СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ МЕТАСТАЗОВ ОПУХОЛИ Российский патент 1998 года по МПК A61K31/557 

Изобретение относится к способу лечения метастазов опухоли.

Известно, что (Science, 212, 1270, 1981) применение простациклина (PGI₂) в высокой дозе 10 мг/кг непосредственно перед внутривенной инъекцией опухолевых клеток мышиной B 16 меланомы сопровождалось уменьшением легочных метастазов.

Такое действие PGI₂ объясняется ингибированием адгезии и агрегации опухолевых клеток. Однако применению препарата препятствует слишком небольшая продолжительность полураспада PGI₂ и слишком высокая его доза. По этой причине представляется более целесообразным использование в фармацевтических целях стабильного аналога простациклина илопроста.

V. Costantini et al. (Cancer Chemother Pharmacol., 22, 289, 1988) проводили сравнительное изучение антиметастатической активности PGI₂ и илопроста в дозах соответственно 5 - 10 и 0,1 - 0,2 мг/кг, оценивая образование легочных метастаз после внутривенного введения мышам опухолевых клеток меланомы линии BLC. Характер действия обоих препаратов зависит от количества введенных опухолевых клеток и продолжительности периода между введением антиметастатических средств и опухолевых клеток. В различных вариантах эксперимента илопрост оказался более эффективным, чем PGI₂ с точки зрения дозировки, продолжительности действия и достигавшегося уровня ингибирования.

Piccini et al. (1988) получили сравнительные данные о действии тех же препаратов на легочную карциному Льюиса при их введении в тех же дозах и при сходной постановке эксперимента. Однократное введение илопроста в дозе 0,2 мг/кг за час до инокуляции опухолевых клеток приводило к снижению количества легочных метастаз более, чем на 90%.

Однако условия тестирования, в частности внутривенная инокуляция опухолевых клеток или однократное введение антиметастатического средства, были весьма далеки от клинических условий.

Более приближаются к последним условия другого исследования, проведенного Piccini et al. Эти авторы использовали стандартную модель для оценки антиметастатической активности, а именно: имплантацию первичной опухоли (легочной карциномы Льюиса) в ножную мышцу с последующим хирургическим удалением опухоли (посредством ампутации конечности). В этих условиях илопрост, вводившийся в дозе 0,2 мг/кг за 1,5 ч. до удаления опухоли, уменьшал количество легочных метастаз примерно на 50%. Вместе с тем, продолжительность жизни увеличивалась весьма незначительно.

Совершенно неожиданно установлено, что эпталопрост, цикапрост и комбинированное применение эталпроста и цикапроста с антагонистом тромбоксана A₂ (TXA₂) обладают избирательным антиметастатическим действием, в отличие от известного до сих пор действия других простациклинов. Эти препараты не влияют, в частности, на рост первичной опухоли.

Задачей настоящего изобретения является создание способа лечения метастазов опухоли препаратом, содержащим эпталопрост, цикапрост, их аддитивные соли на физиологически совместимой основе, клатраты с циклодекстринами или одно из указанных соединений в комбинации с антагонистом тромбоксана A₂, в сочетании с обычными вспомогательными компонентами и инертными веществами.

Поставленная задача достигается данным способом, включающим введение простагландина после индуцирования опухоли и введение эпталопроста или цикапроста в эффективной для этого дозе.

Предпочтительным является введение эпталопрост-клатрата или циклапрост-клатрата.

