СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУХИХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2020 года по МПК C12N1/04 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для получения сухих биопрепаратов на основе чувствительных к повреждающим факторам замораживания и оттаивания микроорганизмов, предназначенных для депонирования в коллекцию живых культур микроорганизмов, а также для практических исследований в научных, медицинских и образовательных целях.

Способ получения сухих бактериальных препаратов и их регидратации включает выращивание биопрепаратов на питательных средах, иммобилизацию на сухом стерильном носителе с последующим высушиванием и регидратацией перед использованием. В качестве носителя для иммобилизации клеток используют водорастворимый пористый материал, которым предварительно, перед высушиванием, пропитывают микробной суспензией в защитной среде из расчета 0,1 см³ суспензии на 1 см³ водорастворимого материала толщиной 1 мм. Способ обеспечивает повышение сохранности микроорганизмов, чувствительных к повреждающим живые клетки факторам замораживания, и биологически значимых свойств материала в течение длительного времени, упрощение манипуляций с биологическим материалом, используемым в дальнейшем для проведения лабораторного анализа, устранение потерь живых микробных клеток, извлекаемых из укупорки при регидратации, ускоряет процесс высушивания.

Бумага водорастворимая (watersolublepaper), ГОСТ 17586-80, полностью растворяется в горячей и холодной воде, безвредна, нетоксична, состоит из экологически чистых элементов и полностью биоразлагаема. В ее состав входят: целлюлозное волокно, карбоксиметилцеллюлоза, карбонат натрия и диоксид титана. Раствор водорастворимой бумаги имеет нейтральную рН среды (7,0-7,2 ед. рН) и не оказывает влияния на жизнеспособность микроорганизмов, что проверено экспериментальным путем.

Наиболее важными задачами, стоящими перед государственными коллекциями бактерий, являются поддержание коллекционных штаммов в жизнеспособном состоянии с сохранением их первоначальных свойств в течение максимально возможного времени, а также обеспечение ими научно-исследовательских, образовательных, медицинских и производственных учреждений. Для решения этих задач используют различные методы долгосрочной консервации штаммов [Филиппова, С.Н. Многолетнее хранение коллекционных культур актинобактерий / С.Н. Филиппова, Н.А. Сургучева, В.Ф. Гальченко // Микробиология. - 2012. - Т. 81, №5. - С. 682-690; Осин, А.В. Лиофилизация штаммов патогенных микроорганизмов на сублимационных установках разного типа и оценка качества полученных препаратов /А.В. Осин, Н.С. Червякова, Т.В. Валова // Пробл. особо опасных инф. - 2016. -№3. - С. 66-70]

Одним из наиболее часто используемых методов консервации микроорганизмов является лиофилизация. Клетки лиофилизированных бактериальных штаммов способны длительное время сохраняться в жизнеспособном состоянии при температуре 4°С, не утрачивая своих первоначальных свойств, что значительно упрощает деятельность по поддержанию коллекционного фонда микроорганизмов, а также позволяет легко транспортировать их в любой регион Российской Федерации. [Охапкина, В.Ю. Методы поддержания микробных культур. Часть 2. Лиофилизация. / В.Ю. Охапкина // Теоретическая и прикладная экология. - 2009 - №4 - С. 21-32.; Сидякина, Т.М. Жизнеспособность и биохимическая активность дрожжей Saccharomycesvini при сублимационном высушивании и криоконсервации / Т.М. Сидякина, Е.В. Кузнецова, М.Ю. Чумакова // Пробл. криобиол. - 1986. - №1. - С. 23-28.].

Известен способ высушивания биопрепаратов на коллекторном аппарате ЦИЭМ Долинова К.Е. [Долинов, К.Е. Основы технологии сухих биопрепаратов / К.Е. Долинов - М.: Медицина, 1969. - 231 с.]. Этот способ применяется для высушивания дозированных препаратов (живых вакцин, сывороток, микроорганизмов, диагностических препаратов и др.) в небольших объемах (до 2,5 мл в ампуле). Процесс сушки по этому способу включает: расфасовку биопрепарата по ампулам, предварительное замораживание в охлаждающей жидкости (сухой лед и спирт) при температурах от минус 20 до минус 78°С, сублимацию под вакуумом при остаточном давлении около 0,9 Па в течение 20-50 ч, удаление влаги.

Известен способ лиофильного высушивания, который включает подготовку и предварительное замораживание материала, сублимацию или перевод воды в парообразное состояние непосредственно из твердой фазы (минуя жидкую) в условиях вакуума, удаление испаряемой влаги [Бланков, Б.И. Применение лиофилизации в микробиологии / Б.И. Бланков, Д.Л. Клебанов. - М.: Медгиз, 1961. - 282 с.]. Удаление паров из препарата осуществляется с помощью охлаждаемых конденсаторов или прокаленного гипса, или адсорбента (например, силикагеля). В процессе высушивания из биоматериала удаляется 98-99% свободной и частично связанной воды.

