СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВОГО ПРОДУКТА ИЗ КРАХМАЛ И ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩЕГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/16 

Изобретение относится к микробиологической и комбикормовой промышленности и касается получения белковой биомассы на основе некондиционного зерносырья и отходов переработки растительного сырья, которая может быть использована в качестве кормовой добавки в рационе с/х животных и птицы.

Различные виды растительного сырья содержат 30-80% крахмала, 3-20% белка, 3-25% клетчатки. При этом низкое содержание незаменимых аминокислот, витаминов обуславливают малую эффективность их прямого скармливания животным.

Одним из способов повышения качества растительных кормовых добавок является обогащение растительного сырья белком микроорганизмов.

Известны способы получения белковой биомассы из крахмалсодержащего сырья, предусматривающие его ферментативный гидролиз с последующим культивированием дрожжей на прогидролизованном сырье с добавлением минеральных компонентов (Патент Франции 2285080, патент РФ по заявке 93053290/13. Решение о выдаче 07.94) или кислотный гидролиз с последующим культивированием дрожжей или бактерий на питательной среде, содержащей в качестве основного источника углерода прогидролизованное зерносырье, а в качестве дополнительного очищенные жидкие H-парафины, а также необходимые минеральные соли (авт. св. СССР 958501).

Недостатком первых двух способов является использование дорогостоящих ферментов в значительном количестве, кроме того, отсутствие термической обработки сырья перед процессом культивирования вызывает неконтролируемый рост бактериальной микрофлоры, что хотя и приводит к увеличению белка в получаемом продукте, но снижает его качество за счет продуктов метаболизма некоторых видов бактерий.

Недостатком третьего способа является применение глубокого кислотного гидролиза (pH 0,1 1,0), что требует специального кислотоупорного оборудования. Использование же в качестве дополнительного источника углерода жидких н-парафинов удорожает процесс культивирования не только из-за дороговизны самих парафинов, но и из-за дополнительны энергозатрат на их потребление микроорганизмами.

Наиболее близким по технической сущности к заявленному способу является способ получения кормовой добавки (авт.св. 1507787), в котором осуществляется процесс поверхностного культивирования дрожжеподобного гриба Endomycopsis fibuligera C-4 на твердой питательной среде, состоящей из 42-45% пшеничных отрубей и 52-55% отходов растительного происхождения (виноградные, плодоовощные выжимки, отходы крахмального производства и т.д.). Питательную твердую среду увлажняют до 52-54% раствором мочевины с таким расчетом, чтобы концентрация составляла 3,0-3,5% Раствор мочевины затем нейтрализуют фосфорной кислотой с таким расчетом, чтобы pH питательной среды после увлажнения и стерилизации был в интервале 4,8-5,0.

Твердофазную ферментацию ведут при температуре 30-35^oC, влажности воздуха 98-100% при аэрации. Продолжительность процесса ферментации 20-24 ч. Содержание сырого протеина в конце ферментации 28-40% при содержании белка в исходной питательной среде 9-21%
Недостатком предложенного способа является периодичность процесса ферментации и низкое содержание сырого протеина в конечном продукте.

Изобретение решает следующую научно-техническую задачу разработка биотехнологического способа переработки растительных отходов и некондиционного зерносырья в белковые кормовые продукты.

Технический результат предлагаемого способа непрерывного культивирования микроорганизмов заключается в увеличении выхода белкового продукта и содержания сырого протеина в нем.

Данный технический результат достигается тем, что в способе получения белкового продукта из крахмала и целлюлозосодержащего сырья, предусматривающем термореагентную обработку сырья с последующим культивированием микроорганизмов на питательной среде, содержащей растительное сырье в качестве источника углерода, источники макро- и микроэлементов, в условиях аэрации с последующей сушкой белкового продукта достигается тем, что согласно изобретению, в предварительно измельченное и разбавленное водой сырье добавляют биокатализатор в количестве 1,10-4 -1,10-7 г/кг сырья и проводят термореагентную обработку сырья в 2 этапа: сначала при pH 4,5-6,0 и температуре 50-60^oC в течение 15-30 мин, затем при pH 2,5-4,0 и температуре 80-90^oC в течение 30-45 мин, после чего подготовленный субстрат подают на непрерывную ферментацию микроорганизмов.