Эпталопрост [(5E)-(16S)-13,14-дигидро-Ia, Ib-дигомо-16,20- диметил-3-окса-18, 18, 19,19-тетрагидро-6a-карбапростагландин-I₂] и его бета-циклодекстриновый клатрат можно получить, используя, например, следующую процедуру: 17,2 мл 50%-ного раствора гидроокиси натрия и 337 мг кислого сульфата тетрабутиламмония добавляют в смесь из 6,9 г 2-[(E)-(1S, 5S, 6S, 7R)-7-(диметил-трет-бутилсилилокси)-6-[(3S, 4S)-3-(диметил-трет- бутилсилилокси)-4-метил-нона-1,6-диинил] -бицикло [3.3.0]октан-3- илиден]-этан-1-ола (W. Scuballa, E.Schillinger, C-S Stuerzebecher, M. Vorbruggen, J. Medicinal Chemistry, 29, 313, 1986) (в данном описании: соединение 15a) и 11,5 г триметил-орто-4-бромбутирата, перемешивая при 22^oC на протяжении 16 ч в атмосфере аргона. Затем, в условиях охлаждения ледяной водой, смесь разбавляют 20 мл воды и подкисляют 10%-ным раствором лимонной кислоты до pH 5. После трехкратной экстракции 300 мл эфира (3 • 300 мл) органическую фазу однократно промывают 200 мл солевого раствора, высушивают над сернокислым магнием и концентрируют упариванием в вакууме. Остаток хроматографируют на силикагеле в системе гексан/эфир (8 + 2), получая 7,6 г (5E)-(16S)-13,14-дидегидро-Ia, Ib-дигомо-16,20-диметил-3-окса- 18,18,19,19-тетрадигидро-6a-карбапростагландин-I₂-метилэфира-11,15- бис-(диметил-трет-бутил-эфира) в форме бесцветного масла.

ИК-спектроскопия в CHCl₂: 2953, 2925, 2859, 2230, 1730, 1250, 838 см^-1.

Для расщепления силилового эфира 7,25 г вышеописанного биссилилового эфира перемешивают в течение 48 ч при 24^oC с 600 мл смеси уксусной кислоты, воды и тетрагидрофурана в соотношении 65+35+ 10. Конечную смесь концентрируют упариванием под вакуумом, а остаток хроматографируют на силикагеле. Элюция в системе этилацетат/гексан (3 + 2) дает 3,9 г (5E)-(16S)-13,14-дидегидро-Ia, Ib-дигомо-16,20-диметил- 3-окса-18, 18,19, 19-тетрагидро-6a-карбапростагландин-I₂-метилового эфира в форме бесцветного масла.

ИК-спектроскопия в CHCl₂: 3400 (широкая линия), 2935, 2865, 2230, 1735 см^-1.

С целью омыления раствор 3,66 г вышеуказанного метилового эфира перемешивают с 35 мл метанола и 35 мл 0,5 M раствора гидроокиси натрия при 24^oC в течение 30 мин в атмосфере аргона. После этого разбавляют 20 мл воды, подкисляют 20%-ной лимонной кислотой до pH 2 и экстрагируют 4 раза метиленхлоридом (по 100 мл), а затем органическую фазу однократно промывают 50 мл солевого раствора, сушат над сернокислым натрием и концентрируют посредством упаривания под вакуумом. Остаток подвергают хроматографированию на силикагеле в этилацетате. В результате получают 3,4 г искомого соединения в виде бесцветного масла.

ИК-спектрометрия в CHCl₂: 3400 (широкая линия), 2962, 2940, 2865, 2230, 1722 cм^-1.

Бета-циклодекстриновый клатрат (5E)-(16S)-13,14-дидегидро-Ia, Ib-дигомо-16,2О-диметил-3-окса-18,18-19,19-тетрадигидро-6a-карбапростагландина-I₂.

41,75 г бета-циклодекстрина разбавляют 298 мл воды при 80^oC, после чего выливают в раствор 1,5 г (5E)-(16S)-13,14-дидегидро-Ia, Ib-дигомо-16,2О-диметил-3-окса-18,18,19,19-тетрадегидро-6a- карбапростагландина-I₂ в 24 мл этанола в течение 15 мин. Полученную смесь перемешивают в течение 4 ч при 60^oC, после чего оставляют на ночь для охлаждения при непрерывном перемешивании. Твердый осадок отсасывают, промывают 50 мл смеси этанола с водой (1: 1) и в течение 24 ч при давлении 0,1 Tор и температуре 25^oC высушивают над пятиокисью фосфора. В результате получают 38 г жидких кристаллов бета-цикло-декстринового клатрата вышеописанного аналога карбациклина. Содержание карбациклинового аналога в клатрате определяют методом титрования. Оно достигает 3,3%.

Цикапрост и его бета-циклодекстриновый клатрат можно получить в соответствии с процедурой, описанной в EP-PS 119, 949 (CA 1,251,200) и в международной выложенной заявке WO 87/05295 (V.S. 4,886,788).

