АКВАХЕЛАТ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКВАХЕЛАТА, СПОСОБ МОДУЛИРОВАНИЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК, КУЛЬТУРЫ ТКАНИ, ОДНОКЛЕТОЧНОГО ОРГАНИЗМА ИЛИ МНОГОКЛЕТОЧНОГО ОРГАНИЗМА И ТРАНСПОРТНАЯ СИСТЕМА Российский патент 1998 года по МПК C07F19/00 C12N1/20 

Изобретение относится к использованию аквахелатов в качестве транспортных систем для эффективного переноса металлов и разнообразных органических лигандов через клеточные мембраны. Аквахелаты в данном изобретении являются сложными соединениями биогенного металла с одним или несколькими биологически активными лигандами и одной или несколькими координационными молекулами воды. После переноса через клеточную мембрану или стенку клетки в случае микроорганизмов аквахелаты в настоящем изобретении диссоциируются и выполняют определенную задачу внутри клеток, тканей, одноклеточных или многоклеточных организмов.

Известно применение хелатов при ферментации. Например, в советском патенте N 1838415 раскрывается метод получения биогаза с использованием ацетата никеля в сочетании с этилендиамином или ацетата никеля в сочетании с глицином. Хелаты применяются отдельно.

В авторском свидетельстве СССР N 1116058 раскрывается использование оксигенированного сложного соединения, содержащего один лиганд. Хелат используется как питательное вещество в процессе ферментации, а не как метаболический регулятор. Авторское свидетельство содержит предположение, что хелат оксигенированного кобальта может содержать лабильные молекулы воды. Однако это неверно, т. к. хелаты оксигенированного кобальта не могут образовывать координационные связи с молекулами воды.

В патенте США N 3865691, выданном Риджуэю, раскрывается использование одноклеточного белка, получаемого из этанола. Цитрат железа используется как питательный микроэлемент. Как показано в патенте, добавляется цитрат железа, т. к. он является очень эффективным питательным веществом для выращивания клеток дрожжей.

В российском патенте (N 583737) и патенте США N 3960536 предусматривается использование сложного соединения со смешанными лигандами. Концентрация металла в растворе составляет 5-10 г на литр. Такое сложное соединение используется для регуляции хлороза в растениях. Соединение не используется для регулирования метаболизма клеток по желаемым путям метаболизма и не пригодно для этой цели.

Как видно из вышеприведенного краткого описания других ссылочных материалов, в них не содержится утверждения или предположения о том, что аквахелаты в настоящем изобретении используются как транспортные системы для эффективного переноса биогенного металла и разнообразных органических лигандов на клеточные мембраны и что компоненты таких аквахелатов могут быть предназначены для совместного выполнения определенной задачи внутри клеток, тканей, одноклеточных или многоклеточных организмов.

Одним из преимуществ данного изобретения является использование аквахелатной транспортной системы для переноса металлов и органических лигандов через клеточные мембраны с поразительной эффективностью.

Другим преимуществом данного изобретения является использование аквахелатов внутри клеточных мембран, которые улучшают, усиливают или тормозят определенные метаболические процессы или оказывают влияние на физические свойства клеток, тканей и одноклеточных и многоклеточных организмов.

Еще одним преимуществом данного изобретения является то, что аквахелат используется для переноса полимеров нуклеиновой кислоты на клеточные мембраны.

Согласно примеру осуществления данного изобретения используется аквахелат, который включает биогенный металл и как минимум один органический лиганд. Во всех случаях лиганд содержит одну или несколько координационных молекул воды для эффективного переноса на клеточные мембраны. Металл выбирается из группы, состоящей из металлов "f" "d" и "p", более предпочтительно Cs, Mg, Ca, In, Se, Te, Fe(II), Fe(III), Co(II), Co(III), Mn(II), Cu, Ni и Zn. Лиганд выбирается из аминокислот, олигопептидов, белков, углеводов, пуринов, пиримидинов, нуклеозидов, нуклеотидов, олигонуклеотидов, нуклеиновых кислот, липидов, карбоновых кислот, оксикислот, антибиотиков, гормонов, коферментов, витаминов и кофакторов.

В некоторых примерах осуществления изобретения аквахелаты используются в виде водных растворов с концентрацией 10^-2 - 10^-6 г/л по отношению к металлу, которому обычно отдается предпочтение. В некоторых случаях используются растворы, в которых хранятся или выращиваются клетки. В других случаях растворы выбираются из мазей, кремов, шампуней, средств ухода за волосами, глазных капель, ушных капель, эликсиров, жидкостей для полоскания рта, зубных паст, губной помады, дезодорантов, пищевых продуктов, носовых растворов, суппозиторий, кожных мазей и инъекционных растворов. В других примерах осуществления изобретения возможно использование аквахелатов в виде порошка с лабильными (координационными) молекулами воды или без лабильных (координационных) молекул воды.

Согласно другому примеру осуществления данного изобретения аквахелат, включающий биогенный металл, как минимум одну лабильную молекулу воды и как минимум один полимер нуклеиновой кислоты, такой как ДНК или РНК, используется для переноса полимера нуклеиновой кислоты на клеточную мембрану.

Согласно еще одному примеру осуществления данного изобретения используется метод приготовления аквахелата смешанного лиганда, который способен выполнять перенос через клеточную мембрану. Во-первых, используется раствор, который содержит катион биогенного металла, который координационно связан с молекулами воды. Катион биогенного металла взаимодействует с первым органическим лигандом, который замещает координированную молекулу воды. После этого аквахелат с одним лигандом взаимодействует со вторым органическим лигандом, который замещает следующую координированную молекулу воды.

