Изобретение относится к медицине и фармацевтической промышленности и касается способа получения сухих биологически активных материалов сорбционно-контактным обезвоживанием.
Известен способ контактно-сорбционного обезвоживания термолабильных материалов, предусматривающий сушку и стерилизацию наполнителя-сорбента и поступление его в бункер-накопитель, проверку его стерильности и влагосодержания, последующее смешение компонентов в камере при температуре окружающей среды путем одновременного диспергирования высушиваемого материала с наполнителем-сорбентом (RU, патент 1363918 A1, F26B 5/16, 3/12, 10.06.1996).
Основным недостатком известного аналога является невозможность получения сухих высокодисперсных порошков по причине сильной адгезии лабильных биологически активных материалов на носителе-сорбенте и соответствующей потери дисперсности.
Известна пробиотическая добавка и способ ее получения, предусматривающий смешивание биомассы спорообразующих бактерий Bucillus subtilis, носителя-сорбента - аэросилов гидрофильного марки А и гидрофобного марки AM, вспомогательных веществ - смолы-катиониты ионообменные марок КБ-4П-2 и КУ-2-8 и обезвоживание полученной смеси методом капилярно-сорбционного высушивания до содержания влаги в готовом продукте (8-25)% (RU, заявка 2002129938 A, C12N 1/20, А23K 1/165, А61K 35/66, F26B 5/16, 10.08.2004).
Известен сухой пробиотический препарат и способ его получения, предусматривающий получение жидкой биомассы путем смешения нативной культуры лактобактерий с белково-углеводным комплексом, контактное обезвоживание полученной жидкой биомассы влагоемкой ионообменной смолой КБ-4П-2 с размерами частиц от 1 до 800 мкм, предварительно обработанной смесью лактозы безводной и аэросила гидрофобного (RU, патент 2268926 С2, C12N 1/20, А23С 9/12, F26B 5/16, 10.03.2005).
Известен способ получения сухого пробиотического препарата, в соответствии с которым культуру бифидобактерий или стрептококка, выращенную в условиях глубинного культивирования, смешивают с защитной средой, проводят контактно-сорбционное обезвоживание целевого продукта охлажденным до минус 8-10°С сорбентом, например окисью алюминия с остаточной влажностью менее 1% при массовом соотношении 1:10-1:12, соответственно и осуществляют досушивание в течение 18-20 часов при температуре 0-5°С в замкнутом объеме (RU, патент 2067114 С1, C12N 1/20, А61К 35/74, C12N 1/04, 27.09.1996) (прототип).
Основным недостатком известных аналогов и прототипа в том числе является значительная инактивация действующих веществ в процессе хранения обезвоженных лабильных биологически активных материалов.
В основу заявляемого изобретения положена задача повышения сохраняемости действующих веществ в процессе хранения обезвоженных лабильных биологически активных материалов.
Задача решена тем, что жидкую фазу обезвоживают из микрокапельного состояния, стабилизированного сухим высокодисперсным гидрофобным разобщителем с наноразмерами частиц, при массовом соотношении жидкой фазы к сорбенту от 1:4 до 1:8.
В результате проведенных исследований нами впервые показано, что преимущество сорбционно-контактного обезвоживания жидкостей, содержащих биологически активные вещества, из микрокапельного состояния, стабилизированного сухим высокодисперсным гидрофобным разобщителем с наноразмерами частиц, заключается в том, что такое состояние формирует развернутую поверхность жидкости в порошке, составляющую по нашим данным 0,04-0,09 м2 в 1 см3 порошка, что обеспечивает большую площадь контакта с сорбентом и, соответственно, малую продолжительность переноса основной массы свободной влаги к сорбенту (до 2 минут).
Это в свою очередь позволяет быстро проходить отрезок относительной влажности микрокапельного порошка в смеси в диапазоне «критической влажности» 7-8%, соответствующей 22-28% относительной влажности биологически активных веществ (например, микроорганизмов) и обусловливающей их массовую инактивацию [Monk G.W., McCaffrey P.A., Davies M.S. Studies on the mechanism of sorbed water killing of bacteria // J. Bacteriol. - 1957. - V.73. - P.661-672], что приводит к повышению активности действующих веществ в процессе обезвоживания лабильных биологически активных материалов.