В качестве антагонистов тромбоксановых рецепторов (TXA₂) можно использовать соединения, описанные в следующих патентных документах: J5 5017-315, US 4,472,586, US 4,263,207, US 4,394,515, US 4,282,365, BE 883,713, J5 7093-962, J6 0004-154, EP 43-292, EP 82-646, DE 3,346,047, WO 0400-754, US 4,474,804, DE 3,401,986, DE 3,127,343, BE 897-763, EP 74-861, AU 84/25,607, EP 78-668, DE 3,339,019, EP 137,426 и у N.H.Wilson and R.L.Jones (Advances in Prostaglandin, Thromboxane and Leukotrine Research, 14, 420 -423, 1985), а также у K.Stegmeier et al. (Thrombosis Research, 35, 379 - 395, 1984).

В качестве примеров приведены следующие соединения: 4-[2- (бензолсульфонамид)-этил] -феноксиуксусная кислота (ВМ 13 177) (K.Stegmeier et al. (Thrombosis Research, 35, 379-395, 1984).

[1-альфа(Z), 2-бета, 5-альфа-(+)-(7)-[5-[[1,1-6ифенил)-4-ил] метокси]-2-(4-морфолинил)-3-оксоциклопентил] -4-гептановая кислота (AH 23848) (Br. J. Pharmac., 1985, 86, 259).

[1-бета, 2-альфа(5Z), 3-альфа, 4-бета]-7[[2-[(фениламино)карбонил] гидразино] метил] -7-оксабицикло [2.2.1] -гепт-2-ил] -5-гептеновая кислота (SQ 29.548) (Prostaglandins, 29, 785, 1985).

4-(4-хлорбензолсульфониламино)-этил-бензол-уксусная кислота (ВМ 13 505) (Intern. Confr. Leukotrienes and Prostanoids in Health and Disease, Tel Aviv, Oct., 1985., р. 10).

7-[3-[[[(фениламино)карбонил] гидраксонол] метил]- бицикло [2.2.1]гепт-2-ил] -[1-альфа, 2-бета, (Z), 3-альфа, 4- альфа] (ЕР 045) и 7-[(1S, 2S, 3S, 4R)-3-[1-(3-фенилтиорейдоимино)- этил] -6ицикло [2.2.1]гептан-2-ил]-5-гептеновая кислота (ЕР 092) (оба вещества описаны R.A.Armstrong et al. Br. J. Pharmacol., 84, 595-607, 1985),
дибензо / b,f /тиэпин-3-метанол-5,5-диоксид (L640035) (C-C. Chan, Europ. J. Pharmacol., 110, 3, 323-328, 1985)/,
2,7(1Н)-изохинолин дисульфонамиды, N7-(3-хлорфенил)-N2-[[7- [[(3-хлорфенил)амино] сульфонил]-3,4-дигидро-2(1Н)- изохинолинал]сульфонил]-3,4-дигидро (SKF 88046) (B.W.Weichman et al. Prostaglandins, Leukotrienes, and Medicine, 15, 165-167, 1984).

При внутривенном введении эпталопроста, цикапроста или вышеупомянутых комбинаций дозы препаратов в пересчете на содержание простациклина или его аналогов должны составлять 1 - 50 мкг на больного, предпочтительно 12,5 мкг/день. При пероральном введении используют дозы 125-350 мкг/день на человека.

Для перорального применения используют обычные таблетки, таблетки в оболочках, капсулы, пилюли, суспензии или растворы, которые изготавливают как любые другие препараты растительного происхождения с добавкой наполнителей и инертных компонентов. При этом используют дозировки, содержащие 25-50 мкг простациклина или его аналогов (25 - 250 мкг в препаратах длительного действия).

Антагонисты рецепторов тромбоксана согласно настоящему изобретению применяются в количествах, рекомендуемых другими авторами для человека (Riess, H. E.Hiller, B.Reinhar C.Brauning, Thrombosis Res, 35 1984). Обычно дозировки составляют от 100 до 3000 мг/день на больного, предпочтительно от 200 до 1200 мг/день, в случае препарата БМ 13177 или 1 - 150 мг/день, предпочтительно 2 - 100 мг/день на больного, в случаях препаратов AH 23848 и SQ 29548, или биологически эквивалентные количества других антагонистов рецепторов тромбоксана.