Известен способ высушивания частиц биологических препаратов во встречных потоках газа и частиц раствора - распылительная сушка [Давыдкин, В.Ю. Технология и конструирование сухих биопрепаратов на основе микрокапельных порошков: дис.… д-ра биол. наук / В.Ю. Давыдкин. - Москва, 2011 - 271 с.]. Он более производителен, однако при данном способе высушивания биоматериала отсутствует возможность сушки непосредственно в ампулах или флаконах, возрастает риск контаминации, который при работе с биологическими или фармакологическими объектами должен сводиться к минимум и неприемлем в музейно-коллекционной работе. Все вышеизложенное существенно ограничивает применение этого метода.

Широко известен способ высушивания расфасованного биоматериала в камерных вакуумных установках [Никитин, Е.Е. Замораживание и высушивание биологических препаратов / Е.Е. Никитин, И.В. Звягин. - М.: Колос, 1971. - 342 с.]. Он включает те же этапы, что и другие способы лиофилизации: расфасовку материала, предварительное замораживание, сублимацию под вакуумом, отвод влаги. В некоторых установках данного типа применяют дополнительный прием, заключающийся в автоматической подаче в камеру газа или сухого стерильного воздуха. Этот прием за счет понижения вакуума в камере увеличивает теплопроводность, а следовательно, конвенционную подачу тепла к высушиваемому препарату, что ускоряет процесс сублимации.

При всех преимуществах описанного метода, таких как высокая производительность камерных аппаратов, техническое совершенство, низкая остаточная влажность, возможность дозировать препараты, процесс лиофилизации в них занимает продолжительное время - 20-70 ч, что влечет большой расход электроэнергии, высокие трудовые затраты.

В практике высушивания микроорганизмов известны способы, при которых используются самые разнообразные нерастворимые носители - почва, песок, бумага, смолы, активный уголь, зерна злаков и многие другие [Похиленко, В.Д. Методы длительного хранения коллекционных культур микроорганизмов и тенденции развития / В.Д. Похиленко, A.M. Баранов, К.В. Детушев // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Мед. науки. - 2009. - Т. 4, №12. - С. 99-121; Методы общей бактериологии: пер. с англ. / под ред. Ф. Герхардта - М.: Мир, 1983. - Т. 1. - С.512-534; Culture collections and the preservation of bacteria / S. P. Lapage [et al.] // Methods in microbiology. -1970. - V. 3, Part A. - P. 135-228].Сравнительно простым и недорогим способом хранения бактерий является их высушивание на полосках или дисках стерильной фильтровальной бумаги.

Известные способы консервации и транспортировки биологических материалов требуют либо замораживания в жидком азоте суспензии биологического материала со смесью соединений стабилизирующей композиции в водном растворе с получением твердых замороженных частиц, гранул, капель или нитей, либо заключения биологического материала в неагрессивную капсулу из металла, либо нанесения его на абсорбирующий бумажный лист, имеющий множество выборок зон, каждая выборка зоны имеет перфорацию, проходящую, по существу, по всему его периметру так, чтобы препятствовать перетеканию капиллярного жидкого образца из одной зоны в другую (RU 2573324, 20.01.2016; US 5516487, 14.05.1996; RU 2228617, 20.05.2004; WO 9957264, 11.11.1999).

Однако ни одна из технологий консервации не обеспечивает в полной мере решения проблемы долгосрочной консервации микроорганизмов без замораживания с сохранением их биологических свойств. Поэтому на данный момент представляется актуальным создание простого и в то же время эффективного способа, обеспечивающего сохранение жизнеспособности и биологически значимых свойств микроорганизмов без охлаждения их ниже нулевой отметки при высушивании и предотвращение гибели или снижения жизнеспособности микробов при регидратации.

Известен способ консервации биологических материалов путем сушки без замораживания с помощью стабилизирующей смеси веществ, включающей, по меньшей мере, два компонента: одно из группы, включающей моносахариды, дисахариды и цвиттерион с полярным остатком, второе вещество стабилизирующей смеси является цвиттерионом с неполярным остатком и представляет собой сложный эфир ацетилфенилаланина, аланин, цистеин, глицин, лейцин, метионин, триптофан, валин, саркозин. Стабилизированные биологические материалы обладают устойчивостью в процессе хранения при комнатной температуре и используются для диагностических и терапевтических целей (RU 2191003, 20.10.2002). Однако указанный способ включает в себя указанные выше дорогостоящие компоненты, сложен в исполнении и использовании.