Аквахелат создается таким образом, чтобы как минимум одна молекула воды находилась в нем.

Эти и другие преимущества и примеры осуществления изобретения станут сразу очевидными после рассмотрения подробного описания сущности изобретения, примеров и пунктов заявки, приведенных ниже.

Данное изобретение относится к использованию аквахелатов в качестве транспортных систем для эффективного переноса биогенных металлов и разнообразных органических лигандов через клеточные мембраны. После переноса через клеточную мембрану, аквахелаты в настоящем изобретении диссоциируются и выполняют определенную задачу внутри клеток, тканей, одноклеточных или многоклеточных организмов.

Соответственно аквахелаты в настоящем изобретении потенциально могут использоваться во многих областях, включая: (1) усовершенствованное производство этанола, метанола, бутана, ацетона, бутанола, органических кислот, лекарств, витаминов, ферментов, белков, удобрении, питательных веществ растений, пива и других алкогольных напитков, таких как водка и виски, выпечки, дрожжей, молочных ферментов, молочных и других пищевых продуктов; (2) ускоренная ассимиляция витаминов и других питательных веществ, содержащихся в натуральных продуктах, и добавок к пищевым продуктам; (3) обработка сельскохозяйственных отходов, сточных вод и промышленных отходов с сопутствующим производством газа и высококачественных удобрений; (4) производство косметических средств и лосьонов, полезных для кожи; (5) здравоохранение для профилактических, терапевтических и лечебных целей, генной терапии, активизации иммунной системы, кроветворения, физиологической функции печени, желудка, нейропроцессов, процессов роста и т.д.

Хелат является соединением, образованным путем соединения иона металла с неметаллическими веществами, именуемые как лиганд. Лиганд имеет положительный или отрицательный заряд или заряжен нейтрально; возможно использование молекулы воды в качестве лиганда. Общее число связей, соединяющих металл с лигандом, рассматривается как координационное число металла. Это число обычно 4 или 6. Все лиганды являются донорами электронов; все металлы являются акцепторами электронов.

Аквахелаты в данном изобретении могут быть представлены следующей общей формулой:
Me[La_a, Lb_b, ..., Lm_m, (H₂O)_n].

В данной формуле Me обозначает хелатообразующий металл. LA, LB, ... LM обозначают различные лиганды в аквахелате.

Если аквахелаты содержат один лиганд, имеется только LA. Аналогично, если аквахелат содержит два лиганда, имеются только LA and LB и т.д.

Необходимо понимать, что a, b, ... m и n - целые числа, обозначающие число лигандов LA, LB ...LM и H₂O в аквахелате, соответственно, и a+b+... m. . . + n = z, где "z" - целое число, соответствующее координационному числу хелатообразующего металла.

Молекулы воды имеются в координационной сфере хелата для облегчения трансмембранного переноса аквахелата в клетку. Поэтому "n" всегда равно единице или большему числу. Предпочтение отдается одной или двум координационным молекулам воды. Не вдаваясь в какие-либо подробности теории переноса, считается, что лабильные молекулы воды в аквахелате быстро заменяются атомами донора, которые вырабатываются сенсорами белка, такими как рецепторы на поверхности стенки клетки, в результате чего трансмембранный перенос аквахелата в клетку осуществляется легко. Известно из электрохимической теории, что трансмембранный перенос происходит на границе разделения фаз, а энергия для переноса на мембрану вырабатывается градиентом электрического потенциала. Также считается, что часть аквахелатов не подвергается в то же время распаду в клетке. Аквахелаты, не подвергшиеся распаду, взаимодействуют с донорными атомами белков внутренней мембраны и образуют сложное координационное соединение. Если комплекс содержит металл, валентность которого может изменяться, это координационное соединение является искусственно созданной частью окислительно-восстановительной системы клетки, т.е., комплекс вовлечен в работу электронтранспортной цепи, т.е. создает дополнительные участки этой цепи.

Как отмечалось выше, аквахелаты в данном изобретении выполняют две функции: (1) аквахелаты действуют как эффективные транспортные системы для переноса разнообразных биогенных металлов и лигандов через клеточные мембраны и (2) аквахелаты предназначены для оказания влияния на природу клетки, ткани или организма при проникновении внутрь.

В некоторых случаях аквахелаты с разнохарактерными лигандами имеют преимущество, например, по сравнению с аквахелатами с одним лигандом. Как рассматривалось выше, иногда желательно переносить два лиганда, назовем их лиганд A и лиганд B, в клетку при определенной стехиометрии (например. 1:1) вследствие кинетической связи между двумя лигандами. В случае аквахелата со смешанными лигандами с соотношением металл:лиганд A:лиганд B, равным 1:1:1, лиганд A и лиганд B автоматически переносятся на клеточную мембрану в соотношении 1:1.

При конструировании аквахелатов в данном изобретении выбирается хелатообразующий биогенный металл, который координирует молекулы воды. Среди характерных биогенных металлов, которым отдается предпочтение, выделяются металлы "f", "d" и "p", включая Cs, Mg, Ca, In, Se, Te, переходные металлы, лантаниды и актиниды. Особенно отдается предпочтение Fe(II), Fe(III), Co(II), Co(III), Mn(II), Mg, Cu, Ni и Zn. Также возможно образование аквахелатов, используя Si.

