ШТАММ ДРОЖЖЕЙ ENDOMYCOPSIS FIBULIGERA - ПРОДУЦЕНТ БЕЛКОВОЙ БИОМАССЫ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/16 C12P21/00 A23K1/00 C12N1/16 C12R1/645 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в гидролизно-дрожжевой и пищевой промышленности, а также в сельском хозяйстве и представляет новый промышленный непатогенный штамм дрожжей Endomycopsis fibuligera ВСБ-12 продуцент белковой биомассы, характеризующийся высокой продуктивностью при культивировании на углеводном, углеводородном и смеси этих субстратов.

Эффективность биотехнологического процесса в значительной степени определяется свойствами промышленного штамма-продуцента.

Известны штаммы дрожжей, используемые в качестве культур-продуцентов для производства кормовой биомассы на углеводсодержащем субстрате, в частности, мелассе (а.с. СССР NN 1620378; 1622389; 1643606; 1677057; 1595900; 1571061; 15232580; 1507788; пат. ГДР NN 124658; 275070). Недостаток этих штаммов заключается в том, что по систематическому положению они относятся к несовершенным дрожжеподобным условно патогенным микроорганизмам рода Condida. Это снижает их потребительскую ценность.

Известны штаммы несовершенного дрожжеподобного гриба рода Trichosporon, который также используют в качестве культур-продуцентов для получения протеина (а.с. СССР NN 632201; 606518; 803472; 1482941; пат. ГДР N 2788354).

Основным недостатком этих штаммов является низкая удельная скорость роста, а также морфологическая нестабильность культур.

Известны также штаммы, относящиеся к совершенным грибам, например, сахаромицеты, применяемые в производстве кормового протеина (а.с. СССР NN 1742320; 1677057; пат. Франции NN 2646435; 2646436, пат. США N 4379845). Недостатком этих штаммов является их невысокая удельная скорость роста, а также нестабильность работы в условиях непрерывного культивирования.

Наиболее близким аналогом предлагаемого штамма является штамм дрожжей Socchoromyces cerevisiae ВКПМ У-760 продуцент протеина и биологически активных веществ (а.с. СССР N 1575570 С 12 1/16). Штамм S.arevisiae ВКПМ У-760 выращивают при непрерывных условиях культивированя на углеводах (сахароза, либо меласса, либо гидролизат) при концентрации 8 г/л (в расчете на PB), при этом получают концентрацию биомассы в среде культивирования 3,9 г ACB/л. Продуктивность процесса при этом составляет 2,07-2,57 г ACB/м³час. Недостатком штамма S. cerevisiae ВКПМ-У-760 является его способность расти при невысоких концентрациях субстрата в среде, что не позволяет достигать высокой продуктивности процесса при достаточно высоком расходном коэффициенте (2,05 кг/кг).

В настоящее время актуальной проблемой является получение белковой биомассы из восстанавливаемого сырья растительного происхождения, каким является меласса и сельхозотходы, такие как навоз, отруби и т.д. с одновременной их утилизацией.

В связи с этим цель изобретения заключалась в селекции непатогенного мицелиального штамма дрожжей, активно растущего на мелассе, сельсхозотходах и на сельхозотходах с добавками углеводородов (С₈ C₂₂). Добавка углеводородов используется для обогащения субстрата углеродом, что позволит увеличить продуктивность процесса.

Технический результат заключается в увеличении производительности, повышении выхода биомассы от субстрата, увеличении содержания протеина, а также в экономической целесообразности, т. к. наряду с получением белковой биомассы решается задача утилизации сельхозотходов.

Предлагаемый новый штамм дрожжей получен методом непрерывного культивирования на сельскохозяйственных отходах с добавками углеводородов в камеральных условиях в лаборатории "Технологии промышленного биосинтеза" ГосНИИ синтезбелка. Для этого сельскохозяйственные отходы, содержащие 0,5-1,0% углеводородов, вносили в среду Ридер и выращивали в колбах на качалке. После пяти пассажей в новую питательную среду, культуральную жидкость рассеивали в чашки Петри с сусло-агаром и отбирали изолированные колонии (изоляторы), которые далее по отдельности (17 изолятов) проверяли на активность роста в колбах на качалке в жидкой минеральной питательной среде, где в качестве субстрата использовали сельхозотходы (РВ 2,0%) и углеводороды (0,5%). Активность изолятов определяли по концентрации биомассы, которая составила от 3,0-11,0 г/л. Из их числа было отобрано 3 наиболее активных изолятов дрожжей с активностью роста от 9-11 г/л.

Отобранные 3 изолята дрожжей были исследованы в условиях проточного культивирования в аэробных условиях с интенсивным массообменом на минеральной среде Ридер с сельхозотходами (PB 10%) и углеводородами (1,5%) при скорости протока 0,2-0,3 час^-1, что позволило получить искомый штамм, обозначенный в музейной коллекции института под номером ВСБ-12.

