СРЕДСТВО ДЛЯ ЗАМЕДЛЕНИЯ АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ Российский патент 1997 года по МПК A61K31/605 A61K31/605 A61K31/557 

Изобретение относится к средству для замедления агрегации тромбоцитов, служащему для торможения функции тромбоцитов и для лечения тромбоза, содержащего карбациклиновые производные -цикапрост или эпталопрост и ацетилсалициловую кислоту (в дальнейшем ASS).

При артериальном, и с некоторыми ограничениями также и при венозном тромбогенезе активизация тромбоцитов с последующей агрегацией играет ведущую роль. Такая активация тромбоцитов вызывается посредством стимулов, которые могут иметь место при повреждении стенок сосудов и активности свертывания, как, например, в результате тромбина, коллагена, аденозиндифосфата, адреналина или в результате фактора, активирующего тромбоциты (PAF). Эти стимулы, наряду с агрегацией, одновременно вызывают выделение веществ из тромбоцитов, которые накоплены в так называемых гранулах тромбоцитов. Некоторые из этих веществ, как, например, активатор плазминогена ингибитор-1 (PA1-1), или фактор роста тромбоцит-производных имеют, вероятно, особое значение для патогенеза тромботических (атеросклеротических) заболеваний.

Так, PA1-1 это потенциальный ингибитор активаторов плазминогена, как урокиназа и, благодаря этим свойствам, t-PA тормозит фибринолиз, необходимый для восстановления кровообращения после тромботической закупорки PDgF -это митоген, стимулирующий профилерацию различных типов клеток (особенно, клетки гладких мускул). На основе этого механизма PDgF приписывается ключевая роль в атерогенезе. Торможение не только скопления тромбоцитов, но также и выделение патогенных веществ, таких как PA1, и поэтому PDgF могло бы внести существенный вклад для профилактики тромбоэмболитических и атеросклеротических заболеваний.

Ацетилсалициловая кислота, известная как замедлитель скопления тромбоцитов, это лишь слабый замедлитель для функции тромбоцитов, а также лишь слабое противотромботическое средство. Как замедлитель циклооксигенеза, ацетилсалициловая кислота ингибирует лишь путь активации тромбоцитов, образование тромбоксана. Дополнительно посредством ацетилсалициловой кислоты в эндотелии сосудов ингибируется образование простациклина, естественного замедлителя тромбоцитов. Поэтому терапевтическое действие ацетилсалициловой кислоты для лечения многих тромбоэмболитических форм болезни является недостаточным.

Миметики природного простациклина, такие как названные карбациклин-производные, с недавних пор имеются в распоряжении для клинического применения в оральной форме. Они считаются замедлителями всех основных путей активации тромбоцитов и сильными ингибиторами и противотромботическими средствами. Дополнительно они обладают еще другими свойствами, так, например, способностью к релаксации гладкой мускулатуры сосудов, которые поддерживают их терапевтическое действие при определенных формах заболеваний. При более высоких дозировках на передний план выступает профиль побочного действия, характерный для класса веществ карбациклинов, в результате чего лимитируется применяемая максимальная дозировка и ограничивается полное клиническое использование замедляющего действия функции тромбоцитов и противотромботическое действие.

Теперь неожиданным образом было найдено, что средство для замедления агрегации тромбоцитов, включающее цикапрост и ацетилсалициловую кислоту и эпталопрост и ацетилсалициловую кислоту в различных биологических системах оказывает синергистическое действие или обнаруживает совместные эффекты отдельных биологически активных веществ.

Обе комбинации превосходят, например, противотромботическое действие ацетилсалициловой кислоты и позволяют значительное сокращение дозы для доли карбациклина, способствующего замедлению тромбоцитов, по сравнению с эквипотентной дозировкой отдельно используемого карбациклина (цикапрост, эпталопрост), на коэффициент до 10.

Таким образом, эти комбинации являются более сильными замедлителями тромбоцитов и более сильными противотромботическими средствами, чем ацетилсалициловая кислота с более высокой специфичностью и терапевтическим эффектом по сравнению с цикапростом (эпталопростом) благодаря совместным усилениям их тромбоцитарных действующих компонентов. Благодаря желудочно-протективным свойствам карбациклинов снижаются нежелательные желудочно-кишечные побочные действия, вызванные ацетилсалициловой кислотой.

Изобретение относится, следовательно, к средству для замедления агрегации тромбоцитов из ацетилсалициловой кислоты и цикапроста или эпталопроста, причем карбациклины можно применять также в форме их солей присоединения с физиологически переносимыми основаниями или их клатратов с циклодекстринами, к лекарственному средству с обычными вспомогательными веществами или веществами-носителями для торможения функции тромбоцитов и для лечения тромбоза.