В качестве примера при выборе магния нужно учитывать тот факт, что магний активизирует такие жизненно важные ферменты, как фосфатаза, энолаза, пептидаза, карбоксилаза, лецитиназа и кетокислота. Также известно, что магний принимает участие в окислительных реакциях фосфорилирования. Далее известно, что магний играет особую роль в стабилизации двойной спирали ДНК во время транскрипции. При ферментации спирта (гликолизе) магний принимает участие в переносе фосфата.

Марганец является компонентом многих систем клеточных ферментов, включая карбоксилазы и фосфатазы. Марганец находится в бактериальной дисмутазе супероксида. Он является кофактором некоторых ферментов, например: карбоксикиназа пирувита фосфофенола, фосфотрансфераза, аргиназа и фосфоглюкомутаза цитратсинтаза. Марганец также стимулирует активность дипептитазы и аргиназы и способствует ассоциации субчастиц рибосомы при синтезе белка.

Известно, что как магний, так и марганец активизируют ферменты, зависящие от тиамина.

Цинк играет значительную роль в биохимической активности микроорганизмов. Цинк является активатором для фотофатаз, энолаз, полипептидаз, дегидрогеназ и имеется в дегидрогеназах спирта, щелочной фосфатазе, полимеразах РНК и ДНК.

Многие металлы имеют различные степени окисления. Если такие металлы имеют - более высокую степень окисления, такие металлы могут быть восстановлены в клетке одновременно с выделением молекулярного кислорода, повышая дыхание клетки.

Таким образом, биогенные металлы ассоциируются с широким спектром физиологических эффектов в организмах, включая метаболизм углевода, азота и фосфора и многими окислительно-восстановительными реакциями. Поэтому выбор определенного метала зависит от конкретного желаемого результата.

Также необходимо выбирать лиганд или лиганды, которые используются для образования аквахелата. Выбор определенного лиганда также зависит от желаемого результата или функции хелата внутри клетки.

Возможно использование широкого диапазона биологических молекул в качестве лигандов в сочетании с биогенным металлом. К таким биологическим молекулам относятся: (1) аминокислоты, олигопептиды, полипептиды; (2) углеводы; (3) пурины, пиримидины, нуклеозиды, нуклеотиды, нуклеиновые кислоты; (4) липиды; (5) органические кислоты, гормоны, коферменты, витамины, кофакторы и другие небольшие биологические молекулы; (6) производные и предшественники вышеуказанных; (7) биологически активные ионы, такие как фосфат.

Для многих других областей применения предпочтение отдается витаминам, фосфатам, аминокислотам, органическим кислотам, угольным кислотам, пуринам и их производным, и пиримидинам и их производным, причем предпочтительными лигандными парами являются витамин:аминокислота, витамин:фосфат и цитрат:аминокислота.

Преимущественно используются следующие аминокислоты: триптофан, глицин, аланин, метионин, гистидин, цистеин, цистин, аспаргиновая и глутаминовая кислоты и т.д.

Среди олигопептидов и полипептидов, которые пригодны для осуществления данного изобретения, выделяются простые и конъюгированные белки, как глобулярные, так и фибриллярные белки, включая ферменты, многие гормоны, цитохромы, антитела, структурные и накопительные белки.

Углеводы, пригодные для осуществления данного изобретения, включают сахариды (такие как глюкоза, сахароза, рибоза и дезоксирибоза) и полисахариды (такие как крахмал, гликоген и клетчатка).

Среди липидов, которые пригодны для осуществления данного изобретения, выделяются стероиды, терпины, глицериды, гликолипиды, фосфолипиды, воск, сфинголипиды, липопротеиды и липополисахариды.

Витамины включают жирорастворимые витамины (такие как витамин D, витамин E, витамин K и α-,β-каротин), а также водорастворимые витамины (такие как тиамин, пирофосфат тиамина, рибофлавин, никотиновая кислота (ниацин), пантотеновая кислота, витамин B₆, инозит, биотин, холин, парааминобензойная кислота, фолиевая кислота, витамин B₁₂ и аскорбиновая кислота).

Гормоны, которые пригодны для осуществления данного изобретения, включают производные фенола (такие как эпинефрин, норэпинефрин, тироксин и трииодотиронин), гормоны белка (включая некоторые гормоны передней доли гипофиза), гормоны пептида (такие как инсулин, глюкагон, АКТГ, вазопрессин, окситоцин и секретин) и стероиды (включая эстроген, андроген, прогестерон и кортакоид).

Коферменты, которые пригодны для осуществления данного изобретения, включают нуклеотиды пиридина, пирофосфат тиамина, мононуклеотиды флавина, гемин, фосфаты уридина, фосфорилированные производные адениловой кислоты, кофермент A и биотин.

Предпочтительными органическими кислотами являются карбоновые кислоты, их соли и их сложные эфиры. К органическим кислотам, представляющим интерес, относятся аминокислоты, такие как указанные выше, карбоновые кислоты, такие как циз-аконитиновая кислота, янтарная кислота и фумаровая кислота, кетокислоты, такие как щавелевоуксусная кислота и α -кетоглутаровая кислота, и оксикислоты, такие как лимонная кислота, изолимонная кислота и яблочная кислота.

К предпочтительным пуринам относятся аденин и гуанин: к предпочтительным пиримидинам относятся цитозин, тимин и урацил. Среди нуклеотидов предпочтение отдается тем, которые соответствуют аденину, гуанину, цитозину, тимину и урацилу. Среди нуклеозидов предпочтение отдается также тем, которые соответствуют аденину, гуанину, цитозину, тимину и урацилу, такие как АТФ, АДФ, АМФ и т.д.

