ПРИБОР ДЛЯ МОНИТОРИНГА ПАРАМЕТРОВ ВЗВЕШЕННЫХ ЧАСТИЦ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/15 G01N33/48 G01N33/483 G01N33/50 G01N33/53 G01N33/533 

Изобретение относится к оптико-электронной промышленности и может быть использовано для комплексного исследования параметров взвеси частиц микронных и субмикронных размеров (10^-8 - 10^-4 м): распределения частиц по группам с определенными размерами, химического состава частиц, скоростей изменения этих характеристик. Эти исследования могут проводиться при решении практических задач медицинской диагностики, биотехнологии, экологии, химии, биохимии, фармакологии.

Известны флуориметры, в которых размерные параметры взвеси частиц и их химический состав измеряются с помощью одновременного применения метода светорассеяния и метода флуоресценции ([1], с. 95-96). Для этого частицы при прокачке взвеси с помощью насоса по микроскопическому капилляру по одной подаются в поле коротковолнового излучения, возбуждающего флуоресцентное излучение молекул красителя, которым предварительно насыщаются эти частицы (по спектру и интенсивности этого излучения судят о химическом составе, точнее, о содержании в частицах химических компонентов, изменяющих спектры флуоресценции), и в поле монохроматического коллимированного излучения, рассеивающегося на частицах (по индикатрисе рассеяния которого определяют размеры частиц). Для набора числа измерений, необходимого для представительности статистической выборки N_st (т.е. достаточно большого, чтобы статистические шумы были несущественны), сигналы от проходящих частиц накапливаются в течение времени Δt порядка десятков минут. Это вносит ограничение по временному разрешению измерений, что не позволяет исследовать динамику относительно быстрых процессов (с характерным временем t' порядка или меньше Δt и достаточно надежно определять скорости изменения измеряемых величин, особенно при их изменении со временем (скорость q' изменения некоторой характеристики q вычисляется по результатам измерений q₁ и q₂ в моменты времени t₁ и t₂: q'(t= t₂ ... t₁) ≈ (q₂-q₁)/(t₂-t₁), поэтому значение Δt ограничивает возможность уменьшения временного интервала t₂ - t₁, в течение которого можно определить одно значение q'. Конструкция такова, что N_st существенно меньше общего числа частиц в пробе N_sum. Это вносит ограничение снизу на число частиц в пробе. Кроме того, конструкция содержит технологически сложные микроскопические элементы, время измерения сигнала от одной частицы мало - несколько микросекунд, интенсивность излучения-сигнала мала; все это существенно усложняет производство и эксплуатацию таких приборов. Поэтому они дороги и используются в основном при научных исследованиях.

Наиболее близкими к описываемому изобретению являются сайзеры (гранулометры), в частности Mastersizer, серийно выпускаемые фирмой Malvern Instruments Ltd. (Великобритания) [2], в которых по рассеянию света на малые (от 0 до 10^o) и большие (от 10 до 180^o) углы определяются распределения по размерам. Для этого взвесь частиц приводится в движение (перемешивается) в камере, подается по трубке в проточную кювету и возвращается в камеру по другой трубке (причем размеры кюветы, характерные времена и интенсивности излучения-сигнала значительно больше, чем в вышеописанных флуориметрах, что существенно снижает стоимость прибора). Кювета просвечивается монохроматическим коллимированным лазерным излучением, которое рассеивается на частицах. Невозмущенное и рассеянное на углы от 0 до 10^o излучение фокусируется оптической собирающей линзой на набор фотоприемников малоуглового рассеяния (число которых M равно 30-40 шт.), находящихся в ее фокальной плоскости, а излучение, рассеянное взвешенными частицами в пределах углов от 10 до 180^o регистрируется фотоприемниками бокового рассеяния. По измеряемой индикатрисе рассеяния определяют распределение частиц по размерам, для чего сигналы от всех фотоприемников через аналого-цифровой преобразователь подают на ЭВМ и производят их совместную математическую обработку. При этом одновременно измеряются сигналы не от одной, а от значительного числа частиц N (от 100 до 10000, в зависимости от размеров), что хотя еще значительно меньше N_st, но позволяет сократить время накопления статистики Δt до значений порядка трех-десяти секунд. Значение N существенно меньше общего числа частиц в пробе N_sum, так как объем освещенной части кюветы намного меньше объема камеры и трубок. Это вносит ограничение снизу на число частиц в пробе.