Цикапрост это (5Е)-(16S)-16,20-диметил -3-окса-13,14,18,18,19,19-гексадегидро-6-α-карба-простагландин 1₂.

Эпталопрост [(5E)-(16S)-13,14-дидегидро -1a,1б-дигомо-16,20-диметил-3-окса-18,18,19,19 -тетрадегидро-6а-карбапростагландин-1₂] и его b-циклодекстринклатрат можно получать по следующей методике.

В смесь из 6,9 г 2-[(E)-(1S,5S,6R,7R) -7-(диметил-трет.-бутилсилилокси)-6-[(3S, 4S) -3-(диметил-трет.бутилсилилокси)-4-метил-нона -1,6-диинил]-бицикло[3.3.0]октан-3-илиден] этан-1-ола (W. Skuballa, E. Schillinger, C.-S. Stuzzebecher, H. Vorbruggen, J. Medicinal Chemistry 29, 313 (1986), описанного здесь как соединение 15а), и 11,5 г триметил-орто -4-бромбутирата добавляют 17,2 мл 50%-ного натрового щелока и 337 мг гидросульфата тетрабутиламмония и перемешивают 16 ч при 22^oC в атмосфере аргона. Затем разбавляют при охлаждении ледяной водой 20 мл воды и подкисляют при помощи 10%-ного раствора лимонной кислоты до pH 5. Экстрагируют 3 раза по 300 мл простым эфиром, промывают органическую фазу один раз 200 мл рассола, сушат на сульфате магния и выпаривают в вакууме. После хроматографии остатка на силикагеле с гексаном/простым эфиром (8:2) получают 7,6 г (5Е)-(16S)-13,14-дидегидро-1а, 1б -дигомо-16,20-диметил-3-окса-18,18,19,19-тетра -дегидро-6а-карбапростагландин-1₂-сложный метиловый эфир-11,15-бис-(диметил-трет.-бутиловый эфир) как бесцветное масло.

1R (CHCl₃): 2953, 2925, 2859, 2230, 1730, 1250, 838 см^-1.

Для расщепления силилового эфира перемешивают 7,25 г вышеописанного бис-силилового эфира 48 ч при 24^oC с 600 мл смеси из уксусной кислоты/воды/тетрагидрофурана (65+35+10). Затем выпаривают в вакууме и хроматографируют остаток на силикагеле. С помощью смеси уксусный эфир/гексан (3+2) получают 3,9 г (5E)-(16S)-13,14-дидегидро -1a,1б-дигомо-16,20-диметил-3-окса-18,18,19,19 -тетрагидро-6а-карбапростагландин-1₂ -метиловый эфир как бесцветное масло.

1R (CHCl₃): 3400 (широкий), 2935, 2865, 2230, 1735 см^-1.

Для омыления перемешивают раствор из 3,66 г полученного выше сложного метилового эфира в 35 мл метанола с 35 мл 0,5-молярного натрового щелока 30 мин при 24^oC в атмосфере аргона. Затем разбавляют 20 мл воды, подкисляют при помощи 20%-ного раствора лимонной кислоты до pH 2, экстрагируют четыре раза по 100 мл хлористым метиленом, промывают органическую фазу один раз 50 мл рассола, сушат на сульфате натрия и выпаривают в вакууме. Остаток хроматографируют с уксусным эфиром на силикагеле. При этом получают 3,4 г заглавного соединения, как бесцветное масло.

1R (CHCl₃): 3400 (широкий), 2962, 2940, 2865, 2230, 1722 см^-1.

b-циклодекстринклатрат (5E)-(16S)-13,14 -дидегидро-1a,1б-дигомо-16,20-диметил-3-окса -18,18,19,19-тетрагидро-6а-карба-простагландин-1₂.

Растворяют 41,75 г b-циклодекстрина в 298 мл воды при 80^oC и закапывают раствор 1,5 г (5E)-(16S)-13,14-дидегидро-1a,1б-дигомо-16,20 -диметил-3-окса-18,18,19,19-тетрагидро-6а-карба-простагландин-1₂ в 24 мл этанола в течение 15 мин. Перемешивают 4 ч при 60^oC и затем охлаждают в течение ночи при перемешивании. Осажденное твердое вещество отсасывают, промывают 50 мл смеси из воды-этанола (1:1) и сушат 24 ч при 0,1 торр и при 25^oC при помощи пятиокиси фосфора. Получают 38 г свободно текущих кристаллов b-циклодекстрин-клатрата вышеприведенного аналога карбациклина. Содержание карбациклина в клатрате определяют титрованием, и оно составляет 3,3%
Цикапрост и его b-циклодекстринклатрат можно получать в соответствии с описанными в европейском патенте 119949 и в международной неакцептованной заявке WO 87/05294 способами.