Согласно одному из примеров осуществления данного изобретения один или несколько полимеров нуклеиновой кислоты, предпочтительно ДНК или РНК, используются как органические лиганды. В этом примере лиганды являются однородными или смешанными. Так как аквахелаты в данном изобретении являются эффективными системами переноса лигандов, таких как полимеры нуклеиновой кислоты, через клеточные мембраны, они являются альтернативой известным методам переноса полимера нуклеиновой кислоты, включая перенос ретровирусных-промежуточных ген, электропорацию, промежуточную трансфекцию фосфата кальция, микроинъекцию и т.д. В результате аквахелаты в настоящем изобретении используются в широком диапазоне применения, включая генную терапию в многоклеточных организмах и т.д. Дополнительное рассмотрение использования эмбриональных клеток человека, в которые перенесены полимеры нуклеиновой кислоты для генной терапии, может быть найдено, например, в патенте США N 5399346, выданном В.Френч Андерсону и другим, на который дается подробная ссылка.

Согласно другому примеру осуществления изобретения один или несколько фармацевтически активных ингредиентов используются в качестве органических лигандов. Лиганды могут быть однородными или смешанными. К репрезентативным активным ингредиентам относятся антацидные средства, противовоспалительные средства, коронарные дилататоры, церебральные дилататоры, периферийные вазодилататоры, противоинфекционные средства, психотропные средства, противоманиакальные средства, стимуляторы, противогистамины, слабительные средства, противоотечные средства, витамины, желудочно-кишечные седативные средства, препараты против поноса, противоангинозные лекарственные средства, вазодилататоры, средства против аритмии, противогипертензивные лекарственные средства, вазоконстрикторы и средства от мигрени, противокоагулянты и лекарственные средства против тромбоза, аналгезирующие средства, противогипертермические средства, гипнотические средства, седативы, противорвотные средства, противотошнотные средства, противосудорожные средства, нервно-мышечные лекарственные средства, гипергликемийные и гипогликемийные средства, препараты щитовидной железы, мочегонные средства, средства против спазм, маточные миорелаксанты, лекарственные средства против ожирения, анаболические лекарственные средства, эритропоэтинные лекарственные средства, противоастматические средства, бронхолитические средства, отхаркивающие средства, средства от кашля, миколитические и противоурикемийные лекарственные средства. Конкретные примеры таких ингредиентов можно найти в патенте США N 4952402, на который дается подробная ссылка.

Отдается предпочтение обычным фармацевтическим средствам, включая те средства, которые пригодны для приема внутрь, ректального введения, введения через нос, местного введения (включая щечное и подъязычное введение), вагинального или парентерального введения (включая подкожное, внутримышечное, внутривенное, внутрикожное, внутриоболочечное и эпидуральное введение). Лекарственные средства включают стандартные лекарственные формы, которые приготавливаются любым из методов, хорошо известных в фармацевтическом деле. Согласно таким методам активный ингредиент и аквахелат соединяются с помощью носителя, который представляет собой один или несколько вспомогательных ингредиентов. Обычно лекарственные формы приготавливаются путем равномерного и непосредственного соединения активного ингредиента и аквахелата с помощью жидкого носителя или мелко раздробленного твердого носителя или того и другого.

Лекарственные формы данного изобретения, которые пригодны для приема внутрь, включают дискретные единицы, такие как капсулы, облатки и таблетки, порошки и гранулы, растворы и суспензии в водной жидкости или не в водной жидкости, и шарики, лекарственные кашки и пасты. Для местного введения в качестве лекарственных форм применяются мази и кремы. Лекарственные формы, пригодные для местного введения в глаз, включают глазные капли. Лекарственные формы, пригодные для местного введения в рот, включают таблетки, пастилки и жидкости для полоскания рта. Лекарственные формы для ректального введения включают суппозитории. Лекарственные формы, пригодные для введения через нос, включают порошки, которые вводятся посредством быстрого вдыхания через носовой ход, носовые растворы и капли в нос. Лекарственные формы, пригодные для вагинального введения, включают маточные кольца, тампоны, кремы, гели, пасты, губки и аэрозоли.

Лекарственные формы, пригодные для парентерального введения, включают водные и неводные стерильные инъекционные растворы и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие средства и загустители. Для лекарственных форм используются упаковки для одного приема и упаковки для многократного приема, например герметичные ампулы и пузырьки. Возможно хранение лекарственных форм в сухом месте, при этом требуется только добавить стерильный жидкий носитель, например воду для инъекции, непосредственно перед использованием лекарственной формы. Возможно приготовление растворов и суспензий для немедленного приема из стерильных порошков, гранул и таблеток, которые рассматривались выше. Особое предпочтение отдается лекарственным формам для внутримышечного введения.

Дополнительная информация о лекарственных формах может быть найдена, например, в патенте США N 5079252, на который дается подробная ссылка.

Биологические молекулы, используемые в качестве лигандов, включают такие молекулы, которые оказывают физиологический эффект (т.е. молекулы, которые играют роль в регулировании химических реакций, но которые не являются питательной средой для таких реакций), и такие молекулы, которые участвуют в биохимических реакциях (т.е. молекулы, которые в действительности изменяются в результате таких химических реакций). К лигандам, которые оказывают физиологический эффект, относятся в основном витамины, аминокислоты, фосфаты и азот и углеродосодержащие лиганды. К лигандам, которые участвуют в биохимических реакциях, относятся в основном промежуточные метаболиты, такие как органические кислоты и другие биохимические питательные среды.