В качестве продуцентов белка используют штаммы дрожжей Endomycopsis fib ВКПМ У 2173 или гриба Aspergillus niger ВКПМ F710. В качестве биокатализаторов используют N-трис-2-гидроксиэтиламмониевую соль 2-хлорфеноксиуксусной кислоты или N-трис-2-гидроксиэтиламмониевую соль 4-хлорфенилтиоуксусной кислоты.

Сущность способа получения белкового продукта из крахмал- и целлюлозосодержащего сырья заключается в непрерывном культивировании микроорганизмов (дрожжи Endomycopsis fibuligera BKПМ Y-2173 или гриб Aspergillus niger BK M F-710), обладающих достаточно высокой амилолитической и целлюлолитической активностью, в ферментере при непрерывном перемешивании и аэрации на питательной среде, содержащей источник углерода -предобработанные отходы мукомольного, крахмального производств, плодоовощные отжимки и т.д. в количестве 4-8% (на ACB), источники минерального питания в количестве, г/л: калий фосфорнокислый однозамещенный 0,5-1,0; аммоний сернокислый 1,0-1,5; железо сернокислое, семиводное 0,05-0,07; магний сернокислый, семиводный 0,3-0,5; цинк сернокислый семиводный 0,01-0,02; марганец сернокислый, пятиводный 0,003-0,005.

Оптимальная скорость протока составляет 0,08-0,12 ч, температура культивирования 30-34^oC pH 5,0-5,5 (поддерживается титрованием 6-12%-ным раствором гидроокиси аммония), аэрация 0,5-1,0 м³/м³/ч.

В качестве засевного материала используют суточные культуры дрожжей Endomycopsis fibuligera ВКПМ Y 2173 или гриба Aspergillus nigev ВКПМ F-710, выращенные в качалочных колбах на питательной среде следующего состава, г/л: меласса 50,0; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,8; аммоний сернокислый 1,5.

Засевной материал вносят в ферменте в количестве 3-7 об.

Подготовку субстрата, включающую реагентную и термическую обработки, проводят в зависимости от используемого субстрата, таким образом, чтобы в жидкую фазу перешло 25-45% редуцирующих веществ (РВ) субстрата, необходимых для начала роста микроорганизмов. Для этого растительное сырье измельчают, смешивают с водой с соотношением от 1:1 до 1:7, затем проводят термореагентную обработку при постоянном перемешивании в 2 этапа, сначала при температуре 50-60^oC и pH 4,5-6,0 в присутствии биокатализатора N-трис-2-гидроксилэтил аммониевой соли 2-хлорфеноксиуксусной кислоты (авт.св. СССР 1469853) или ее аналога N-трис-2-гидроксиэтил аммониевой соли 4-хлорфенилтиоуксусной кислоты (авт.св. СССР 1641021) в количестве 1•10^-4 1•10^-7 г/кг субстрата, в течение 15-20 мин, обеспечивая оптимум действия собственных α и β - амилаз субстрата.

При проведении первого этапа предобработки сырья при температуре ниже 50^oC происходит уменьшение степени расщепления крахмала из-за недостаточной активности a и β амилаз. Аналогично происходит снижение активности собственных a и β амилаз субстрата при pH ниже 4,5 и выше 6,0.

Снижение времени обработки субстрата ниже 15 мин резко уменьшает переход РВ-субстрата в жидкую фазу, увеличение же времени обработки свыше 30 мин практически не влияет на изменение концентрации свободных РВ, однако увеличивает энергозатраты.

Уменьшение концентрации биокатализатора ниже 1•10^-7 г/кг субстрата не обеспечивает необходимого уровня концентрации свободных РВ в жидкой фазе на первом этапе, а увеличение концентрации биокатализатора свыше 1•10^-4 г/кг субстрата хотя и приводит к некоторому увеличению концентрации свободных РВ в жидкой фазе, но не оправдывается экономически из-за перерасхода биокатализатора.

Второй этап термореагентной обработки субстрата обеспечивает частичный гидролиз гемицеллюлоз субстрата, а также снижает бактериальную обсемененность субстрата.

При термообработке субстрата при pH ниже 2,5 происходит разрушение некоторых водорастворимых витаминов, а также дегидратация полисахаридов с образованием фурфурола, что отрицательно сказывается на последующей ферментации. При термообработке субстрата при pH выше 4,0 заметно снижается гидролиз гемицеллюлоз. Температура ниже 80^oC не обеспечивает необходимую степень гидролиза гемицеллюлоз, а выше 90^oC лишь незначительно увеличивает гидролиз, что не оправдывается экономически из-за возрастающих энергозатрат.