Для солеобразования пригодны неорганические и органические основания, которые известны специалисту для образования физиологически переносимых солей. В качестве примеров следует назвать гидроокиси щелочных металлов, как гидроокись натрия и гидроокись калия, гидроокиси щелочно-земельных металлов, как гидроокись кальция, аммиак, амины, как этаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин, N-метилглюкамин, морфолин, трис-(гидроксиметил)-метиламин и т.д. Предпочтительным циклодекстрином для образования клатрата является b-циклодекстрин.

Ацетилсалициловая кислота и названные карбациклины вводят в количествах, находящихся ниже количеств, применяемых обычно для отдельных веществ. Количество, применяемое согласно данному изобретению, зависит от объема тромбоза.

Предложенное согласно изобретению средство, назначают преимущественно орально. Ацетилсалициловая кислота и карбациклин находятся в весовом отношении друг к другу как 1:5-10^-6 до 1:1, причем единица дозировки карбациклина составляет 1-1000 Mg (микрограмм), а единица дозировки ацетилсалициловой кислоты составляет 1-500 мг.

Пример 1. Человеческую, богатую тромбоцитами плазму (PRP) инкубируют в аграгометре при 37^oC и для вызывания агрегации разбавляют 3 NG/мл коллагена. Цикапрост и ASS, а также комбинации обоих веществ прикапывают пипеткой в течение 1 мин перед добавлением активатора коллагена в композицию. Кривая скопления регистрируется в агрегометре. Спустя 10 мин после добавления коллагена пробы центрифугируют при 3000 об/мин, а надосадочную жидкость проверяют посредством энзимсвязующего иммуносорбентного анализа на ее содержание в плазминогенактиватор-ингибиторе-1 (PA1-1), а с помощью радиоиммунного анализа (P1A) на содержание фактора роста производных тромбоцидов.

Результаты
Отдельно неэффективные концентрации 10^-10 или 10^-9 цикапроста в сочетании с также слабо эффективными или неэффективными концентрациями 3•10^-5, 10^-4 и 3•10^-4 MASS приводят к торможению скопления тромбоцитов порядка 42, 71 и 91% (табл.1). Выбрасывание PA1-1 при одинаковых концентрациях ингибитора замедляется до 36, 54 и 64% высвобождение pDgE замедляется до 24, 42 и 55% Действие цикапрост/A-комбинаций в соответствии с определением М. Беренбаум'а (Chin. eup. Immunol 28:1-18, 1977) является синергистическим.

Замедление агрегации, а также PA1-1 и PDgF.

В табл.1 представлены результаты освобождения стимулируемых посредством конагена тромбоцитов в контрольной реакции (N 6).

Пример 2. На наркотизированных морских свинках с помощью инъекции поллагена (40 г/кг i.v.) получают обратимые тромбоцитопении. Причина этих тромбоцитопений это образование скопления стимулированных коллагеном кровяных тромбоцитов и эмболизация этих скоплений тромбоцитов в легкое, где они затем останавливаются и таким образом вызывают наблюдаемые спады числа тромбоцитов в крови (тромбоцитопении). Постоянные в условиях контроля тромбоцитопении (в среднем 40% снижений числа тромбоцитов от соответствующего основного уровня) служат мерой внутрисосудистого скопления тромбоцитов.

Результаты представлены в табл.2.

Лишь неэффективная доза 1 нг/кг/мин. i.v. цикапроста в сочетании со слабо замедляющей дозой 0,5 мг/кг i.v. ASS приводит к торможению тромбоцитопении 34% заметна против контроля, и соответствующая разовая доза обоих биологически активных веществ (табл.2). Этот эффект достигается обычно только лишь в результате дозировки, превышающей трехкратную дозу цикапроста.

В табл.2 замедление индуцированной коллагеном тромбоцитопении на морских свинках (средние величины ± SEM).

Пример 3. На наркотизированных морских свинках предварительно устанавливают брыжечную петлю и поддерживают при соблюдении температурного режима посредством раствора поваренной соли. При ультрамикроскопическом контроле стенка сосуда брыжечной артериолы (020-50 м) повреждается серией электрических импульсов. В результате последующего нокального применения увеличивающихся концентраций ADP (аденосиндифосфатного) раствора определяется тромбогенная ADP-концентрация, при которой образуется закупоривающийся белый тромб на предварительно поврежденном месте артериолы. Эта тромбогенная ADP-концентрация производит специфический для сосуда и воспроизводимый тромб в соответствующей артериоле.