Если простациклины используются в сочетании с другими клатратами и солями, соотношение отдельных компонентов смеси не имеет существенного значения при условии, что биологически эквивалентные количества суммарного активного ингредиента не выходят за пределы указанного диапазона дозировок.

Предпочтительными лекарственными формами для перорального применения являются обычные таблетки, таблетки в оболочках, капсулы, пилюли, суспензии или растворы, которые общепринятыми в производстве лекарственных препаратов растительного происхождения способами смешивают с добавками и инертными компонентами.

В комбинированных препаратах используют весовые соотношения простациклина и его аналогов или антагонистов рецепторов тромбоксана, которые на практике значительно ниже по сравнению с дозировками индивидуальных активных ингредиентов, используемых в настоящее время при других показаниях.

Простациклин или его аналоги и антагонисты рецепторов тромбоксана комбинируют в составе одной лекарственной формы или применяют в качестве самостоятельных лекарственных средств для одновременного или последовательного введения в весовых соотношениях от 1:0,1 до 1:100 (например, в составе одного носителя, таблетки, или масляного раствора, такого как масляная смесь бензил-бензоата/касторового масла).

Диапазон соотношения простациклинов в TXA₂ может быть весьма широким, при условии что лекарственная форма содержит достаточное для проявления антиметастатического действия согласно настоящему изобретению количество простациклина. Наиболее предпочтительным является соотношение 1:0 - 1:10, особенно желательно применять эти вещества в соотношении от 1:0,1 до 1:1.

В качестве циклодекстрина в лекарственных формах, содержащих также простациклины, желательно использовать бета-циклодекстрин.

Изобретение также касается применения эпталопроста, цикапроста и комбинированных препаратов антагонистов рецепторов TXA₂ и производных простациклина для изготовления фармацевтических препаратов, обладающих антиметастатическим действием. Поскольку практически все злокачественные опухоли у человека дают метастазы (за исключением рака, связанного с лейкемией), настоящее изобретение относится ко всем видам злокачественных новообразований.

Основываясь на вышеизложенном, нетрудно воспроизвести и максимально эффективно использовать способ согласно изобретению без дополнительной детальной информации. В связи с этим приводимые ниже примеры следует рассматривать лишь в качестве иллюстрации; они ни в коей мере не ограничивают иные возможности реализации изобретения.

В ранее описанных и нижеследующих примерах температура указана в градусах Цельсия, без поправок, а относительные величины приведены в весовых процентах, если не указано иначе.

Пример 1.

В описанных ниже тестах использовали клеточную линию R 3327 MAT- Lu. Эта линия описана в обзоре J.T.Isaacs (Current Concepts and Approaches to the Study of Prostate Cancer, 513-576, Alan R. Liss Inc., Animal Model Systems) на c. 533. Она была впервые получена D.W.Lanzan, W.D.W.Heston, D.Kadmon, and W.R.Fair (Division of Urology, Dept. of Surgery, Washington University School of Medicine, St. Lousis).

B вышеуказанной статье описаны также линии животных, использовавшиеся для получения клеток, и подробные данные о характере их роста.

D. W.Lazan et al. описали в Cancer Research (42, 1390, 1982) способ приготовления клеточных суспензий линии R 3327 MAT Lu из свежей ткани опухолей, взятой у индивидуальных животных (крыс).

