались стекло, декстран с полимерной сеткой, желатина или синтетический материал, причем наилучшей формой матрицы является микроноситель, у которого диаметр частиц лежит преимущественно в области 100 3000 мкм. Эти микроносители могут иметь гладкую поверхность или пористое структурирование.

Другой целесообразный вариант осуществления матрицы по изобретению отличается тем, что на ее поверхности связаны путем адгезии на 1 см² 1 • 10⁵ -4 • 10⁵ клеток.

Изобретение относится так же к способу для продуцирования вирусного антигена весенне-летнего менингоэнцефалита (FSME) с применением матрицы по изобретению, который отличается тем, что зависящие от поверхности перманентные клетки, предпочтительно веро-клетки АТТС CCL 81, инфицируются вирусом FSME, клетки сохраняются в бессывороточной среде при поддерживании их жизнеспособности связанными путем адгезии с матрицей, чтобы обеспечивать образование антигена и передачу антигена в питательную среду, после чего содержащую антиген среду отделяют от связанных носителем клеток и перерабатывают известным образом, концентрированием, инактивированием и очисткой, в приемлемый галеновый препарат.

Веро-клеточную линию АТТС CCL 81 получают из почечной ткани зеленой мартышки (Cercopithecs aethiops), содержат в бессывороточной среде в состоянии активного метаболизма. Для такой перманентной клеточной линии заводят один раз основной и рабочий банк посева клеток и проводят все исследования для загрязняющих веществ. Следовательно, эту перманентную клеточную линию можно точно характеризовать не только относительно отсутствия загрязняющих микроорганизмов, но и относительно поведения при росте, культивирования, поведения при размножении и если прибегнуть к оптимальной оценке считать постоянной.

При способе по изобретению применяют преимущественно веро-клетки, которые связаны с микроносителями. В результате этого можно достигать высокой плотности клеток, которую при использованных до сих пор первичных культурах клеток нельзя было достигнуть ни в колбах Рукса, ни в суспензии и которая позволяет значительно повышать выход вируса и вирусного антигена на единицу ферментационного объема.

Выгодный вариант осуществления способа по изобретению состоит в том, что размножение вируса и образование антигена осуществляют в непрерывно работающем перфузионном реакторе в течение по меньшей мере 5 дн при 34 37^oC, причем перфузию можно проводить с нормой от 0,3 до 10 объем/ объем/день. Далее, в перфузионном реакторе можно предусматривать плотность клеток в пределах от 2 • 10⁹ до 2 • 10¹⁰ клеток на 1 л ферментационного объема, последнее при использовании установки для ферментации с псевдоожиженным слоем.

Размножение вируса по изобретению в перфузионной культуре позволяет, по сравнению с культивированием частями, существенно сокращать заданное нормой перфузии время пребывания вируса и вирусного антигена в среде. Благодаря более короткому времени пребывания достигают значительно меньшего термического инактивирования и тем самым более высокой продуктивности способа по изобретению. Таким образом можно достигать в перфузионной среде концентрации антигена от 1 до 10 мг/мл и поддерживать этот уровень.

При способе по изобретению можно простым путем установить оптимальные для культивирования условия. Кроме того, для осуществления требуется значительно меньшее количество манипуляций, чем при всех известных способах, что означает большую безопасность в обращении с инфекционным материалом и обеспечивает непрерывную быструю обработку вируса и вирусных антигенов из питательной среды.

Получение вирусного посевного материала, выращивание клеток для продуцирования вируса или вирусного антигена и непосредственное производство вируса или вирусного антигена описаны ниже подробнее.

1. Вирусный посевной материал.

Клетки (напр. Веро АТТС CCL 81) выращивают во вращающихся колбах при 37^oC до слияния и инфицируют 1 мл суспензии посевного вируса. Начиная со второго дня после инфицирования, ежедневно проводят замену половины объема среды бессывороточной средой. Надосадочные жидкости среды с 4-го по 8-й день содержат 2-5 • 10⁷ перфузированных (p.f.u.) клеток на 1 мл и их хранят до их применения в качестве вирусного посевного материала при -20^oC.