В данном приборе измеряются только размеры частиц.

Задача изобретения - расширение функциональных возможностей прибора за счет одновременного измерения и распределения частиц по размерам, и их химического состава, а также увеличения точности определения скоростей изменения статистических характеристик.

Технический результат - получение относительно дешевого и простого в применении автоматизированного прибора комплексной диагностики размерных и химических параметров частиц, требующего относительно малого числа частиц в пробе (N_sum порядка N_st), обеспечивающего диагностику быстропротекающих процессов (вплоть до десятых = сотых долей секунды), а также значительно более точное определение функции распределения по размерам (на основе увеличения числа фотоприемников, например, до 1000 и более).

Сущность изобретения заключается в том, что в приборе для мониторинга параметров взвешенных частиц, содержащем установленные последовательно на оптической оси X источник монохроматического коллимированного излучения, кювету для размещения пробы, содержащей исследуемую взвесь частиц, собирающую линзу и набор фотоприемников малоуглового рассеяния, находящихся в ее фокальной плоскости, а также фотоприемники бокового рассеяния для регистрации излучения, рассеянного взвешенными частицами пределах углов от 10 до 180^o, оси которых пересекают кювету под соответствующими углами к оси X, систему приведения в движение пробы исследуемой взвеси частиц, аналого-цифровой преобразователь, на соответствующие входы которого подключены выходы всех фотоприемников, ЭВМ, на вход которой подключен выход аналого-цифрового преобразователя, в отличие от прототипа введен источник коротковолнового излучения для освещения кюветы, вход которого подключен к выходу ЭВМ, и система регистрации спектров флуоресценции, число фотоприемников малоуглового рассеяния превышает 50, объем кюветы выбран не меньше объема пробы исследуемой взвеси частиц, система приведения в движение пробы исследуемой взвеси частиц выполнена в виде постоянного магнита, размещенного в кювете, и источника переменного магнитного поля.

Дополнительно может быть введена система терморегулирования кюветы в составе термоизмерительного прибора, выход которого подключен на соответствующий вход аналого-цифрового преобразователя, и нагревателя или холодильника, вход которого подключен к выходу ЭВМ. Может также быть дополнительно введена система определения оптической плотности исследуемой взвеси в составе двух светоделительных пластин, внесенных в поле монохроматического коллимированного излучения до и после прохождения кюветы, и двух фотоприемников для регистрации монохроматического коллимированного излучения, оси которых пересекают соответствующие светоделительные пластины, а выходы подключены на входы аналого-цифрового преобразователя.

Система регистрации спектра флуоресценции может содержать, например, набор фотоприемников флуоресцентного излучения, оси которых проходят через кювету, а выходы подключены на вход аналого-цифрового преобразователя.

На чертеже изображена принципиальная схема прибора.