Линия опухолевых клеток R 3327 MAT Lu, полученная д-ром Isaacs из Университета Джона Хопкинса, характеризуется быстрым ростом, отсутствием гормональной зависимости и стероидных рецепторов. Частота ее метастазирования достигает 100%, при продолжительности жизни животных после имплантации под кожу около 35 дней. Для оценки антиметастатического действия производных простациклина или их комбинаций с антагонистами рецепторов TXA₂ использовали методику подкожной имплантации без удаления первичной опухоли.

l. Опухоль получали в асептических условиях от животных - доноров спустя примерно 4 недели после имплантации. Опухоль помещали в среду 199 (минимальная питательная среда, стандартизированная компанией Gibco, Великобритания), освобождали ее от некротизированной ткани и разрезали на кусочки приблизительно 2 мм в длину. Каждый такой фрагмент подкожно имплантировали одной крысе - самцу линии Сор (OIAC, Англия). Животных произвольно распределяли по 4 группам, по 10 особей в каждой. На следующий день им подкожно имплантировали мини-насосы Alzet. Крысы первой группы получали растворитель, крысы второй группы - илопрост в дозе 300 нг/кг/мин, крысы третьей группы - эпталопрост в дозе 100 нг/кг/мин. Мини-насосы извлекали на 16 день эксперимента.

Размеры опухолей определяли раз в неделю с помощью штангенциркуля. Площадь их поверхности рассчитывали как произведение максимального диаметра на перпендикулярный ему диаметр. В конце испытания животных забивали обезглавливанием и определяли концентрацию активных ингредиентов в крови. Легкие вырезали, фиксировали в растворе Боуэна на протяжении 24 ч, а в последующем хранили в спирте. Количество легочных метастаз определяли путем простого подсчета. Эта задача облегчалась отсутствием окрашивания метастаз в среде Боуэна. Выявленные метастазы классифицировали по двум категориям: "крупные" и "мелкие".

2. Действие илопроста и эпталопроста на клетки R 3327 MAT Lu.

Избранная методика тестирования (подкожная имплантация опухолевых клеток без удаления первичной опухоли) предъявляет очень высокие требования к антиметастатической активности препаратов, поскольку первичная опухоль непрерывно продуцирует новые метастазы.

По окончании испытания вес тела крыс существенно не изменялся под воздействием терапии простациклинами (таблица).

Начиная со второго дня после имплантации наблюдали прогрессивный опухолевый рост (фиг. 1). Специфический ингибитор метастазирования не оказывал существенного воздействия на рост первичной опухоли. Скорость роста первичной опухоли в условиях терапии илопростом или эпталопростом также достоверно не отличалась от наблюдавшейся в контроле.

Определение количества метастаз в легких является единственным способом оценки антиметастатической активности лекарственных средств, поскольку использовавшаяся клеточная линия дает опухоли, метастазирующие только легкие. Обнаруженные метастазы характеризовались значительными различиями размеров (от менее 1 до 3 мм в диаметре). Подразделение на "мелкие" и "крупные" метастазы производили без учета большого числа образований промежуточного размера.

Илопрост не вызывал уменьшения общего количества легочных метастаз в данной экспериментальной модели. В то же время эталопрост значительно ингибировал образование метастаз (фиг. 2). При использовании илопроста относительное количество "крупных" метастаз обнаруживало тенденцию к снижению (фиг. 3), тогда как число "мелких" метастаз нарастало, по сравнению с наблюдавшимся в контроле (фиг. 4). Антиметастатическое действие эталопроста в отношении снижения количества "крупных" метастаз было выражено значительно сильнее, чем в отношении ингибирования числа "мелких" метастаз.

3. Во втором эксперименте, проводившемся аналогично предыдущему, эталопрост вводили в дозах от 0,1 до 0,5 мг/кг/день перорально, начиная со дня имплантации опухоли до завершения испытаний. При дозе 0,1 мг/кг/день препарат не оказывал видимого действия на формирование метастаз в легких. Действие на первичную опухоль также отсутствовало. При более высокой дозе (0,5 мг/кг/день) эпталопрост вызывал достоверное уменьшение количества метастаз (р < 0,05 по критерию Даннета) (см. фиг. 5).

На фиг. 1 показано действие илопроста и эпталопроста на рост первичной опухоли R 3327 MAT Lu; на фиг. 2 - действие илопроста и эпталопроста на общее количество легочных метастаз; на фиг. 3 - действие илопроста и эпталопроста на количество "крупных" легочных метастаз; на фиг. 4 - действие илопроста и эпталопроста на количество "мелких" легочных метастаз; на фиг. 5 - действие эпталопроста в разных дозировках на количество легочных метастаз.

Пример 2.