С изменением количества сорбента, используемого для обезвоживания жидкой фазы, содержащей биологически активные вещества, изменяется и соотношение компонентов препарата в единице его массы. Так, в соответствии с расчетами материального баланса, материал при соотношении жидкой фазы к сорбенту как 2:1 будет содержать сорбента 27,8%, влаги 46,9%, гидрофобного разобщителя - аэросила 16,6% и 8,7% биологически активных действующих веществ (см. чертеж). Увеличение количества сорбента до соотношения 1:8 приводит к резкому снижению количества всех остальных компонентов, особенно действующих веществ (до 1,7%). Поэтому использование больших количеств сорбента, чем при соотношении 1:8, экономически не оправдано и приводит лишь к физическому разбавлению препарата сорбентом. В то же время использование меньших количеств сорбента (соотношений жидкой фазы к сорбенту менее чем 1:4) не обеспечивает удовлетворительной сохраняемости действующих веществ в процессе длительного хранения высушенных материалов.
Согласно изобретению повышение сохраняемости действующих веществ в процессе хранения обезвоженных лабильных биологически активных материалов обеспечивается тем, что жидкую фазу обезвоживают из микрокапельного состояния, стабилизированного сухим высокодисперсным гидрофобным разобщителем с наноразмерами частиц, при массовом соотношении жидкой фазы к сорбенту от 1:4 до 1:8.
Заявляемый способ сорбционно-контактного обезвоживания высокодисперсных биологически активных материалов является новым и в литературе не описан.
Техническим результатом заявляемого изобретения является повышение сохраняемости действующих веществ в процессе хранения обезвоженных лабильных биологически активных материалов.
Сущность изобретения поясняется на следующих примерах, показывающих повышение сохраняемости действующих веществ в процессе хранения обезвоженных лабильных биологически активных материалов при реализации способа.
Содержание в препаратах жизнеспособных аэробных микроорганизмов Francisella tularensis определяли методом Пастера-Коха на твердых питательных средах. Содержание жизнеспособных анаэробных микроорганизмов Bifidobacterium bifidum определяли в жидких питательных средах методом предельных разведений. Концентрацию вируса вакцинного штамма La-Sota болезни Ньюкасла определяли культивированием в аллантоисной жидкости куриных эмбрионов [Сюрин В.Н., Белоусов Р.В., Фомина Н.В. Ветеринарная вирусология. - М.: Колос, 1986]. Стерилизацию сорбентов с одновременным обезвоживанием проводили в сухожаровом шкафу SUP-4 при температуре 120°С с выдержкой в установившемся тепловом режиме не менее 2 часов.
В качестве высокодисперсного гидрофобного разобщителя с наоразмерами частиц использовали высокодисперсный гидрофобный диоксид кремния - аэросил [Кинетика измельчения биопрепаратов в аппарате на базе плоского двухстороннего индуктора / Давыдкин И.Ю., Давыдкин В.Ю., Давыдкин Ю.П., Синицын Л.Е., Гаврин А.Г. // Медицинская промышленность и биотехнология. Наука-производство-маркетинг. - 1992. - Вып.5 - 6. - С.51 - 58; Разновидности наночастиц и их применение в биологии и медицине. - http://prostonauka.com/nano/nanotehnologii-v-biologii-i-medicine/nanomaterialy/nanochasticy].
Пример 1. Объект обезвоживания готовили смешением суспензии микроорганизмов Francisella tularensis штамма №33 НИИЭГ с лактозной защитной средой в соотношении 2:1. Микрокапельный порошок туляремийной вакцины получали, диспергируя суспензию Francisella tularensis штамма №33 НИИЭГ с рН=7,0 и содержанием жизнеспособных микроорганизмов 600×109 КОЕ/мл в присутствии гидрофобного аэросила AM-1-3 00 при их соотношении 10:3, в электромагнитном диспергаторе в течение 20 с.