Результаты представлены в табл.3.

ASS 10 мг-кг (внутривенно) не изменяет тромбогенную ADP-концентрацию (табл.3). Цикапрост в количестве 10 нг/кг/мин внутривенно также не оказывает заметного воздействия в этой дозировке. Комбинация таких не эффективных на этой модели тромбоза доз цикапроста и ASS приводит к заметному повышению тромбогенной ADP-концентрации на 1,27 + 0,54 1 cg M/ 30,9-кратная исходная концентрация. Такое противотромботическое действие комбинации не может быть достигнуто лишь посредством одной ASS и в результате применения разовой дозы одного цикапроста и только лишь 10-кратная дозировка (100 нг/кг/мин) внутривенно дает повышение на 1,32 ± 0,2 1 cg M A P 5.

Действие цикапроста, ASS и комбинации цикапроста + ASS на развитие закупоривающих белых тромбов на предварительно поврежденных брыжеечных артериолах морской свинки (средняя величина + S EM/) показано в табл.3.

Действия цикапроста, ASS и комбинации цикапрост + ASS на образование тромба в сонных артериях морской свинки, предварительно поврежденных давлением + холодом (половина и четверть содержания гемоглобина (Hb) в тромбе/) представлена в табл.4.

Пример 4. На наркотизированных морских свинках тщательно препарируется кусок наружной левой сонной артерии длиной 2 см и натягивается на небольшую металлическую пластинку. После этого стенка сосуда по длине 1 см на три минуты отягощается тяжелым, весом 200 г, стальным штемпелем, охлажденным до -15^oC. Таким образом, это ведет к массивному локальному повреждению стенки сосуда на большой артерии и к развитию красного тромба на поврежденном месте. Через 3 ч после повреждения этот поврежденный сегмент и одинаковый по длине кусок контралатеральной артерии извлекают, промывают и помещают в гемоглобина-тест-реагент. Через 24 ч определяют содержание гемоглобина в обоих сегментах. Из разности этих содержаний гемоглобина рассчитывают затем нетто-содержание гемоглобина в красном тромбе в качестве величины размера тромба.

ASS 5 мг/кг i.v. не оказывает значимого влияния на образование тромба в сонной артерии морской свинки (табл.4). Цикапрост также не в значительной эффективной дозировке 0,3 нг/кг/мин внутривенно приводит в сочетании с ASS к заметному противотромботическому действию; содержание гемоглобина в тромбе сокращается на 85% по сравнению с контролем 8,6 моль (в среднем) на 1,3 мк/моль.

Использование: в медицине, для замедления агрегации тромбоцитов. Сущность изобретения: средство для замедления агрегации тромбоцитов включает ацетилсалициловую кислоту и карбациклиновое производное простагландина - эпталопрост /(5E)-(16S)-13,14-дидегидро-1a,1b-дигомо-16,20-диметил-3-окса-18,18,19,19-тетрагидро-6а-карбапростагландин-1₂/ или цикапрост /(5Е)-(16S)-16,20-диметил-3-окса-13,14,18,18,19,19-гексадегидро-6а-карбапростагландин-1₂/, при массовом соотношении ацетилсалициловой кислоты и указанного карбациклинового производного от 1:5•10^-6 до 1:1. 3 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Средство для замедления агрегации тромбоцитов, включающее ацетилсалициловую кислоту и аналог простагландина, отличающееся тем, что в качестве аналога простагландина оно содержит карбациклиновое производное - (5Е)-(16S)-13,14 дидегидро-1а, 16-дигомо-16,20- диметил-3-окса-18,18,19,19 тетрадегидро-6а- карбапростагландин-1₂ или (5Е)-(16S)-16,20- диметил-3-окса-13,14,18,18,19,19-гексадегидро-6а-карбапростагландин-1₂ при массовом соотношении ацетилсалициловой кислоты и указанного карбациклинового производного от 1 5 • 10^- 6 до 1 1. 2. Средство по п.1, отличающееся тем, что ацетилсалициловая кислота и карбациклиновое производное представлены в раздельных дозиметрических единицах. 3. Средство по п.1, отличающееся тем, что ацетилсалициловая кислота и карбациклиновое производное представлены в одной дозиметрической единице. 4. Средство по п.2 или 3, отличающееся тем, что оно содержит дозиметрическую единицу карбациклинового производного в количестве 1 1000 мкг и дозиметрическую едицицу ацетилсалициловой кислоты в количестве 1 500 мг.