Кювета 1, в которую помещают взвесь исследуемых частиц, просвечивается источником монохроматического коллимированного излучения 2. Прошедшее через кювету 1 излучение, не испытавшее рассеяния или рассеянное частицами на углы до 10^o, фокусируется оптической собирающей линзой 3, и распределение по расстояниям от оптической оси X интенсивности излучения (определяющее индикатрису рассеяния) измеряется набором фотоприемников малоуглового рассеяния, находящихся в фокальной плоскости линзы 3. Интенсивность излучения, рассеянного частицами на углы от 10 до 180^o (ось Y), измеряется фотоприемниками бокового рассеяния 5. Кювета освещается также источником коротковолнового излучения 6, яркость флуоресценции частиц (для нескольких спектральных диапазонов) измеряется набором фотоприемников флуоресцентного излучения 7. Пространственная однородность исследуемой взвеси обеспечивается приведением в движение, например, с помощью источника переменного магнитного поля 8, вращающего магнит 9, который может свободно перемещаться в объеме кюветы 1. При необходимости температурный режим взвеси обеспечивается нагревателем или холодильником 10 и контролируется термоизмерительным прибором 11 (например, термопарой). Оптическая плотность взвеси может контролироваться путем сравнения сигналов двух фотоприемников монохроматического коллимированного излучения 12, оси которых проходят через две светоделительные пластины 13, отражающие определенную часть излучения до и после прохождения кюветы 1. Выходы измерительных устройств 4, 5, 7, 11, 12 подключены к входу аналогом цифрового преобразователя 14, соединенного с входом ЭВМ 15, входы исполнительных устройств 2, 6, 8, 10 соединены с выходом ЭВМ 15.

Прибор функционирует следующим образом. Исследуемые частицы в количестве порядка N_st помещают в жидкость (раствор), которая может содержать один или смесь нескольких красителей - флуоресцентных зондов (для возможности определения характеристик химического состава по флуоресценции). Взвесь частиц помещают в кювету 1. В отличие от проточной кюветы прототипа данная кювета имеет лишь одно отверстие для входа и выхода взвеси суспензии исследуемых частицей содержит все частицы пробы N_sum, что снижает ограничения на N_sum и Δt по сравнению с прототипом. Автоматически (под управлением ЭВМ 15) функционирует система перемешивания взвеси (источник переменного магнитного поля 8, вращающий магнит 9) и система термостатирования (нагреватель или холодильник 10 с термоизмерительным прибором 11), по результатам сравнения показаний фотоприемников монохроматического коллимированного излучения 12 происходит определение оптической плотности взвеси и производится проверка ее соответствия требованиям применимости используемых методов диагностики. Как правило, производится активация частиц - специальное дозированное химическое или физическое воздействие, которое меняет условия существования частиц и вызывает их определенную наблюдаемую реакцию (например, в суспензию биологических клеток добавляется дозированное количество биологически активного вещества или изменяется температура взвеси). Характеристики процессов реакции исследуемых частиц на активацию и должны быть основным предметом исследования с помощью данного прибора. После активации в соответствии с заранее составленной программой автоматически в определенные моменты времени производятся измерение статистических характеристик исследуемых частиц. Может происходить включение и выключение источников излучения 2 и 6. Источник излучения 6, как правило, включается лишь на временные интервалы, когда производится измерения спектров флуоресценции, так как длительное облучение коротковолновым излучением может повлиять на состояние частиц взвеси (например, большие дозы коротковолнового излучения могут активировать или даже убить биологические клетки). Излучение источника 2 менее активно и возможен также вариант непрерывного его действия. Запись в память ЭВМ 15 результатов измерения производится после обработки в аналого-цифровом преобразователе 14 сигналов, регистрируемых фотоприемниками 4 (информация о размерах относительно крупных частиц - порядка более 1 мкм), фотоприемниками 5 (сигналы от субмикронных частиц), и системой регистрации спектра флуоресценции - фотоприемники 7 (данные о количественном содержании химических компонентов, присутствие которых влияет на излучение молекул красителей, возбужденных коротковолновым излучением источника 6). Одновременно производится оперативная обработка и отображение на мониторе ЭВМ 15 информации в терминах функции распределения частиц по размерам, параметров их химического состава, скоростей изменения указанных характеристик и степени отклонения этих скоростей от заранее определенных ("нормальных") значений. Результаты окончательной автоматической совместной обработки всех сигналов могут отображаться на экране ЭВМ 15, переноситься на бумажные или магнитные носители.

Указанными взвесями могут являться, например, популяции клеток человека, животных, растений, (в т.ч. в присутствии вирусов), взвеси аэрозолей и суспензии (в т.ч. при гетерогенных реакциях). По скоростным характеристикам реакции частиц на дозированное воздействие часто можно судить о начальном состоянии данной пробы частиц (например, о патологии клеточной популяции). Такие исследования могут проводиться для целей медицинской диагностики, биотехнологии, экологии, химии, биохимии, фармакологии.