На практике можно выбирать органические лиганды в зависимости от их способности увеличивать биохимическую активность биогенного металла. Смешанные лиганды, обладающие синергитическим эффектом, выбираются таким образом, чтобы один лиганд усиливал действие другого лиганда или других лигандов. Таким образом, выбор лигандов желательно осуществлять с учетом функций компонента аквахелата в метаболизме клеток. При выборе лигандов желательно также учитывать их катаболические пути.

Принимая во внимание вышесказанное, можно использовать аквахелаты в настоящем изобретении для активизации или торможения определенных метаболических процессов, в результате которых усиливается биосинтез, увеличивается биомасса, снижается выход ненужных продуктов, сокращаются расходы по выпуску и очистке многочисленных продуктов и т.д.

Следовательно, в примере осуществления данного изобретения используются биогенный металл, лиганд, который оказывает физиологический эффект (например, витамин или провитамин), и лиганд, который участвует во многих биохимических реакциях в клетке (например, промежуточный метаболит, такой как органическая кислота). Поэтому можно выбирать органические лиганды для усиления эффекта ферментов, зависимых от витамина, промежуточного метаболита и металла по желаемым метаболическим путям в клетке. Можно соединять лиганды с одними и теми же или различными металлами.

Например, пантотеновая кислота и цистеин являются предшественниками для синтеза кофактора А а клетке и усиливают этот синтез. Другой пример - аквахелат пирофосфата тиамина магния способствует действию трифосфата аденозина (АТФ). Пирофосфат тиамина является предшественником для биосинтеза декарбоксилаз, трансамидаз и транскетолаз.

Лиганды аминокислоты становятся биологически активными веществами в клетке. Лиганд метионина делает возможным получить цистеин и цистин, имеющие реактивные сульфгидриловые группы. Такие биологически активные соединения как глутатион, тиамин и некоторые ферменты образуются из серы, содержащей аминокислоты. Лиганды триптофана трансформируются в никотиновую кислоту (витамин PP) и другие биохимически активные соединения.

Также можно выбирать металлы и органические лиганды в зависимости от их способности препятствовать или блокировать реакции, в результате которых образуются нежелательные побочные продукты.

Также необходимо отметить, что регуляция метаболизма клеток часто зависит от времени. Можно добавлять настоящие аквахелаты в разное время в течение жизненного цикла клетки для достижения намеченных результатов. Поэтому данный биологический процесс может потребовать группирования одного или нескольких инициаторов аквахелата при возникновении различных аквахелатных групп по мере протекания процесса.

В табл.1 приведены примеры аквахелатов данного изобретения.

Возможен перенос аквахелатов настоящего изобретения на любую клетку, ткань или одноклеточный организм или многоклеточный организм. Например, можно добавлять аквахелаты настоящего изобретения в растворы, в которых хранятся или выращиваются клетки или ткани. В случае многоклеточных организмов, особенно млекопитающих, можно приготавливать соединения аквахелатов в виде пищевых продуктов, напитков, мазей, кремов, шампуней, средств ухода за волосами, глазных капель, ушных капель, жидкостей для полоскания рта, зубных паст, губной помады, дезодорантов, носовых растворов и аэрозолей, суппозиторий, кожных мазей, инъекционных растворов и т.д.

Одной из основных областей применения аквахелатов настоящего изобретения являются процессы ферментации. Во многих областях применения, включая ферментацию, аквахелаты выбираются для стимулирования или препятствования метаболических процессов для того, чтобы выполнить одну или несколько задач: сократить потребление питательных веществ, увеличить производство желаемых продуктов, сократить время обработки, не допустить образования нежелательных побочных продуктов и улучшить качество целевых продуктов или жизнеспособность клетки. Хотя процессы ферментации предоставляют большую возможность для использования преимуществ данного изобретения, как отмечалось выше, данное изобретение не ограничивается процессами ферментации и оно пригодно для использования в метаболическом регулировании всех одноклеточных и многоклеточных организмов.

Большинство аэробных и анаэробных ферментаций происходит в стерильных условиях. Оборудование и питательная среда стерилизуются для недопущения активизации или уничтожения периферических микроорганизмов. Многие аквахелаты данного изобретения, включая аквахелаты, указанные в табл.1, стабильны и возможно их добавление в питательный раствор до стерилизации или пастеризации. После охлаждения в стерилизованную питательную среду добавляется необходимый посевной материал. Для получения оптимальных условий обычно необходимо регулировать температуру, pH и иногда давление ферментера в пределах довольно узкого диапазона. При аэробном брожении стерильный воздух должен непрерывно подаваться в течение цикла ферментации. При прекращении микробного действия необходимо отделить продукты от использованной питательной среды. Больший выход целевых продуктов и меньший выход побочных продуктов, которые становятся возможными благодаря данному изобретению, обеспечивают снижение себестоимости единицы очищенной продукции.

Соединения аквахелатов в данном изобретении обычно приготавливаются следующим образом. Во-первых, выбирается соль хелатообразующего биогенного металла, который взаимодействует с водой. В большинстве случаев используется любая соль легко растворимого биогенного металла. Предпочтительными солями являются хлорид, нитрат, фосфат и сульфатные соли. Соль растворяется в воде. Растворимость зависит от нескольких параметров, включая растворимость соли, pH и температуру. Следовательно, растворение зависит от относительной пропорции соли и воды, водородного показателя и температуры растворения. Для ускорения процесса растворения можно применять размешивание.