Известен способ консервации биологических материалов, включающий выращивание культуры микроорганизмов в виде суспензии, смешивание ее с адсорбентом, порошком диоксида кремния, сушку на воздухе и диспергирование смеси до тонко дисперсного состояния [Пат. 2104299 Российская Федерация. Способ получения бактериальных препаратов / Ходак В.И., Фукс П.П., Квачов В.Г., Петренчук Э.П.; заявитель и патентообладатель Ходак В.И. -№96110483/13: заявл. 24.05.96; опубл. 10.02.98.]. Недостатками способа являются: сложность технологического процесса, включающего перемешивания суспензии микроорганизмов с сорбентом и диспергирование высушенной смеси до тонкодисперсного состояния на заключительном этапе приготовления биопрепарата; неконтролируемое высушивание на открытом воздухе при комнатной температуре, и, как следствие, нарушение стерильности.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ консервации биологических материалов, включающий иммобилизацию их на сухом носителе с последующим высушиванием без замораживания. В качестве носителя для иммобилизации используют крупнопористый химически нейтральный гидрофильный материал, который предварительно, перед иммобилизацией на него биологического материала, пропитывают консервирующим раствором. [Пат. 2619898 Российская Федерация. Способ консервации биологических материалов / Жигалева О.Н., Шестюк В.М.; заявитель и патентообладатель ООО «Биологическая среда». - №2016110713: заявл. 24.03.16; опубл. 19.05.17.].

Недостатком данного способа является неконтролируемый процесс высушивания биологического материала на воздухе, отсутствие стерильности при приготовлении его хранении, необходимость отмывки биологического материала от крупнопористого носителя и последующего концентрирования.

Общими существенными признаками известного и предлагаемого изобретений являются: иммобилизация биологического материала на сухом носителе с последующим высушиванием без замораживания.

Отличиями от прототипа заявляемого способа являются:

смешивание биопрепарата с защитными компонентами до нанесения суспензии на носитель;

нанесение суспензии на стерильный пористый водорастворимый носитель, находящийся в емкости, в количестве, предотвращающем растворение носителя;

высушивание биопрепарата в контролируемых условиях;

регидратация высушенного биоматериала внесением в емкость достаточного для растворения сухого носителя количества охлажденной дистиллированной воды;

полное растворение носителя суспензии микроорганизмов и равномерное распределение ее в жидкости, не требующее дополнительной отмывки или концентрирования.

Задачей заявляемого изобретения является разработка способа получения сухих бактериальных препаратов и их регидратации.

Технический результат, который может быть достигнут при использовании предлагаемого способа, заключается в предотвращении повреждения бактериальной клетки, происходящего в процессе замораживания-оттаивания микробной культуры, обеспечении высокой жизнеспособности и выживаемости бактерий при длительных сроках хранения, упрощении технологии получения сухих бактериальных препаратов путем исключения операций концентрирования биологического материала, устранении потерь микробных клеток при регидратации высушенной на носителе суспензии за счет применения в реализации способа водорастворимых веществ.

Поставленная задача решается путем выращивания биопрепаратов на питательных средах, смешивания их с защитными компонентами, нанесения суспензии микроорганизмов на стерильный пористый водорастворимый носитель, находящийся в емкости, последующего высушивания микроорганизмов без замораживания и регидратации перед использованием по целевому назначению. Для реализации способа на плотной питательной среде культивируют микроорганизмы, предполагаемые к высушиванию. Выращенные микроорганизмы смывают с поверхности плотной питательной среды предварительно подготовленными стерильными защитными компонентами. В стеклянную ампулу вносят фрагмент водорастворимого носителя, например, водорастворимой бумаги, и стерилизуют при 120°С в течение 20 минут. Приготовленную суспензию наносят на полоску стерильной водорастворимой бумаги, находящуюся в ампуле, из расчета 0,1 см³ суспензии на 1 см² поверхности водорастворимого материала толщиной 1 мм, что предотвращает преждевременное растворение носителя. Жидкая часть суспензии (жидкая дисперсная среда) впитывается в структуру водорастворимой бумаги, а микроорганизмы (дисперсная фаза) остаются в ее порах или на поверхности. Приготовленные таким образом ампулы присоединяются к коллектору сушильной установки и вакуумируются. Содержимое ампул высушивается от 6 до 8 часов при остаточном давлении 5-10 Па, подводе жидкого теплоносителя с температурой 25°С и температуре конденсатора-вымораживателя от минус 60 до минус 65°С. По окончании высушивания ампулы запаивают под аргоном или вакуумом. В дальнейшем после хранения, при необходимости, ампулу вскрывают, добавляют стерильную дистиллированную воду в количестве, достаточном для растворения носителя, и тщательно перемешивают.