2. Выращивание клеток для производства вируса/вирусного антигена.

Исходя из хранящихся в жидком азоте АТТС CCL 81 рабочих посевных клеток, осуществляют размножение этих клеток в колбах с тканевой культурой, пока не достигают такого количества клеток, которое позволяет инокулировать ферментер. Дальнейшее культивирование клеток происходит в ферментационных камерах при 37^oC, причем выращиваемым при адгезии рабочим посевным клеткам должна быть предоставлена по возможности большая поверхность для сцепления. Такие большие поверхности предоставляются в применении вращающихся колб из стекла или полистирола или в применении микроносителей (МС). Наилучшими оказываются МС из декстрана с полимерной сеткой размером 170 250 мкм.

Загруженные посевными клетками МС культивируют при 37^oC, пока не достигают плотности клеток 1 • 10⁵ 4 • 10⁵ клеток на 1 см². Этой плотности клеток достигают, в общем, через 6 дн. Во время культивирования происходит полное зарастание микроносителей клетками, причем отдельные микроносители могут зарастать прилипающими к их поверхности клетками, образуя целый клеточный покров.

3. Продуцирование вируса/вирусного антигена.

После достижения указанной плотности клеток для получения матрицы по изобретению проводят инфицирование связанных на МС клеток вирусным посевным материалом (1 0,01 p.f.u./клетка, предпочтительно 0,1 p.f.u. клетка/клетка). Матрицу по изобретению можно хранить несколько дней при 0 8^oC или сразу применять для производства вирусного антигена.

Для производства антигена загруженные инфицированными клетками МС помещают в перфузионный реактор. Начиная с этого момента инфицирования вирусом в культуре, применяют только бессывороточную среду, которую непрерывно накачивают в перфузионный реактор, в то время как культивированные на микроносителях клетки задерживаются в реакторе при помощи стопорного устройства. Начиная со 2 дня после инфицирования вирусный антиген находится в вытекающей питательной среде в высокой концентрации и его можно непрерывно получать из этой среды по меньшей мере в течение 10 дн.

В нижеследующих примерах поясняют способ по изобретению еще подробнее. Определение вирусного антигена проводили во всех примерах с антигеном ELISA.

Пример 1. Веро-клетки АТСС CCL 81 культивировали в ферментере объемом 6 л на микроносителе (Цитодекс 3 фирмы Фармация) при 37^oC до количества клеток 2 • 10⁶ на 1 мл питательной среды (DMEM Dulbecco's Eagle Medium) и
а) инфицировали FSME-вирусом (0,1 p.f.u. клетка/клетка) и осуществляли частями размножение вируса.

Дни после инфицирования Вирус/вирусный антиген, мг/мл
2 0,20
3 0,70
4 1,60
5 2,70
6 4,00
7 3,80
8 2,90
Производительность составляла на 1 л ферментационного объема 4 мг вируса/вирусного антигена.

б) инфицировали FSME-вирусом (0,1 p.f.u клетка/клетка) и производили перфузию при помощи 0,5 объем/ферментационный объем/день.

Дни после инфицирования Вирус/вирусный антиген, мг/мл
2 0,30
3 1,60
4 4,50
5 4,50
6 2,50
7 3,20
8 2,90
9 2,50
10 2,30
Производительность составляла на 1 л ферментационного объема 13,7 мг вирус/вирусный антиген.

в) инфицировали FSME-вирусом (0,1 p.f.u. клетка/клетка) и производили перфузию непрерывно питательной среды (DMEM) при помощи 1 объем/объем ферментера/день.

Дни после инфицирования Вирус/вирусный антиген, мг/мл
2 0,45
3 1,40
4 2,00
5 2,00
6 1,70
7 1,60
8 1,10
9 1,10
10 0,90
Производительность составляла на 1 л ферментационного объема 12,4 мг вируса/вирусного антигена.