После этого заранее определенное количество выбранного органического лиганда (количество которого тщательно проверяется для регулирования стехиометрии между лигандом и металлом) добавляется в раствор непосредственно или после отдельного растворения этого количества лиганда. Стехиометрия между металлом и лигандом изменяется в зависимости от обстоятельств. Например, можно устанавливать соотношения металла к лиганду, равные 1:0,5; 1:1; 1:1,5; 1:2 и т.д.

Желательно предварительно растворить лиганд, так как это обеспечивает лучшее регулирование образования аквахелатов. В этом случае раствор лиганда медленно переливается в раствор металла при легком его перемешивании. Перемешивание длится до тех пор, пока не будет получен однородный раствор соединения аквахелата. Этот процесс обычно выполняется при комнатной температуре и требует немного времени для его выполнения.

После этого таким же образом можно добавлять лиганды. После образования аквахелатов настоящего изобретения в растворе часть воды или вся вода может быть удалена из раствора. Например, можно удалить только часть воды для увеличения концентрации аквахелатов в растворе. Вода затем удаляется до тех пор, пока аквахелат не примет форму сухого порошка, который сохраняет лабильную воду, ассоциируемую с аквахелатом. При желании можно далее обезвоживать аквахелат для удаления лабильной воды, при этом лабильная вода восстанавливается, например, путем растворения в воде.

Пример 1 (сравнительный). В данном примере используется продуцент бамбермицинов (флавомицина) Streptomyces bambergiensis 16, получаемый путем отбора культуры для ускоренного биосинтеза данного антибиотика. Культура выращивается в среде, имеющей следующий состав, г/л: мука культурной сои 3,0; меласса 3,0; сульфат аммония 1,75; хлорид натрия 2,0; дио-ортофосфат калия 1,0; хлористый калий 0,0016; остаток вода, pH 7,5-7,0. Культура выращивается в колбах емкостью 750 мл при круговом перемешивании со скоростью 220-230 об/мин и при температуре 30 ± 1^oC в течение 169 ч. В результате культивирования в данной питательной среде активность флавомицина составляет 610 ед./мл.

Пример 2. Флавомицин получают так же, как в примере 1. Однако используется аквахелат кобальта. Аквахелатом является кобальт (II): пантотеновая кислота: глицин. Аквахелат кобальта (II) добавляется в среду в виде раствора для получения конечной концентрации 2,2•10^-6 г/л (в случае пантотеновой кислоты). После культивирования активность флавомицина составляет 900 ед./мл, увеличиваясь на 40% по сравнению с примером 1.

Пример 3 (сравнительный). Используется продуцент витамина B₂ (рибофлавин), Ereemothecium ashbyi 19, получаемый путем отбора для ускоренного биосинтеза этого витамина. Культура выращивается при температуре 29 ± 1^oC в течение 72 ч в среде, имеющей следующий состав, г/л: мука культурной сои 25; кукурузный экстракт (сухой) 15; патока 15; сахар 5; мел 0,5; хлорид натрия 1,0; сульфат магния 0,7; остаток вода, pH 6,7-7,0. Содержание рибофлавина в среде в конце роста составляет 1340 мг/л.

Пример 4. Витамин B₂ получают так же, как в примере 3. Однако в отличие от примера 3 аквахелат магния с пантотеновой кислотой и глицином (1:1:1) используется вместо неорганической соли магния. При концентрации аквахелата магния в среде, равной 2,2•10^-6, содержание витамина B₂ в жидкости культуры увеличилось до 1782 мг/л, что привело к увеличению выхода витамина B₂ на 33% по сравнению с примером 3.

Пример 5. Альфу-амилазу получают с помощью Bacillus stearothermophilus. В двенадцать колб Эрленмайера емкостью 300 мл каждая, 75 мл среды содержится в каждой колбе, вносится 1 мг приготовленной накануне вечером культуры, которая затем выращивается при температуре 50^oC, 250 об/мин в течение 3 дней. Содержимое колб далее перемешивают на центрифуге, а надосадочную жидкость замораживают при температуре -20^oC, отделяя ее от экстракта. Из надосадочной жидкости берется проба для определения общего количества белка и общего количества единиц активности фермента.

Результаты приведены в табл.2. Согласно табл. 2 колба A - контроль; в колбу B после стерилизации среды добавляется аквахелат (стерильный); в колбе C аквахелат совместно со средой подвергается автоклавной обработке; в колбе D, в среду добавляется водный раствор всех компонентов аквахелатов, после чего среда подвергается автоклавной обработке.

Концентрации среды следующие: 10 г/л Малтрин-М-040, 5 г/л Дифко Триптон, 5 г/л Экстракт Дрожжи Дифко, 2 г/л (NH₄)₂SO₄, 3,4 г/л K₂HPO₄, 1,1 г/л KH₂PO₄.

Для колб B и C аквахелаты добавляются в среду в четырех отдельных растворах, количества соответствуют тем количествам, которые используются в 1 л среды.

Раствор 1.

Растворите 0,25 г MgSO₄•7H₂O + 0,41 г витамина B₁ + 0,14 г лейцина в воде. Растворите 0,25 г MgSO₄•7H₂O + 0,2 г витамина B₆ + 0.1 г глицина в воде. Перемешайте.

Раствор 2.

Растворите 0,05 г MnSO₄•5H₂O + 0,057 г пантотеновой кислоты + 0,018 г цистеина в воде.

Раствор 3.

Растворите 0,011 г CuSO₄•5H₂O в воде и добавьте раствор, содержащий 0,0036 г ниацина, непрерывно перемешивая.