Используемая опухоль представляет собой трансплантируемую SMT 2a карциному молочной железы крысы линии Wistar - Furth с метастазами в лимфатических узлах и легких. После S.c. имплантации сегментов опухоли проводят лечение цикапростом в дозах 0,1; 0,5 и 1,0 мг/кг р.о. ежедневно в течение свыше 6 недель. Цикапрост вызвал дозозависимое ингибирование числа легочных метастаз. При дозе цикапроста 1 мг/кг у пяти из десяти животных метастазы исчезали. При этой дозе был значительно уменьшен вес лимфоузлов.

Рост опухоли не наблюдался.

Пример 3.

Опухоль простаты
Карцинома К 3327 MAT Lu и простаты крысы Сор /Цикапрост-клатрат
Цикапрост вводят в дозах по 0,1-1,0 мг/кг ежедневно, начиная с 2 ч перед имплантацией опухоли, в течение 29 дней. Затем эксперимент останавливают и количество легочных метастазов подсчитывают. Обработка цикапрост-клатратом в трех различных дозах приводит в результате к уменьшению числа легочных метастазов, зависящему от дозы. Как доза 0,1 мг/кг, так и доза 0,5 мг/кг уменьшает среднее число легочных метастазов приблизительно на 50% в сравнении с контролем. Наиболее эффективной является доза в 1 мг/кг, которая снижает среднее число легочных метастазов на приблизительно 80%. Цикапрост-клатрат в трех испытанных дозах не увеличивает значительно рост первичной опухоли.

Пример 4.

Опухоль легкого
Легочная карцинома Льюиса мыши/Цикапрост-клатрат
Легочная карцинома Льюиса у мыши C57BL/6 является обычно используемой метастазной моделью, метастазирующей в легкое. Цикапрост изучают при дозах 0,3; 0,3 и 1,0 мг/кг перорально ежедневно, начиная со дня подкожной имплантации опухолей и до окончания испытаний. В этой модели цикапрост-клатрат вызывает значительное торможение легочных метастазов на 50% по сравнению с контролем при дозе 1,0 мг/кг. Рост первичной опухоли не изменяется при даче цикапрост-клатрата. Не наблюдается каких-либо отчетливо видимых метастазов в иных органах, нежели легкие, в контрольной группе и в подопытной группе.

Пример 5.

Меланома
Меланома В16а у мыши C57bL - 6/цикапрост-/клатрат
При меланоме В16а опухолевые клетки имплантируют внутрикожно и первичные опухоли удаляют на 10-й день. Терапия с применением цикапрост-клатрата (1,0 мг/кг), начатая на 25-й день и продолжавшаяся до 60-го дня (т.е. окончания эксперимента), значительно уменьшает количество легочных метастазов.

Пример 6.

Лимфома
Ретикулярная саркома М5076/цикапрост-клатрат
Клетки опухоли М5076 из асцита животных, имеющих опухоль, и 5•10⁴ клеток подкожно имплантируют в самку мыши С57В1/6, и регулярно замеряют рост первичной опухоли. Через 24 дня после имплантации опухоли животных умерщвляют и удаляют печень, селезенку и яичники, взвешивают и фиксируют в растворе Боуэна. В качестве параметра для антиметастатического эффекта определяют число метастатических очагов в печени. Лечение цикапрост-клатратом начинают за 2 ч до имплантации опухоли. В то время как цикапрост в изученных пределах доз (0,1 - 1,0 мг/кг подкожно ежедневно) не оказывает влияния на рост первичной опухоли, число печеночных метастазов уменьшается в зависимости от дозы. Наиболее эффективной дозой является доза 1,0 мг/кг, которая уменьшает образование метастазов до менее чем 10% от контроля.

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, и касается лечения метастазов опухолей. Для избирательного антиметастатического действия предлагается использовать эпталопрост или цикапрост. Предпочтительным является использование клатратов этих простагландинов. 2 з.п.ф-лы, 1 табл., 5 ил.

1. Способ лечения метастазов опухоли, включающий введение простагландина после индуцирования опухоли, отличающийся тем, что вводят эпталопрост или цикапрост в эффективной для этого дозе. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что вводят эпиталопрост-клатрат. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что вводят цикапрост-клатрат.