Время термообработки ниже 30 мин значительно уменьшает степень гидролиза полисахаридов субстрата, а свыше 45 мин практически не влияет на контролируемые еще параметры.

Применяемые в качестве биокатализаторов N-трис-2-гидроксиэтилламмониевая соль 2-хлорфеноксиуксусной кислоты или ее аналог-N-трис-2 гидроксиэтиламмониевая соль 4-хлорфенилтиоуксусной кислоты известны ранее, как стимуляторы роста микроорганизмов (авт.св. СССР 1469853,1641021). В предлагаемом способе эти соединения ускоряют процесс выхода РВ-субстрата в жидкую фазу. Ранее в подобных способах эти соединения не применялись.

В качестве продуцентов белка используют штамм дрожжей Endomycopsis fib ВКПМ У 2173 или гриба Aspergillus niger ВКПМ F 710. Endomycopsis fibuligera выделен из сельскохозяйственных отходов селекционным путем. Штамм образует круглые с ровным краем колонии размером 4-10 мм, выпуклого профиля с ворсистой поверхностью, светло-коричневого цвета, структура однородная, консистенция плотная. Клетки овальные (4-6)x(6-12) мкм, образует септированный мицелий, аскоспоры, штамм не витаминно-зависимый. Сбраживает глюкозу, мальтозу, ассимилирует углеродные компоненты, глюкозу, растворимый крахмал, арабинозу. Обладает способностью активно утилизировать углероды в высоких концентрациях. Содержание сырого протеина 55-57% Непатогенен, депонирован в ВКПМ за номером Y2173. Aspergillus niger получен селекционным путем под воздействием мутагенного фактора (нитрозометилмочевины). Тело гриба состоит из бесцветных, сильно разветвленных и переплетенных между собой тонких нитей-гиф, образующих мицелий. Диаметр гиф от 3 до 6 мкм. Метаболизм строго дыхательный. Штамм хорошо растет на обычных лабораторных средах, содержащих углеводы. Усваивает глюкозу, сахарозу, лактозу, мальтозу, галактозу и т.д.

Штамм может активно утилизировать углеводы в высоких концентрациях. Возможно длительное выращивание без стимулирующих рост добавок. Штамм непатогенен, депонирован в ВКПМ за номером F710.

Пример 1. Сырой протертый картофель смешивают с водой в соотношении 1:1. Проводят термореагентную обработку в 2 этапа: сначала при pH 6,0 температуре 60^oC в присутствии биокатализатора N-трис-2 гидроксиэтиламмониевой соли 2-хлорфеноксиуксусной кислоты в концентрации 10^-5 кг ACB субстрата в течение 15 мин при постоянном перемешивании, затем pH доводят с помощью серной кислоты до значения 4,0, нагревают до температуры 80^oC и выдерживают при этой температуре в течение 45 мин. После этого субстрат подают в ферментер, где разбавляют водой с необходимыми минеральными элементами до концентрации 4% (на ACB).

Выращивание дрожжей Endomycopsis fib Y2173, взятых в количестве 5 об. ведут при pH 5,0-5,5, температуре 30-32^oC, скорости разбавления среды 0,10 ч^-1 и аэрации 0,5 м³/м³/ч. Содержание сырого протеина в готовом продукте 46% Выход белкового продукта от субстрата 68%
Пример 2. Банановую кожуру, пропущенную через мясорубку,смешивают с водой в соотношении 1:3. Проводят термообработку в 2 этапа: сначала при pH 5,0 и температуре 55^oC в присутствии биокатализатора - N-трис-2-гидроксиэтиламмониевой соли 2-хлорфеноксиуксусной кислоты в концентрации 1•10^-7 г/кг субстрата в течение 30 мин, затем при pH 2,5 и температуре 90^oC в течение 30 мин при постоянном перемешивании. После этого субстрат подают в ферментер, где разбавляют водой с необходимыми минеральными элементами до концентрации субстрата 8% (на ACB).