Раствор 4.

Растворите 0,006 г CoSO₄•7H₂O в воде и добавьте раствор, содержащий 0,0054 г гистидина, непрерывно перемешивая.

Пример 6. Протеазу получают, используя Bacillus subtilus путем ферментации как без применения аквахелата, так и с применением аквахелата. Серии опытов называются "регуляция" и "хелат". Результаты внесены в колонки: нормализованные титры (НТ), продуктивность (П) и скорость синтеза продукта (С), где НТ = (активность фермента во взятой пробе)/(стандартная активность при ферментации), П=НТ/(общее астрономическое время ферментации) в каждой точке и С= (разница НТ)/(разница астрономического времени ферментации) в каждой точке.

Как следует из табл.3, аквахелат повышает нормализованный титр в каждой временной точке на 140%. Кроме того, аквахелат увеличивает производительность в среднем на 138% в течение всего процесса ферментации. Наконец, аквахелат увеличивает скорость синтеза продукта на 138% между 16 и 32 ч астрономического времени ферментации.

Изобретение позволяет регулировать процессы метаболизма, протекающие в культуре тканей и организмов. Аквахелат представляет собой комплексное соединение биогенного металла с органическими лигандами и как минимум одной координационной молекулой воды. Аквахелат может быть использован как транспортная система для переноса биогенного металла и органических лигандов на клеточную мембрану. 4 с. и 34 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Аквахелат, содержащий металл со смешанными лигандами, отличающийся тем, что он дополнительно содержит лабильную молекулу воды и биологически активный металл при использовании как минимум первого и второго лигандов, причем лиганды и биологически активный металл использованы в соотношении, обеспечивающем влияние на метаболический процесс. 2. Аквахелат по п.1, отличающийся тем, что биологически активный металл выбран из группы металлов с внешними s, p, d и f электронами. 3. Аквахелат по п.2, отличающийся тем, что биологический активный металл выбран из переходных металлов, лаптаноидов и актиноидов. 4. Аквахелат по п.2, отличающийся тем, что биологически активный металл выбран из группы, содержащей цезий, магний, индий, селен, теллур, железо, кобальт, марганец, медь, никель и цинк. 5. Аквахелат по п.1, отличающийся тем, что использованные в аквахелате биологически активный металл и первый органический лиганд выбраны таким образом, что они оказывают физиологический эффект, а второй органический лиганд является промежуточным метаболитом. 6. Аквахелат по п. 5, отличающийся тем, что металл выбран из группы, содержащей магний, марганец и цинк, первый органический лиганд выбран из группы, содержащей водорастворимые витамины и провитамины, а второй органический лиганд является органической кислотой, выбранной из группы, содержащей карбоновые кислоты, оксикислоты и аминокислоты. 7. Аквахелат по п.6, отличающийся тем, что в качестве оксикислоты использована лимонная кислота, а аминокислота выбрана из группы, содержащей триптофан, глицин, аланин, аспаргиновую кислоту, глютаминовую кислоту, гистидин и цистин. 8. Аквахелат по п.6, отличающийся тем, что витамин или провитамин выбраны из группы, содержащей парааминобензойную кислоту, никотиновую кислоту, пантотеновую кислоту, биоцин, пирофосфат тиамина, витамин B₄, фолиевую кислоту и рибофлавин. 9. Аквахелат по п.1, отличающийся тем, что биологически активный металл выбран из группы, содержащей металлы с внешними s, p, d и f электронами, а первый и второй лиганды выбраны из группы, содержащей фосфат, аминокислоты, олигопептиды, белки, пурины, пиримидины, нуклеозиды, нуклеотиды, олигонуклеотиды, нуклеиновые кислоты, липиды, карбоновые кислоты, оксикислоты, антибиотики, гормоны, коферменты, витамины и кофакторы. 10. Способ получения аквахелата, включающий смешение раствора, содержащего ион металла, с растворами, содержащими первый и второй лиганды, отличающийся тем, что ион металла в растворе координационно связан с молекулами воды, не менее одной из которых остается в составе аквалехата после смешения с растворами лигандов, причем в качестве лигандов и иона металла выбирают те, которые в составе аквахелата способны оказывать влияние на метаболические процессы. 11. Способ по п.10, отличающийся тем, что лиганды растворяют в воде до взаимодействия с ионом биологически активного металла. 12. Способ по п.10, отличающийся тем, что после образования аквахелата воду из раствора удаляют. 13. Способ по п.15, отличающийся тем, что первый органический лиганд выбирают таким образом, чтобы он оказывал физиологический эффект, а второй лиганд выбирают таким образом, чтобы он был продуктом промежуточного метаболизма. 14. Способ по п.10, отличающийся тем, что металл выбирают из группы, содержащей металлы с внешними s, p, d и f электронами, а первый и второй лиганды выбраны из группы, содержащей аминокислоты, олигопептиды, белки, углеводы, пурины, пиримидины, нуклеозиды, нуклеотиды, олигонуклиотиды, карбоновые кислоты, оксикислоты, антибиотики, коферменты, гормоны, витамины и кофакторы. 15. Способ модулирования характеристики культуры клеток, культуры ткани, одноклеточного организма или многоклеточного организма, характеризуемый образованием водного раствора аквахелата со смешанными лигандами, содержащего биогенный металл и как минимум одну молекулу лабильной воды и как минимум первый и второй органические лиганды, выбранные таким образом, чтобы оказывать влияние на процессы метаболизма, и взаимодействием образованного раствора с культурой клеток, культурой ткани, одноклеточным организмом или многоклеточным организмом. 