Затем порошок туляремийной вакцины с жидкой фазой в микрокапельном состоянии, стабилизированном сухим высокодисперсным гидрофобным разобщителем с наноразмерами частиц, с концентрацией жизнеспособных микроорганизмов 581×109 КОЕ/г смешивали в шнековом смесителе с сорбентом КБ-4П-2 с остаточной влажностью менее 1% и температурой минус 10-15°С в течение 5 мин при соотношении жидкой фазы и сорбента 1:4. Смесь перегружали в металлические пеналы и помещали для равномерного распределения влаги по всему объему сорбента при температуре 2-8°С в течение 6-12 часов.
Биологическая активность готового сухого туляремийного вакцинного препарата, состоящего из сухих частиц (бактериальных клеток с компонентами защитной среды), стабилизированных сухим высокодисперсным гидрофобным разобщителем с наноразмерами частиц, и сорбента, составила 52,7×109 КОЕ/г, а его влагосодержание 15%.
Сохраняемость действующих веществ сухого туляремийного вакцинного препарата в процессе его хранения в течение года при температуре 2-8°С представлена в таблице.
Пример 2. Реализацию способа получения микрокапельного порошка Francisella tularensis и его обезвоживания осуществляли, как описано в примере 1, но при соотношении жидкой фазы к сорбенту 1:8.
Биологическая активность готового сухого туляремийного вакцинного препарата, состоящего из сухих частиц (бактериальных клеток с компонентами защитной среды), стабилизированных сухим высокодисперсным гидрофобным разобщителем с наноразмерами частиц, и сорбента, составила 43,0×109 КОЕ/г, а его влагосодержание 10,2%.
Сохраняемость действующих веществ сухого туляремийного вакцинного препарата в процессе его хранения в течение года при температуре 2-8°С представлена в таблице.
Пример 3. Реализацию способа получения микрокапельного порошка Francisella tularensis и его обезвоживания осуществляли, как описано в примере 1, но при соотношении жидкой фазы к сорбенту 1:6.
Биологическая активность готового сухого туляремийного вакцинного препарата, состоящего из сухих частиц (бактериальных клеток с компонентами защитной среды), стабилизированных сухим высокодисперсным гидрофобным разобщителем с наноразмерами частиц, и сорбента, составила 46,6×109 КОЕ/г, а его влагосодержание 11,7%.
Сохраняемость действующих веществ сухого туляремийного вакцинного препарата в процессе его хранения в течение года при температуре 2-8°С представлена в таблице.
Пример 4. Объект обезвоживания готовили смешением суспензии микроорганизмов Bifidobacterium bifidum шт.1C с сахарозо-молочной защитной средой в соотношении 2:1. Микрокапельный порошок пробиотического препарата получали, диспергируя суспензию Bifidobacterium bifidum шт.1C с рН=7,0 и содержанием жизнеспособных микроорганизмов 3,2×109 КОЕ/мл в присутствии гидрофобного аэросила AM-1-300 при их соотношении 10:3, в дисковом диспергаторе в течение 15 с.
Затем порошок пробиотического препарата с жидкой фазой в микрокапельном состоянии, стабилизированном сухим высокодисперсным гидрофобным разобщителем с наноразмерами частиц, с концентрацией жизнеспособных микроорганизмов 3,2×109 КОЕ/г смешивали в шнековом смесителе с сорбентом - дисперсной окисью алюминия с остаточной влажностью менее 1% и температурой минус 10-15°С в течение 5 мин при соотношении жидкой фазы к сорбенту 1:4. Смесь перегружали в металлические пеналы и помещали для равномерного распределения влаги по всему объему сорбента при температуре 2-8°С в течение 6-12 часов.
Биологическая активность готового сухого пробиотического препарата, состоящего из сухих частиц (бактериальных клеток с компонентами защитной среды), стабилизированных сухим высокодисперсным гидрофобным разобщителем с наноразмерами частиц, и сорбента, составила 4,6×108 КОЕ/г, а его влагосодержание 14,6%. Сохраняемость действующих веществ сухого пробиотического препарата в процессе его хранения в течение года при температуре 2-8°С представлена в таблице.
Пример 5. Реализацию способа получения микрокапельного порошка Bifidobacterium bifidum и его обезвоживания осуществляли, как описано в примере 4, но при соотношении жидкой фазы к сорбенту 1:8.