Определение систематического положения отобранного штамма ВСБ-12, проведенное в соответствии с определителем дрожжей Крегер-Ван-Рай (The yeast taxonomye sfady. Ed.by Kreger-van-Riy. N.Y.W. Amsferdam, 1984 г.) показало его принадлежность к Endomycopsis fibuligera.

Определение степени патогенности селекционированного штамма Endomycopsis fibuligera ВСБ-12 подтвердило отсутствие патогенности.

Характеристика штамма дрожжей Endomycopsis fibuligera ВСБ-12.

Культурально-морфологические признаки. Образуют круглые с ровным краем колонии размером 4-10 мм, выпуклого профиля с ворсистой поверхностью, светло-коричневого цвета, структура однородная, консистенция плотная. Штрих на солодовом сусле-агаре (3-суточная культура) ворсистый с слабоволнистым краем, светло-коричневого цвета.

Клетки трехсуточной культуры, выращенные на жидкой питательной среде: субстрат меласса, субстрат сельхозотходы, субстрат сельсхозотходы + углеводороды при рН 4,5-5,5, температура 30-40^oC, одиночные, овальные, короткоовальные, округлые, имеют септированный мицелий. Аскоспоры овальной формы. На жидкой питательной среде кольца и пленки не образуют, осадок плотный, светлый.

Физиолого-биохимические признаки. Штамм Endomycopsis fibuligera ВСБ-12 ассимилирует углеводные компоненты, глюкозу, растворимый крахмал, арабинозу, сбраживает глюкозу, мальтозу. Невитаминозависимый. Использует органический и неорганический азот. Растет при рН 3,5-6,5 (оптимум 4,5-5,5) и температуре 20-40^oC (оптимум 30-34^oC). Влияние стимуляторов на рост штамма не изучали.

Штаммы хранят на косяках в пробирке на сусло-агаре при температуре от 0 до +10^oC или в леофильно-высушенном состоянии.

Штамм Endomycopsis fibuligera ВСБ-12 был испытан в камеральных условиях в ферментере объемом 10 л на минеральной среде Ридер, в которой источником углерода служила меласса, сельскохозяйственный отходы, смесь сельхозотходов и углеводородов, рН среды составили 4,5-5,5, температура 30-34^oC.

Засевную биомассу готовили путем выращивания одно-двух-суточной культуры дрожжей в качалочных колбах с минеральной средой Ридер, в которой источником углерода служила 5%-ная меласса.

Для сравнительной оценки исследования были приведены со штаммами дрожжей: Saccharomyces arevisiae (прототип) и Candida afilis ВСБ 726.

Культивирование проводили в камеральных условиях в ферментере объемом 10 л с интенсивным массобменом (обороты мешалки 800 об/мин, расход воздуха 1 об/об. мин), рН среды 4,5-5,5 температура 30-34^oC, скорость протока 0,25 ч^-1.

Полученные результаты исследований представлены в табл. 1. Изобретение поясняется примерами реализации.

Пример 1. Штамм дрожжей Endomycopsis fibuligera ВСБ-12 культивировали в непрерывном режиме в ферментере объемом 10 л на минеральной среде следующего состава (г/л): (H₄)₂ O₄ 3,0; MoO₄ 0,7; aCl - 0,5; Ca(О₃)₂ 0,4; KH₂PO₄ 1,0; K₂HPO₄ 0,1. pH среды 4,5-5,5, температура 30-34^oC, субстрат меласса, содержание сухих веществ 83% сахарозы 51-52% Скорость протока составила 0,25 ч^-1. При концентрации мелассы к протоку 5% были получены следующие результаты: концентрация биомассы 29,6 г/л ACB; выход от субстрата 59,1% производительность 7,4 кг/м³ч; содержание сырого протеина 58% При тех же условиях было проведено непрерывное культивирование дрожжей Saccharomyces cerevisiae (прототип) и получены следующие результаты: концентрация биомассы 24,0 г/л ACB; выход от субстрата 48,0% производительность 6,0 кг/м³ч, содержание сырого протеина 52% Полученные данный показывают, что высокая концентрация субстрата ингибирует культуру дрожжей S.cerevisiae, что сказывается на выходе биомассы от субстрата и производительности процесса. Результаты культивирования дрожжей Candida ufilis ВСБ-726 представлены в табл. 1. Полученные результаты близки к показателям нового штамма Endomycopsis fibuligera ВСБ 12, однако следует учесть, что штамм C. ufilis условно патогенен.