Пример 2. Веро-клетки (АТСС CCL 81) культивировали в ферментере объемом 40 л на микроносителе (Цитодекс 3 фирмы Фармация) при 37^oC до количества клеток 2 • 10⁶ клеток/мл и после инфицирования FSME-вирусом (0,1 p.f.u. клетка/клетка) непрерывно производили перфузию средой (DMEM) (0,33 объем/объем ферментера/день).

Дни после инфицирования Вирус/вирусный антиген, мг/мл
2 1,60
3 3,50
4 5,00
5 4,30
6 4,00
7 2,90
8 2,70
9 2,10
10 2,00
Производительность составляла на 1 л ферментационного объема 10,7 мг вируса/вирусного антигена.

Пример 3. Веро-клетка (АТСС CCL 81) культивировали в ферментере объемом 40 л на микроносителе (Цитодекс 3 фирмы Фармация) при 37^oC до количества клеток 3 • 10⁶ клеток/мл и после инфицирования FSME-вирусом (0,1 p.f.u. /клетка) непрерывно производили перфузию средой (DMEM) (1 объем/объем ферментера/день).

Дни после инфицирования Вирус/вирусный антиген, мг/мл
2 1,10
3 3,80
4 3,90
5 3,00
6 2,30
7 2,20
8 2,00
9 3,15^**)
10 2,30
**) норма перфузии была снижена на 0,5 объем/ферментационный объем/день.

Производительность составляла на 1 л ферментационного объема 21,7 мг вируса/вирусного антигена.

Пример 4. Веро-клетки (АТСС CCL 81) культивировали в ферментере объемом 150 л на микроносителе (Цитодекс 3 фирмы Фармация) при 37^oC до количества клеток 2 • 10⁶ /мл и после инфицирования FSME-вирусом (0,1 p.f.u./клетка) непрерывно производили перфузию средой (DMEM) (0,33 объем/ферментационный объем/день).

Дни после инфицирования Вирус/вирусный антиген, мг/мл
2 0,20
3 1,90
4 2,40
5 4,80
6 5,40
7 4,10
8 4,40
9 3,20
10 4,50
Производительность составляла на 1 л ферментационного объема 14,7 мг вируса/вирусного антигена.

Использование: вирусология. Сущность изобретения: для продуцирования вирусного антигена весенне-летнего менингоэнцефалита (FSME) путем выращивания вируса FSME в культурах клеток, зависящих от поверхности перманентной клеточной линии, предпочтительно веро-клеточной линии АТСС CCL 81, проводят инфицирование вирусом FSME, и клетки при сохранении роста клеток поддерживают в нелитической бессывороточной системе связанными с носителями, чтобы обеспечивать образование антигена. После чего содержащую антиген среду отделяют от связанных носителем клеток и известным методом, концетрированием, инактивированием и очисткой, обрабатывают до приемлемого галенова препарата. 2 с. и 4 з.п. ф-лы.

1. Субстрат для культивирования флавивирусов или ареновирусов на основе культуры клеток, отличающийся тем, что он представляет собой поверхностно-зависимые перманентные клетки, связанные путем адгезии с матрицей. 2. Способ получения антигена флавивируса или ареновируса путем культивирования вируса на культуре ткани с последующей концентрацией и очисткой, отличающийся тем, что из культуры клеток используют поверхностно-активные перманентные клетки, связанные путем адгезии с матрицей. 3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что культивирование вируса осуществляют в непрерывно работающем перфузионном реакторе в течение 5 дней при 34 37^oС. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что перфузию осуществляют при норме 0,3 10 об/день. 5. Способ по пп.2 5, отличающийся тем, что концентрацию вируса в среде поддерживают в пределах 1 10 мг/мл. 6. Способ по пп.2 5, отличающийся тем, что из вирусов используют вирус FSME, а из поверхностно-зависимых перманентных клеток используют клетки Vero ATCC CCL 81.