Биологическая активность готового сухого пробиотического препарата, состоящего из сухих частиц (бактериальных клеток с компонентами защитной среды), стабилизированных сухим высокодисперсным гидрофобным разобщителем с наноразмерами частиц, и сорбента, составила 2,5×108 КОЕ/г, а его влагосодержание 10%. Сохраняемость действующих веществ сухого пробиотического препарата в процессе его хранения в течение года при температуре 2-8°С представлена в таблице.
Пример 6. Реализацию способа получения микрокапельного порошка Bifidobacterium bifidum и его обезвоживания осуществляли, как описано в примере 4, но при соотношении жидкой фазы к сорбенту 1:6.
Биологическая активность готового сухого пробиотического препарата, состоящего из сухих частиц (бактериальных клеток с компонентами защитной среды), стабилизированных сухим высокодисперсным гидрофобным разобщителем с наноразмерами частиц, и сорбента, составила 4,0×108 КОЕ/г, а его влагосодержание 11,5%.
Сохраняемость действующих веществ сухого пробиотического препарата в процессе его хранения в течение года при температуре 2-8°С представлена в таблице.
Пример 7. Объект обезвоживания готовили смешением раствора иммуноглобулинов IgG, IgA, IgM с глицином (2%) в качестве защитной среды. Микрокапельный порошок иммунобиологического препарата получали, диспергируя раствор иммуноглобулинов IgG, IgA, IgM с рН=7,0 и противосальмонеллезной активностью 1:640 в титрах РПГА в присутствии гидрофобного аэросила R 972 при их соотношении 10:2, в дисковом диспергаторе в течение 20 с.
Затем порошок иммунобиологического препарата с жидкой фазой в микрокапельном состоянии, стабилизированном сухим высокодисперсным гидрофобным разобщителем с наноразмерами частиц, с противосальмонеллезной активностью 1:640 в титрах РПГА смешивали в шнековом смесителе с сорбентом КБ-4П-2 с остаточной влажностью менее 1% и температурой минус 10-15°С в течение 5 мин при соотношении жидкой фазы к сорбенту 1:4. Смесь перегружали в металлические пеналы и помещали для равномерного распределения влаги по всему объему сорбента при температуре 2-8°С в течение 6-12 часов.
Биологическая активность готового сухого иммунобиологического препарата, состоящего из сухих частиц (смеси иммуноглобулинов с компонентами защитной среды), стабилизированных сухим высокодисперсным гидрофобным разобщителем с наноразмерами частиц, и сорбента, составила 1:320 в тирах РПГА, а его влагосодержание 15,2%.
Сохраняемость действующих веществ сухого иммунобиологического препарата в процессе его хранения в течение года при температуре 2-8°С представлена в таблице.
Пример 8. Реализацию способа получения микрокапельного порошка иммуноглобулинов IgG, IgA, IgM и его обезвоживания осуществляли, как описано в примере 7, но при соотношении жидкой фазы к сорбенту 1:8.
Биологическая активность готового сухого иммунобиологического препарата, состоящего из сухих частиц (смеси иммуноглобулинов с компонентами защитной среды), стабилизированных сухим высокодисперсным гидрофобным разобщителем с наноразмерами частиц, и сорбента, составила 1:160 в тирах РПГА, а его влагосодержание 10,6%.
Сохраняемость действующих веществ сухого иммунобиологического препарата в процессе его хранения в течение года при температуре 2-8°С представлена в таблице.
Пример 9. Реализацию способа получения микрокапельного порошка иммуноглобулинов IgG, IgA, IgM и его обезвоживания осуществляли, как описано в примере 7, но при соотношении жидкой фазы к сорбенту 1:6.
Биологическая активность готового сухого иммунобиологического препарата, состоящего из сухих частиц (смеси иммуноглобулинов с компонентами защитной среды), стабилизированных сухим высокодисперсным гидрофобным разобщителем с наноразмерами частиц, и сорбента, составила 1:160 в тирах РПГА, а его влагосодержание 12,4%.