Следует отметить, что одновременное измерение скоростей изменения размеров и химического состава одной и той же пробы частиц (что и позволяет проводить описываемый прибор) должно позволить получить значительно более полную и надежную характеристику их начального состояния, чем измерения на различных специализированных приборах, проведенные для различных проб или разнесенные по времени (например, многие биологические частицы часто быстро меняют свои функциональные свойства, на их состояние могут воздействовать красители).

Существенно также повышение точности измерения распределений частиц по размерным группам (которые часто имеют качественно различную природу, например, клетки другого типа или в другом функциональном состоянии, в частности ослабленные, патологические, соединившиеся по несколько штук): например, при применении прибора в медицине чем меньшие отклонения от нормы можно надежно регистрировать, тем более ранний и подробный диагноз может быть поставлен. Такое повышение точности достигнуто на основе существенного увеличения числа фотоприемников малоуглового рассеяния - до M 1000 шт. и более. При этом значительно увеличивается значение N_st - до 500000 - 1000000, и вопросы набора статистики становятся особенно актуальными.

То, что одновременно в кювете находятся все частицы пробы N_sum (а не их небольшая часть, как в прототипе), приводит к тому, что одновременно снимается сигнал, статистически усредненный по числу частиц, превышающему N_st, что исключает необходимость повторных измерений для набора статистики и многократно снижает ограничения на время Δt измерения каждой из статистических характеристик исследуемых частиц до единиц миллисекунд и ниже.

Вместе с вышеуказанным повышением точности определения статистических характеристик частиц это позволяет решить задачу увеличения точности определения скоростей изменения статистических характеристик. Действительно, относительную погрешность Δq′/q′ определения скорости q' изменения статистической характеристики q по формуле q' (t = t₂ ... t₁) ≈ (q₂ - q₁)/(t₂ - t₁), можно оценить как сумму относительных погрешностей измерения q и t. Δq/q′ ≈ Δq/q+Δt/t, , а в данном приборе достигается снижение и Δq/q, и Δt/t. .

Немаловажным преимуществом данного прибора является и относительно малое требуемое число частиц в пробе N_sum - порядка необходимого для статистической обработки N_st (например, очевидна нежелательность забора больших объемов крови у пациента).

Рассмотрим применимость методов. Число частиц в световом поле
N=nXYZ,
где
X, Y, Z - размеры светового поля в направлениях осей X, Y, Z. Условие применимости метода малоуглового рассеяния: оптическая плотность τ_x в направлении излучения (оси X) должна быть значительно меньше единицы. С другой стороны, отношение сигнал/шум пропорционально τ_x. . Оптимальное значение τ_x, равное τ^*, лежит в области значений порядка 0,2. Это обеспечивается выполнением соотношения
τ_x= Xσn = τ^*, ,
где
σ = πd²/4 площадь среднего поперечного сечения частиц;
d и n - их характерный размер и концентрация.

Аналогично, условие применимости метода рассеяния на большие углы, например на углы порядка 90^o, обеспечивается при
τ_y= Yσn = τ^*, ,
где
τ_y - оптическая плотность в направлении оси Y.

Достаточное значение N (не менее N_st), для заданных d и C = Z/X, например, при равных X и Y обеспечивается выбором n из условия
n = [Cτ3x

Например, при N = N_st = 10⁶, d = 5 мкм, C = 2, отсюда следует X = Y = 7 мм, n = 2•10⁶ частиц на мл. При больших размерах, например X = Y = 10 мм, и выборе n при соблюдении условия, что τ_x равно τ^*, , получается N = 2•10⁶ > N_st, т. е. надежность измерения статистических характеристик в этом случае обеспечивается.

Список литературы.

l. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. M.: Наука. 1989.

