СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУХИХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 1998 года по МПК C12N1/04 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к производству сухих микробных препаратов.

В производстве сухих препаратов основными этапами являются смешивание суспензии микроорганизмов с адсорбентом влаги и последующая сушка в определенных условиях. Основным требованием к адсорбенту влаги является его инертность по отношению к микроорганизмам, что должно способствовать сохранению нативных свойств бактериального препарата.

Известен способ получения сухих бактериальных препаратов, включающий выращивание и концентрирование культуры микроорганизмов, смешивание с сорбентом - глинистым минералом и последующее распылительное высушивание. При этом имеет место повышенный выход жизнеспособных клеток [1].

Общим существенным признаком известного и предложенного технических решений является выращивание культуры микроорганизмов, смешивание ее с сорбентом и последующая сушка.

Причиной, препятствующей достижению технического результата, является недостаточно высокий выход жизнеспособных клеток, а применяемый сорбент не улучшает выживаемости клеток.

Эта причина частично устраняется в способе получения, сухих бактериальных препаратов, выбранном, авторами в качестве прототипа и являющимся наиболее близким к предложенному по технической сущности и достигаемому эффекту. Известный способ [2] включает выращивание культуры микроорганизмов на питательной среде, смешивание ее с сорбентом и сушку. При этом в качестве сорбента выбирают порошкообразную окись алюминия, а затем дополнительно вводят другой сорбент, связывающий воду в меньшей степени, чем основной сорбент. После этого производят досушивание смеси в сушильном шкафу при 105^oC в течение четырех часов. Отмечается, что полученный по этому способу препарат микроорганизмов сохраняет нативные свойства, выживаемость микроорганизмов повышается по отношению к контролю и составила от 29 до 43%.

Этот способ является наиболее близким к предложенному. Общими существенными признаками известного и предложенного технических решений является выращивание микроорганизмов на питательной среде, смешивание полученной суспензии микроорганизмов с адсорбентом и последующая сушка.

Причинами, препятствующими достижению технического результата, являются:
- использование двух сорбентов, двухступенчатое их смешивание с культуральной жидкостью;
- недостаточно высокий выход жизнеспособных клеток микроорганизмов;
- снижение выживаемости микроорганизмов в течение месяца почти на 20%.

В основу изобретения поставлена задача усовершенствования способа получения сухих бактериальных препаратов, в котором за счет выбора сорбента обеспечивается высокий выход жизнеспособных микроорганизмов, препарат сохраняет высокий титр клеток в течение достаточно длительного периода времени, независимо от вида микроорганизмов.

Поставленная задача достигается тем, что в способе получения сухих бактериальных препаратов, включающим выращивание культуры микроорганизмов в виде суспензии, смешивание ее с сорбентом и сушку, согласно изобретению, суспензию микроорганизмов смешивают с высокодисперсным порошком диоксида кремния, в соотношении 2 : 1, сушку ведут на воздухе и полученную смесь диспергируют до тонкодисперсного состояния.

Установлено, что в результате осуществления изобретения в объеме его существенных признаков за счет выбора сорбента исключается операция введения второго сорбента дополнительно вдобавок к основному, а собственно сушку возможно вести на открытом воздухе при температуре, близкой к комнатной. При этом полученный бактериальный препарат сохраняет высокий титр жизнеспособных бактерий в течение полугода и более. Добавление в качестве сорбента высокодисперсного порошка диоксида кремния позволяет сохранить нативные свойства микроорганизмов и получить биопрепараты, удобные для применения со 100%-ным сохранением высоких титров бактерий. Выбранное соотношение суспензии микроорганизмов к высокодисперсному порошкообразному диоксиду кремния как 2 : 1 необходимо и достаточно для образования удобной для сушки консистенции получаемой смеси. Увеличение количества порошка диоксида кремния более 1 мас. ч. приводит к загущению смеси и неудобству при перемешивании, а снижение количества кремнезема ведет к увеличению времени сушки жидкой смеси, хотя на жизнеспособности получаемого затем бактериального препарата не сказывается. Введение порошка диоксида кремния в указанном соотношении к суспензии микроорганизмов позволяет не только упростить процесс сушки, но и сделать его возможным при комнатной температуре, что обеспечивает также сохранение высокого титра бактерий. При дальнейшем использовании нет необходимости отделять сорбент от биокомпонента, полученные сухие бактериальные препараты поэтому очень удобны в применении. Диспергирование высушенной смеси до тонкодисперсного состояния способствует обволакиванию бактерий и созданию защитного слоя порошкообразного диоксида кремния, что делает возможным достаточно длительное сохранение высокого титра бактерий, независимо от того, идет речь об аэробных или анаэробных микроорганизмах.