Сохраняемость действующих веществ сухого иммунобиологического препарата в процессе его хранения в течение года при температуре 2-8°С представлена в таблице.
Пример 10. Объект обезвоживания готовили смешением суспензии вируса болезни Ньюкасла вакцинного штамма La-Sota с защитной средой из обезжиренного молока в соотношении 2:1. Микрокапельный порошок вирусной вакцины получали, диспергируя суспензию вакцинного штамма La-Sota вируса болезни Ньюкасла с рН=7,0 и содержанием жизнеспособных вирусов 10,5 lg ЭИД50/мл, в присутствии гидрофобного аэросила AM-1-3 00 при их соотношении 10:3, в электромагнитном диспергаторе в течение 20 с.
Затем порошок вирусной вакцины с жидкой фазой в микрокапельном состоянии, стабилизированном сухим высокодисперсным гидрофобным разобщителем с наноразмерами частиц, с содержанием жизнеспособных вирусов 10,5 lg ЭИД50/г смешивали в шнековом смесителе с сорбентом КБ-4П-2 с остаточной влажностью менее 1% и температурой минус 10-15°С в течение 5 мин при соотношении жидкой фазы к сорбенту 1:4. Смесь перегружали в металлические пеналы и помещали для равномерного распределения влаги по всему объему сорбента при температуре 2-8°С в течение 6-12 часов.
Биологическая активность готового сухого вирусного вакцинного препарата, состоящего из сухих частиц (вирусных частиц с компонентами защитной среды), стабилизированных сухим высокодисперсным гидрофобным разобщителем с наноразмерами частиц, и сорбента, составила 10,3 lg ЭИД50/г, а его влагосодержание 16,0%.
Сохраняемость действующих веществ сухого вирусного вакцинного препарата в процессе его хранения в течение года при температуре 2-8°С представлена в таблице.
Пример 11. Реализацию способа получения микрокапельного порошка вируса болезни Ньюкасла и его обезвоживания осуществляли, как описано в примере 10, но при соотношении жидкой фазы к сорбенту 1:8.
Биологическая активность готового сухого вирусного вакцинного препарата, состоящего из сухих частиц (вирусных частиц с компонентами защитной среды), стабилизированных сухим высокодисперсным гидрофобным разобщителем с наноразмерами частиц, и сорбента, составила 10,0 lg ЭИД50/г, а его влагосодержание 11%.
Сохраняемость действующих веществ сухого вирусного вакцинного препарата в процессе его хранения в течение года при температуре 2-8°С представлена в таблице.
Пример 12. Реализацию способа получения микрокапельного порошка вируса болезни Ньюкасла и его обезвоживания осуществляли, как описано в примере 10, но при соотношении жидкой фазы к сорбенту 1:6.
Биологическая активность готового сухого вирусного вакцинного препарата, состоящего из сухих частиц (вирусных частиц с компонентами защитной среды), стабилизированных сухим высокодисперсным гидрофобным разобщителем с наноразмерами частиц, и сорбента, составила 10,2 lg ЭИД50/г, а его влагосодержание 12,2%.
Сохраняемость действующих веществ сухого вирусного вакцинного препарата в процессе его хранения в течение года при температуре 2-8°С представлена в таблице.
Как следует из анализа данных, представленных в таблице, материалы полученные при реализации заявленного способа сорбционно-контактного обезвоживания, обладают большей сохраняемостью действующих веществ в процессе хранения по сравнению с препаратами, приготовленными в соответствии с прототипом, что обеспечивается обезвоживаем сорбентами жидкой фазы из микрокапельного состояния, стабилизированного сухим высокодисперсным гидрофобным разобщителем с наноразмерами частиц, при массовом соотношении жидкой фазы к сорбенту от 1:4 до 1:8.
В представленных выше примерах приведены одинаковые условия проведения процесса сорбционно-контактного обезвоживания микрокапельных порошков биологической природы. Нашими исследованиями было показано, что изменение этих условий в определенных интервалах не оказывает существенного влияния на технический результат изобретения. О чем свидетельствуют данные, представленные в таблицах, характеризующие выживаемость микроорганизмов (на примере Serratia marcescens шт.ВКМ-851) при сорбционно-контактном обезвоживании микрокапельных порошков при различной температуре смешения порошка с сорбентом, разном соотношении жидкой фазы и сорбента, при изменении температуры выдерживания после смешения и продолжительности выдерживания после смешения.