2. Mastersizer: Reference Manual (Preliminary Manual - Software Version 2.1 and later). Worcs.: Malvern Instruments Ltd., 1996 (Справочное руководство пользователя прибора Mastersizer, версия программного обеспечения 2.1 и выше).

Используется для оперативного исследования комплекса параметров взвеси частиц микронных и субмикронных размеров, например, популяции клеток человека, животных, растений, для решения практических задач медицинской диагностики, биотехнологии, экологии, химии, биохимии, фармакологии. Прибор содержит непроточную прозрачную кювету 1 с исследуемыми частицами с системой перемешивания взвеси, источник монохроматического коллимированного излучения 2, оптическую фотоприемники малоуглового рассеяния 4 числом порядка тысяч, а также фотоприемники бокового рассеяния 5, систему возбуждения (источник коротковолнового излучения 6) и измерения флуоресценции в виде набора фотоприемников флуоресценции 7, аналого-цифровой преобразователь 14, на вход которого подключены выходы всех измерительных приборов, и электронно-вычислительную машину 15, обеспечивающую автоматическое функционирование, хранение и оперативную обработку результатов измерений. Кроме того, дополнительно может быть введена система терморегулирования кюветы в составе термоизмерительного прибора 11 и нагревателя или холодильника 10, а также система определения оптической плотности кюветы в составе двух светоделительных пластин 13, внесенных в поле монохроматического коллимированного излучения до и после прохождения кюветы 1 и двух фотоприемников 12. Этот прибор отличают следующие свойства: относительно малое требуемое число частиц в пробе, порядка N_s t,, необходимого для того, чтобы статистические шумы были несущественны, обеспечение диагности статистических характеристик быстропротекающих (до 0,01 с) процессов (за счет одновременного приема сигнала от N_s t частиц), повышенное пространственное разрешение (за счет большого числа фотоприемников - порядка тысяч), а также относительная дешевизна и простота в изготовлении и применении. 3 з.п. ф-лы, 1 ил.

1. Прибор для мониторинга параметров взвешенных частиц, содержащий на оптической оси X источник монохроматического коллимированного излучения, установленный так, что его излучение проходит кювету для размещения пробы взвеси с исследумыми частицами, оптическую собирающую линзу, набор фотоприемников малоуглового рассеяния, расположенных в ее фокальной плоскости, а также фотоприемники бокового рассеяния, оси которых проходят через кювету под углами от 10 до 180^o относительно оси X, систему приведения в движение пробы взвеси с исследуемыми частицами, аналого-цифровой преобразователь, на вход которого подключены выходы всех фотоприемников, ЭВМ, на вход которой подключен выход аналого-цифрового преобразователя, отличающийся тем, что дополнительно введен источник коротковолнового излучения для освещения кюветы, вход которого подключен к выходу ЭВМ, и система регистрации спектра флуоресценции, число фотоприемников малоуглового рассеяния превышает 50, кювета имеет объем не меньше объема пробы взвеси с исследуемыми частицами, а система приведения в движение пробы взвеси с исследуемыми частицами содержит постоянный магнит, помещенный в объем кюветы, и источник переменного магнитного поля. 2. Прибор по п.1, отличающийся тем, что дополнительно введена система терморегулирования кюветы в составе термоизмерительного прибора, выход которого подключен на вход аналого-цифрового преобразователя, и нагревателя или холодильника, вход которого подключен к выходу ЭВМ. 3. Прибор по п.1, отличающийся тем, что в него дополнительно введена система определения оптической плотности исследуемой взвеси в составе двух светоделительных пластин, внесенных в поле монохроматического коллимированного излучения до и после прохождения кюветы, и двух фотоприемников для регистрации монохроматического коллимированного излучения, оси которых проходят через соответствующие светоделительные пластины, а выходы подключены на входы аналого-цифрового преобразователя. 4. Прибор по п.1, отличающийся тем, что система регистрации спектра флуоресценции содержит набор фотоприемников, флуоресценции, оси которых проходят через кювету, а выходы подключены на вход аналого-цифрового преобразователя.