Пример 2. Штамм дрожжей Endomycopsis fibuligera ВСБ-12 выращивали при тех же условиях, что и в примере 1, но субстратом служили сельхозотходы гидролизные ржаные отруби с содержанием РВ 1,1% Были получены следующие показатели: концентрация биомассы 13,2 г/л АСВ; выход от субстрата 120,2% производительность 3,3 кг/м³ч, содержание сырого протеина 54,2% При тех же условиях было проведено выращивание дрожжей S. cerevisiae и C.ufilis. Результаты представлены в табл. 1. Более высокие технологические показатели дрожжей E.fibuligera обусловлены амилазной активностью данного штамма и как следствие глубокой утилизацией субстрата.

Пример 3. Штамм дрожжей Endomycopsis fibuligera ВСБ-12 выращивали при тех же условиях, что в примере 1, но субстратом служила смесь сельхозотходов (ржаные отруби) и углеводороды (н-алканы) в концентрациях 0,8% РВ и 0,9% УГВ соответственно. Получены результаты: концентрация биомассы 18,7 г АСВ/л; выход от субстрата 110% производительность 4,7 кг/м³ч; содержание сырого протеина 59% При тех же условиях было проведено культивирование дрожжей S. cerevisiae (прототип). Получены результаты (табл. 1): концентрация биомассы 8,9 г АСВ/л; выход от субстрата 56,3% производительность 2,25% кг/м³; содержание сырого протеина 54% Как видно из представленных данных культура дрожжей S.cerevisiae практически не утилизирует углеводороды. Результаты выращивания дрожжей Candida ufilis представлены в табл. 1.

Пример 4. Штамм дрожжей Endomycopsis fibuligera ВСБ-12 выращивали в ферментере объемом 10 л, обороты мешалки 900 об/мин расход воздуха 1 об/об. мин, рН среды 4,5-5,0, температура 30-32^oC. В качестве субстрата служили свиноводческие навозные стоки с концентрацией сухих веществ 2% дополнением к минеральному питанию служил однозамещенный фосфорнокислый натрий в количестве 0,5% Посевным материалом служила двухсуточная культура в количестве 10% от объема среды. Были получены следующие результаты: снижение БПК 88% азота 90% Содержание сырого протеина в готовом продукте составило 47,9% Культуры дрожжей: Saccharomyces cerevisiae (прототип) и Candida ufilis ВСБ-726 в аналогичных условиях на данном субстрате не росли.

Таким образом, на основании проведенных исследований можно заключить, что предлагаемый штамм Endomycopsis fibuligera ВСБ-12 является новым углевод-углеводород ассимилирующим штаммом, характеризующимся следующими отличительными признаками от прототипа Saccharomyces cerevisiae ВКПМ-У-760:
активно растет на питательной среде с высокой концентрацией мелассы, обеспечивая производительность более 7 кг/м³ч и выход абсолютно сухой биомассы от субстрата более 59%
активно растет на питательной среде на смеси субстратов углеводы (сельхозотходы) и углеводороды (н-алканы), обеспечивая производительность процесса 4,7 кг/м³ч, выход от субстрата 110% и содержания сырого протеина 59%
активно растет на питательной среде с сельхозотходами, обеспечивая выход от субстрата (РВ) более 120;
активно растет на свиноводческих навозных стоках, обеспечивая снижение БПК на 88% азота на 90% при получении белковой биомассы с содержанием сырого протеина 47,9%
конкурентоспособен, обеспечивая высокое доминирование в биоценозе ферментеров в условиях нестерильного процесса культивирования.

На основании данных проведенных камеральных и опытных исследований штамм дрожжей Endomycopsis fibuligera ВСБ-12 рекомендован к промышленному внедрению при производстве белковой биомассы на сельхозотходах.

Использование: биотехнология, техническая микробиология. Сущность изобретения: новый промышленный непатогенный штамп дрожжей Endomycopsis fibuligera ВСБ-12 - продуцент белковой биомассы, деструктор сельхозотходов, характеризующийся высокой производительностью при культивировании на углеводном и углеводородном субстрате. Предлагаемый новый штамм дрожжей получен методом непрерывного культивирования на сельскохозяйственных отходах с добавками углеводородов. Штамм дрожжей Endomycopsis fibuligera ВСБ 12 испытан в камеральных условиях при культивировании в ферменте объемом 10 л, где в качестве субстрата служили: меласса - сельхозотходы (гидролизат ржаных отрубей); смесь сельхозотходов и углеводородов (н-алканы); свиные навозные стоки. Показано увеличение производительности, повышение выхода, увеличение сырого протеина. Кроме того, показана возможность активного роста на свиноводческих стоках с получением белковой биомассы при одновременной утилизации сельхозотходов. 1 табл.

Штамм дрожжей Endomycopsis fibuligera ВКПМ Y-2173 продуцент белковой биомассы.