Подобным образом могут быть высушены микрокапельные порошки с биологически активными действующими веществами не только биологической природы, но и любой другой. Причем достижение технического результата обеспечивается именно обезвоживанием из микрокапельного состояния, стабилизированного гидрофобным разобщителем.
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
СПОСОБ СОРБЦИОННО-КОНТАКТНОГО ОБЕЗВОЖИВАНИЯ ВЫСОКОДИСПЕРСНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ МАТЕРИАЛОВ | 2009 |
|
RU2455349C2 |
ПРЕПАРАТ, СОДЕРЖАЩИЙ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ДЕЙСТВУЮЩИЕ ВЕЩЕСТВА | 2009 |
|
RU2448730C2 |
ПРЕПАРАТ, СОДЕРЖАЩИЙ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ДЕЙСТВУЮЩИЕ ВЕЩЕСТВА | 2009 |
|
RU2440098C2 |
СПОСОБ КОМБИНИРОВАННОГО ОБЕЗВОЖИВАНИЯ ВЫСОКОДИСПЕРСНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ МАТЕРИАЛОВ | 2009 |
|
RU2440099C2 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОДИСПЕРСНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ МАТЕРИАЛОВ | 2009 |
|
RU2440105C2 |
ПРЕПАРАТ, СОДЕРЖАЩИЙ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ДЕЙСТВУЮЩИЕ ВЕЩЕСТВА | 2009 |
|
RU2448684C2 |
СПОСОБ СУБЛИМАЦИОННОГО ОБЕЗВОЖИВАНИЯ ВЫСОКОДИСПЕРСНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ МАТЕРИАЛОВ | 2009 |
|
RU2440106C2 |
Способ конвективного обезвоживания высокодисперсных биоматериалов | 2018 |
|
RU2720111C1 |
СПОСОБ КОМБИНИРОВАННОГО ОБЕЗВОЖИВАНИЯ ВЫСОКОДИСПЕРСНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ МАТЕРИАЛОВ | 2015 |
|
RU2583136C1 |
СПОСОБ ВВЕДЕНИЯ ЗАЩИТНОЙ СРЕДЫ В БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЙ МАТЕРИАЛ | 2009 |
|
RU2449775C2 |
Изобретение относится к медицине и фармацевтической промышленности и касается способа получения сухих биологически активных материалов сорбционно-контактным обезвоживанием. Материалы, содержащие биологически активные вещества, в жидкой фазе, переводят в микрокапельное состояние, стабилизированное сухим высокодисперсным гидрофобным разобщителем с наноразмерами частиц, с последующим обезвоживанием, при массовом соотношении жидкой фазы к сорбенту от 1:4 до 1:8. Изобретение позволяет повысить сохраняемость действующих веществ в процессе хранения обезвоженных лабильных биологически активных материалов. 1 ил., 5 табл., 12 пр.
Способ сорбционно-контактного обезвоживания влагоемкими сорбентами материалов, содержащих биологически активные действующие вещества, в жидкой фазе, отличающийся тем, что предварительно материалы, содержащие биологически активные вещества, в жидкой фазе переводят в микрокапельное состояние, стабилизированное сухим высокодисперсным гидрофобным разобщителем с наноразмерами частиц, при массовом соотношении жидкой фазы к сорбенту от 1:4 до 1:8.
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУХОГО ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА | 1991 |
|
RU2067114C1 |
СУХОЙ ПРОБИОТИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ | 2003 |
|
RU2268926C2 |
ВОРОБЬЕВ А.А | |||
и др | |||
Культивирование микроорганизмов в микрообъемах питательной среды | |||
Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, 2003, №3, с.11-15 | |||
ДАВЫДКИН И.Ю | |||
и др., Кинетика измельчения биопрепаратов в аппарате на базе плоского двухсторонненого индуктора, Медицинская |
Авторы
Даты
2012-06-27—Публикация
2009-01-15—Подача