В качестве засевного материала используют суточную культуру Aspergillus niger ВКПМ F710 в количестве 7 об. Выращивание ведут при температуре 32-34^oC, pH 5,2-5,5, аэрации 1,0 м³/м³ч, скорости разбавления среды 0,08 ч^-1. Содержание сырого протеина в готовом продукте 30% выход которого продукта 75% от субстрата.

Пример 3. Ржаные отруби смешивают с водой в соотношении 1:7. Проводят термореагентную обработку сначала при pH 4,5 и температуре 50^oC в присутствии биокатализатора N-трис-2-гидроксиэтиламмониевой соли 4-хлорфенилтиоуксусной кислоты в количестве 1•10^-4 г/кг субстрата в течение 20 мин, затем при pH 3,0 и температуре 90^oC в течение 35 мин при постоянном перемешивании. После этого субстрат подают в ферментер, где разбавляют его водой с необходимыми микроэлементами до концентрации 7% (на ACB). Далее, как в примере 1, но аэрация 0,8 м³/м³/ч, скорость разбавления среды 0,10 ч^-1. Выход готового продукта составляет 70% от субстрата. Сырой протеин 41%
Пример 4. Ржаную муку смешивают с водой в соотношении 1:6. Термореагентную обработку проводят сначала при pH 4,8 и температуре 50^oC в присутствии биокатализатора N-трис-2-гидроксиэтиламмониевой соли 4-хлорфенилтиоуксусной кислоты в количестве 1•10^-7 г/кг субстрата в течение 25 мин, затем при pH 3,5 и температуре 85^oC в течение 40 мин при постоянном перемешивании. После этого субстрат подают в ферментер, где разбавляют водой с минеральными элементами до концентрации 6% (на ACB). Далее как в примере 1, но скорость разбавления среды 0,12 ч^-1, аэрация 1,0 м³/м³/ч. Выход готового продукта 68% от субстрата. Содержание сырого протеина 45%
Пример 5. Ржаную муку смешивают с пшеничными отрубями в соотношении 1:1. Эту смесь разваляют водой в соотношении 1:7. Проводят термореагентную обработку сначала при pH 4,9 и температуре 51^oC в присутствии биокатализатора N-трис-2-гидроксиэтиламмониевой соли 4-хлорфенилтиоуксусной кислоты в количестве 1•10^-6 г/кг субстрата в течение 15 мин, затем при pH 3,0 и температуре 80^oC в течение 45 мин. Далее, как в примере 4. Выход готового продукта 70% от субстрата. Содержание сырого протеина 38%
Таким образом, использование предложенного способа позволяет значительно повысить выход, улучшить качество получаемого продукта, сократить время выращивания микроорганизмов за счет подбора оптимальных параметров непрерывного культивирования.

Использование: в микробиологической и комбикормовой промышленности. Сущность изобретения: растительное сырье измельчают, разбавляют водой, проводят термореагентную обработку сырья в два этапа в присутствии биокатализатора: сначала при pH 4,5 - 6,0 и температуре 50 - 60^oC в течение 15-30 мин, затем при pH 2,5-4,0 и температуре 80-90^oC в течение 30-45 мин. Обработанное растительное сырье смешивают с необходимыми минеральными элементами и на полученной питательной среде культивируют микроорганизмы. 2 з.п. ф-лы.

1. Способ получения белкового продукта из крахмал- и целлюлозосодержащего растительного сырья, предусматривающий термореагентную обработку сырья с последующим культивированием микроорганизмов на питательной среде, содержащей растительное сырье в качестве источника углерода, источники микро- и макроэлементов, в условиях аэрации и сушку белкового продукта, отличающийся тем, что перед термореагентной обработкой сырье измельчают и разбавляют водой, затем в него добавляют биокатализатор в количестве 1•10^- 4 - 1•10^- 7 г/кг сырья, термореагентную обработку проводят в два этапа: сначала при pH 4,5 6,0 и 50 60^oС в течение 15 30 мин, а затем при pH 2,5-4,0 и 80 90^oС в течение 30 45 мин, культивирование микроорганизмов ведут непрерывно. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве микроорганизмов используют штаммы дрожжей Endomycopsis fib ВКПМ Y 2173 или гриба Aspergillus niger ВКПМ F 710. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве биокатализатора используют N-трис-2-гидроксиэтиламмониевую соль 2-хлор-феноксиуксусной кислоты или N-трис-2-гидроксиэтиламмониевую соль 4-хлорфенилтиоуксусной кислоты.