Осуществление способа поясняется следующими примерами.

Пример 1

Вакцинный штамм EV чумного микроба выращивают в оптимальном температурном режиме на скошенном агаре Хоттингера до стационарной фазы роста и смывают с поверхности плотной питательной среды предварительно подготовленными стерильными защитными компонентами для получения необходимой для высушивания суспензии. В стеклянные ампулы вносят полоски водорастворимой бумаги площадью 2 см толщиной 1 мм и стерилизуют при 120°С в течение 20 минут. На каждую полоску стерильной водорастворимой бумаги, находящуюся в ампулах, асептически наносят приготовленную суспензию в количестве 0,2 см³, не достаточном для ее разрушения. Приготовленные таким образом ампулы присоединяют к коллектору сушильной установки и вакуумируют. Содержимое ампул высушивают 8 часов при остаточном давлении 5-10 Па, подводе жидкого теплоносителя с температурой 25°С и температуре конденсатора-вымораживателя - минус 65°С. По окончании высушивания ампулу запаивают под вакуумом. В дальнейшем, после хранения, при необходимости, ампулу вскрывают, добавляют стерильную охлажденную дистиллированную воду в количестве 5 см³, достаточном для растворения носителя, и тщательно перемешивают. Полученную регидратированную суспензию используют сразу по целевому назначению без дополнительной отмывки.

Выживаемость бактерий вакцинного штамма EV чумного микроба при таком способе получения сухих бактериальных препаратов и их регидратации на 10-15% превышает выживаемость микробов чумы, приготовленных традиционным способом. Снижения концентрации бактерий чумы в ампулах в течение 3 лет (срок наблюдения) не происходит.

Пример 2

Бактерии Legionella pneumophila штамма Филадельфия 1 выращивают в оптимальном температурном режиме в чашках Петри с угольно-дрожжевым агаром до стационарной фазы роста и смывают с поверхности плотной питательной среды предварительно подготовленными стерильными защитными компонентами для получения необходимой для высушивания суспензии. В стеклянные ампулы вносят полоски водорастворимой бумаги площадью 2,0 см² толщиной 1 мм и стерилизуют при 120°С в течение 20 минут. На каждую полоску стерильной водорастворимой бумаги, находящуюся в ампулах, асептически наносят приготовленную суспензию в количестве 0,2 см³, не достаточном для ее разрушения. Приготовленные таким образом ампулы присоединяют к коллектору сушильной установки и вакуумируют. Содержимое ампул высушивают 6 часов при остаточном давлении 5-10 Па, подводе жидкого теплоносителя с температурой 25°С и температуре конденсатора-вымораживателя - минус 65°С.По окончании высушивания ампулу запаивают под вакуумом. В дальнейшем, после хранения, при необходимости, ампулу вскрывают, добавляют стерильную охлажденную дистиллированную воду в количестве 5 см³, достаточном для растворения носителя, и тщательно перемешивают. Полученную регидратированную суспензию используют сразу по целевому назначению без дополнительной отмывки.

Выживаемость бактерий Legionella pneumophila штамма Филадельфия 1 при таком способе получения сухих бактериальных препаратов и их регидратации на 15-20% превышает выживаемость микробов возбудителя легионеллеза, приготовленных традиционным способом. Снижения концентрации легионелл в ампулах в течение 3 лет (срок наблюдения) не происходит.

Изобретение относиться к биотехнологии. Предложен способ получения сухих бактериальных препаратов, включающий нанесение бактериальной суспензии, смешанной с защитными компонентами, на сухой пористый носитель - водорастворимую бумагу, предварительно простерилизованную в емкости для высушивания, в ампуле, из расчета 0,1 см³ суспензии на 1,0 см² бумаги. Затем содержимое ампул высушивают без замораживания при 20-25°С, остаточном давлении 5-10 Па, температуре конденсатора-вымораживателя от минус 60 до минус 65°С в течение 6-8 ч. Изобретение обеспечивает сохранение жизнеспособности и биологических свойств микробных клеток при длительном хранении музейных культур микроорганизмов. 2 пр.

Способ получения сухих бактериальных препаратов, включающий иммобилизацию биологического материала на сухом пористом носителе в ампуле и высушивание, отличающийся тем, что в качестве носителя используют водорастворимую бумагу, предварительно простерилизованную в емкости для высушивания, на которую наносят суспензию биоматериала, смешанного с защитными компонентами, из расчета 0,1 см³ суспензии на 1,0 см² бумаги с последующим высушиванием биоматериала без замораживания при температуре 20-25°С при остаточном давлении 5-10 Па, температуре конденсатора-вымораживателя от минус 60 до минус 65°С в течение 6-8 ч.