16. Способ по п.15, отличающийся тем, что в качестве раствора используют мази, кремы, шампуни, средства для укладки волос, глазные капли, ушные капли, эликсиры, жидкости для полоскания рта, губные помады, дезодоранты, пищевые продукты, растворы для приема через нос, сусппозитарий, кожные мази и инъекционные растворы. 17. Способ по п.15, отличающийся тем, что в качестве раствора используют раствор для выращивания клеток. 18. Способ по п. 15, отличающийся тем, что металл выбирают из группы, содержащей металлы с внешними s, p, d и f электронами. 19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что металл выбирают из группы, содержащей переходные металлы, лаптаноиды и актиноиды. 20. Способ по п. 18, отличающийся тем, что металл выбирают из группы, содержащей цезий, магний, кальций, индий, селен, теллур, железо, кобальт, марганец, медь, никель и цинк. 21. Способ по п.15, отличающийся тем, что металл и первый органический лиганд выбирают таким образом, чтобы они оказывали физиологический эффект, а второй органический лиганд выбирают таким образом, чтобы он был продуктом промежуточного метаболизма. 22. Способ по п. 21, отличающийся тем, что металл выбирают из группы, содержащей магний, марганец и цинк, первый органический лиганд выбирают из группы, содержащей водорастворимые витамины и провитамины, а в качестве второго органического лиганда используют органическую кислоту, выбранную из группы, содержащей карбоновую кислоту, оксикислоту и аминокислоту. 23. Способ по п. 22, отличающийся тем, что в качестве оксикислоты используют лимонную кислоту, а в качестве аминокислоты используют триптофан, глицин, аланин, метионин, цистин, аспаргиновую и глютаминовую кислоты. 24. Способ по п.22, отличающийся тем, что в качестве витамина или провитамина используют парааминобензойную кислоту, никотиновую кислоту, пантотеновую кислоту, биотин, пирофосфат тиамина, витамин B₆, фолиевую кислоту и рибофлавин. 25. Способ по п. 15, отличающийся тем, что металл выбирают из группы, содержащей металлы с внешними s, p, d и f электронами, а первый и второй лиганды выбирают из группы, содержащей аминокислоты, олигопептиды, белки, углеводы, пурины, пиримидины, нуклеозиды, нуклеотиды, олигонуклеотиды, нуклеиновые кислоты, карбоновые кислоты, оксикислоты, антибиотики, коферменты, гормоны, витамины и кофакторы. 26. Способ по п.15, отличающийся тем, что концентрация аквахелата в растворе составляет 0,001 - 0,000001 г/л относительно металла. 27. Транспортная система для переноса металла и органических лигандов на клеточную мембрану, содержащая водный раствор аквахелата со смешанными лигандами, включающего биогенный металл, как минимум одну лабильную молекулу воды и как минимум первый и второй органические лиганды, причем металл и лиганды выбраны таким образом и в соотношении, обеспечивающем влияние на метаболический процесс. 28. Система по п.27,, отличающаяся тем, что раствор выбран из группы, содержащей мази, кремы, шампуни, средства для укладки волос, глазные капли, ушные капли, эликсиры, жидкости для полоскания рта, зубные пасты, губную помаду, дезодоранты, пищевые продукты, растворы для приема через нос, суспозитарий, кожные мази и инъекционные растворы. 29. Система по п.27, отличающаяся тем, что использован раствор для выращивания клеток. 30. Система по п.27, отличающаяся тем, что использованный первый лиганд оказывает филиологический эффект, а второй лиганд является промежуточным метаболитом. 31. Система по п.27, отличающаяся тем, что использован металл, на внешней оболочке которого находятся s, p, d и f электроны. 32. Система по п. 31, отличающаяся тем, что металл выбран из группы, содержащей переходные металлы, лаптаноиды и актиноиды. 33. Система по п. 31, отличающаяся тем, что металл выбран из группы, содержащей цезий, магний, калий, индий, селен, теллур, железо, кобальт, марганец, медь, никель и цинк. 34. Система по п. 27, отличающаяся тем, что металл выбран из группы, содержащей магний, марганец и цинк, первый органический лиганд выбран из группы, содержащей водорастворимые витамины и провитамины, а второй органический лиганд представлен органической кислотой, в качестве которой использованы карбоновая кислота, оксикислота и аминокислота. 35. Система по п.34, отличающаяся тем, что в качестве оксикислоты использована лимонная кислота, а аминокислота выбрана из группы, содержащей триптофан, глицин, аланин, метионин, цистеин, аспаргиновую и глютаминовую кислоты. 36. Система по п.34, отличающаяся тем, что витамин или провитамин выбран из группы, содержащей парааминобензойную кислоту, никотиновую кислоту, пантотеновую кислоту, биотин, пирофосфат тиамина, витамин B₆, фолиевую кислоту и рибофлавин. 37. Система по п. 27, отличающаяся тем, что металл выбран из группы, содержащей металлы с внешними s, p, d и f электронами, а первый и второй лиганды выбраны из группы, содержащей аминокислоты, олигопептиды, белки, углеводы, пурины, пиримидины, нуклеозиды, нуклеотиды, олигонуклеотиды, нуклеионовые кислоты, карбоновые кислоты, оксикислоты, антибиотики, коферменты, гормоны, витамины и кофакторы. 38. Система по п. 27, отличающаяся тем, что концентрация аквахелата в растворе составляет 0,001 - 0,000001 г/л по отношению к металлу.