Далее сущность изобретения поясняется описанием технологии получения сухих бактериальных препаратов микроорганизмов, а также данными изучения изменений титра бактерий, их выживаемости во времени.

Для осуществления способа использовали культуральные жидкости аэробных микроорганизмов Streptococcus lactis N8, Bacilus subtilis, анаэробных микроорганизмов Lactobacillus plantarum N12 и Bifidobacterium adolescentes N5. Штаммы культивировали на кровяносывороточном бульоне по известным методикам.

Высокодисперсный /размер частиц 5-10 нм/ порошок диоксида кремния /см. ГОСТ 14922-77 "Аэросил"/.

Пример 1. Высокодисперсный порошок диоксида кремния предварительно высушивают при 400-450^oC. Затем в количестве 20 г постепенно добавляют к 40 мл бульонной культуры Bifidobacterium adolescentes N5 до получения однородной густой массы при перемешивании. Полученную массу сушат в термостате при 27-32^oC, затем ведут диспергирование в течение двух часов до тонкодисперсного состояния.

Полученный препарат тестируют по общепринятой методике: посев производят на питательную среду МРС-2. Для этого делают разведение в физиологическом растворе на 4,5 мл полграмма препарата. Затем 1 мл смеси вносят в 9 мл МРС-2. Выдерживают в термостате при температуре 37^oC в течение 72 ч. Проверку титра проводили через каждые 2 недели в течение шести месяцев. На шестой месяц хранения титр бактерий снизился незначительно. Данные представлены в табл. 1 и 2.

Пример 2. К 50 мл бульонной культуры Lactobacillus plantarum N12 при постоянном перемешивании добавляют 24 г высокодисперсного порошка диоксида кремния. Полученную массу сушат на воздухе. Затем после диспергирования полученный продукт тестируют. Жизнеспособность бактерий равна 100%. По мере хранения тестирование проводят через каждые 2-4 недели. Данные представлены в табл. 1.

Пример 3. К 40 мл бульонной культуры Streptococcus lactis N8 добавляют 26 г порошка диоксида кремния при постоянном перемешивании. К концу перемешивания масса загущается и становится неудобной для дальнейшего перемешивания. Однако тестирование подтвердило достаточно высокий титр бактерий и 100%-ную выживаемость в течение полугода. Для проверки титра бактерий высев культуры проводили на мясо-пептонном бульоне. Данные приведены в табл. 1.

Пример 4. К 50 мл бульонной культуры Bacillus subtilis представляющей собою суспензию микроорганизмов, добавляют 25 г порошка диоксида кремния при постоянном перемешивании, как описано в примере 1. Готовый продукт представляет собой тонкодисперсный порошок, сухой бактериальный препарат со 100%-ной выживаемостью, сохраняющейся в течение полугода. Данные проверки титра бактерий представлены в табл. 2.

Ниже в табл. 1 представлены данные проверки титра бактерий сухих бактериальных препаратов, полученных по предложенному способу. В табл. 2 представлены данные проверки титра за 1995 г. Выживаемость сразу после получения готового продукта составила 100%, а через полгода 78%. Выживаемость микроорганизмов в сухом бактериальном препарате, полученном по известному способу /прототип/ составила 29-43%, а титр бактерий снизился на треть.

Таким образом, способ получения сухих бактериальных препаратов прост, не требует дополнительных затрат на введение второго сорбента, не требует сушки при высокой температуре, а полученный продукт обладает высокими характеристиками:
- высокий выход жизнеспособных клеток микроорганизмов - 100%,
- препарат сохранят высокий титр бактерий в течение 6-9 мес независимо от того, аэробные или анаэробные сами бактерии,
- сорбент выбран таким, что при дальнейшем использовании бактериального препарата нет необходимости отделять сорбент от биокомпонента.

Изобретение относится к биотехнологии, касается производства сухих бакпрепаратов. Сущность изобретения: способ включает получение культуры микроорганизмов в виде суспензии, смешивание с сорбентом - высокодисперсным порошком диоксида кремния при соотношении суспензии микроорганизмов к диоксиду кремния как 2 : 1, сушку на открытом воздухе при температуре 27-32^oC и тонкую диспергацию полученной смеси, 2 табл.

Способ получения сухих бактериальных препаратов, включающий выращивание культуры микроорганизмов в виде суспензии, смешивание ее с сорбентом и сушку, отличающийся тем, что суспензию микроорганизмов смешивают с высокодисперсным порошком диоксида кремния в соотношении 2 1, сушку ведут на воздухе и полученную смесь диспергируют до тонкодисперсного состояния.